Мәкалә
G6PD лаборатория тестларында метилен зәңгәресе: буягыч чынлыкта нәрсә эшли
Студент инкубациядән соң ике пробирканы күзәтә. Берсенең төсе көтелгәнчә үзгәргән. Икенчесенеке үзгәрмәгән. Студент икенче пациентта глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа җитешсезлеге бар дигән нәтиҗәгә килә. Бу нәтиҗә дөрес булырга мөмкин, ләкин фикер йөртүдә тестның эшләвен тәэмин итүче төп төшенчә читтә кала. Пробиркада фермент үзе турыдан-туры үлчәнми. Метилен зәңгәресен арадашчы итеп кулланып, фермент җитештергән продукт үлчәнә.
Бу турыдан-туры булмаган бәйләнеш аңлашылгач, процедура да, контрольләр дә, ялгыш нәтиҗәләрнең озын исемлеге дә очраклы булып күренми башлый.
Кыска җавап
G6PD тестларында метилен зәңгәресе — редокс-индикатор. G6PD ферменты NADPH барлыкка китерә, ә NADPH-ка бәйле системалар зәңгәр метилен зәңгәресен төссез лейкоформасына кайтаралар (яки аны электроннарны күчерү өчен кулланалар). Ферментның нормаль активлыгы нәтиҗәле кайтарылуны тәэмин итә. Җитешсез активлык булганда кайтарылу акрын яки тулы булмаган рәвештә бара. Тест сигналы шуннан гыйбарәт.
Ике тарихи ысулда бер үк буягыч кулланыла, ләкин аларның ахыргы күрсәткечләре аерыла. Аларны бер-берсеннән аерып караганда, аңлашылмаучылыкларның күбесе юкка чыга.
Ике тест, бер буягыч, төрле ахыргы күрсәткечләр
Беренчесе — Сасс һәм хезмәттәшләре тасвирлаган, соңрак Гиббс бәяләгән метилен зәңгәресен турыдан-туры кайтару тесты. Монда ахыргы күрсәткеч — буягычның үзе: оксидлашкан зәңгәр метилен зәңгәресе төссез лейкометилен зәңгәресенә кадәр кайтарыла, һәм бу үзгәрешнең тизлеге NADPH барлыкка китерү сәләтен чагылдыра. Скрининг турында беренчел мәкалә PubMed базасында Сасс һәм хезмәттәшләре (1966) исеме астында индексацияләнгән.
Икенчесе — Брюэрның метгемоглобинны кайтару тесты. Башта натрий нитриты гемоглобинны көрән метгемоглобинга кадәр оксидлаштыра. Аннары метилен зәңгәресе электроннар күчерү арадашчысы булып эшли: кайтарылган метилен зәңгәресе метгемоглобинга кайтару эквивалентларын тапшырып, аны яңадан кызыл гемоглобинга әйләндерә. Шуңа күрә күзгә күренгән ахыргы күрсәткеч зәңгәр белән төссезне түгел, ә көрән белән кызылны чагыштыруга нигезләнә. Оригиналь ысул Бөтендөнья сәламәтлек саклау оешмасы бюллетенендә (Брюэр һәм хезмәттәшләре, 1960) басылган.
Брюэр анализын буягычны төссезләндерү тесты дип атау химик яктан төгәл түгел. Буягыч цикл буенча үзгәрә; төсне исә гемоглобин үзгәртә. Түбәндәге схемада ике юл да күрсәтелгән.
Нигездә яткан реакция
G6PD пентозофосфат юлының беренче оксидлашу адымын катализлый:
Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+
Җитлеккән эритроцитлар NADPH алу өчен күбесенчә шушы юлга таяналар; бу Blood журналында Луццатто һәм хезмәттәшләренең күзәтү мәкаләсендә (2020) карала. NADPH глутатионны кайтарылган хәлдә тота һәм күзәнәкне оксидлашудан килгән зарардан саклый. Метилен зәңгәресе бу системага электроннар акцепторы буларак кушыла. G6PD җитәрлек булганда NADPH та җитәрлек барлыкка килә, бу исә нәтиҗәле кайтарылуны тәэмин итә. G6PD дәрәҗәсе түбән булса, чылбыр беренче буынында ук өзелә.
Буягычны двигатель түгел, ә ягулык дәрәҗәсен күрсәткеч дип күз алдына китерегез. Ул NADPH белән тәэмин ителеш турында хәбәр итә. Бу тәэмин ителешне яки нәтиҗәне укуны үзгәртә торган башка теләсә нинди фактор, генда бернинди үзгәреш булмаса да, күрсәткечне күчерә ала.
Брюэр тибындагы процедура ничек үткәрелә
Реагентлар рецептлары дистә еллар дәвамында үзгәргән, шуңа күрә укыту максатындагы тасвирламаны клиник протокол дип кабул итәргә ярамый. Һәр лаборатория үзенең расланган стандарт эш процедурасын үти. Бу искәрмәне исәпкә алып, классик пробирка схемасы түбәндәгечә эшли; басылып чыккан әлеге куллану мисалында ул өч пробирка һәм 3 сәгатьлек инкубация белән документлаштырылган:
- Пациент пробиркасы: тулы канга глюкоза, натрий нитриты һәм метилен зәңгәресе кушыла. Нитрит метгемоглобин барлыкка китерә, глюкоза эритроцитлар метаболизмын тәэмин итә, ә буягыч NADPH-ка бәйле электрон күчерүне башкара.
- Оксидлашкан контроль: канга нитрит һәм глюкоза кушыла, ләкин метилен зәңгәресе кушылмый. Ул көрән метгемоглобинның ахыргы төсен — җитешсезлеккә хас күренешне — күрсәтә.
- Гемоглобин контроле: канга су кушыла. Ул кызыл гемоглобинның ахыргы төсен — нормаль күренешне — күрсәтә.
- Барлык пробиркаларны якынча 37 C температурада, гадәттә 3 сәгать дәвамында, сак кына болгатып инкубацияләгез.
- Күзәнәкләрне лизислау һәм төсләрне чагыштыруны җиңеләйтү өчен, һәр пробиркадан кечкенә аликвотаны дистилляцияләнгән суда сыегайтыгыз.
- Пациент пробиркасын ике контроль белән чагыштырыгыз. Төснең яңадан кызылга таба үзгәрүе шактый зур кайтару сәләтен күрсәтә. Көрән төснең саклануы сизелерлек җитешсезлек булуын фаразларга нигез бирә.
Бер тарихи составта якынча 1 mL кан һәм натрий нитриты якынча 180 mM, декстроза 280 mM, метилен зәңгәресе 0.4 mM булган реагентлар кулланылган. Бу саннарны универсаль таләп түгел, ә әдәбияттан алынган мисал дип карагыз.
Нәтиҗәне уку
| Күренеш | Брюэр тестындагы төс | Мәгънәсе |
|---|---|---|
| Нормаль | Пациент пробиркасының төсе кызыл гемоглобин контроленә якынлаша | Кайтару сәләте скрининг бусагасыннан югары |
| Җитешсезлек | Пациент пробиркасы метгемоглобин контроленә якын көрән төстә кала | Скрининг сизелерлек G6PD җитешсезлеген фаразларга нигез бирә |
| Арадаш | Төс ике контроль арасында була | Фенотип билгеләмәгез; активлыкны сан ягыннан үлчәгез |
Сыйфат скринингы нормаль активлыкның якынча 30–40 процент дәрәҗәсендә иң яхшы аера; бу Malaria Journal журналындагы G6PD җитешсезлеген ачыклаудагы бушлыкларга багышланган күзәтүдә карала. Шуңа күрә скринингның нормаль нәтиҗәсе анализның авыр җитешсезлекне ачыкламаганын аңлата. Ул активлыкның тулысынча нормаль булуын расламый.
Ни өчен скрининг ялгыш юлга кертә
Гемолиздан соңгы ретикулоцитоз — ялган нормаль нәтиҗәнең классик сәбәбе. Яшь эритроцитларда һәм ретикулоцитларда G6PD иске күзәнәкләргә караганда күбрәк була. Кискен гемолиз эпизоды вакытында иң иске, фермент җитешсезлеге иң көчле булган күзәнәкләр инде таркалган булырга мөмкин; калган яшь күзәнәкләр популяциясенең активлыгы исә тестта нормаль булып күренә. Шушы биологик үзенчәлек буягычлы скринингларны гына түгел, санлы анализларны да ялгыштыра.
Күптән түгел кан салу җитешсезлекне яшерә, чөнки донор эритроцитлары үрнәккә үз ферментларын өсти. Mayo Clinic Laboratories кан салуны ретикулоцитоз һәм лейкоцитлар комачаулавы белән беррәттән фермент анализлары нәтиҗәләренең ышанычсыз булу сәбәпләре арасында күрсәтә.
Гетерозиготалы хатын-кызлар — иң катлаулы очрак. X-хромосоманың очраклы инактивациясе нормаль һәм фермент җитешсезлеге булган эритроцитлар катнашмасын барлыкка китерә, ә гомуми активлык көчле җитешсезлектән алып тыштан нормаль булып күренгән дәрәҗәгә кадәр теләсә кайсы ноктада булырга мөмкин. Сыйфат скрининглары арадаш фенотипларны еш кына ачыкламый. Бөтендөнья сәламәтлек саклау оешмасының G6PD тестлары турындагы документларында бу чикләү җентекләп карала.
Үрнәк алынганнан соң узган вакыт, саклау температурасы, төс буенча ахыргы нәтиҗәне бәяләүнең субъективлыгы, гематокрит һәм реагентлар сыйфаты бу биологик тәэсирләргә өстәмә аналитик шау-шу өсти.
Скрининг — диагноз түгел
Җитешсезлекне күрсәткән, арадаш яки клиник мәгълүматларга туры килмәгән скрининг нәтиҗәсе G6PD ферменты активлыгын сан ягыннан үлчәүче анализ үткәрүне таләп итә. Бөтендөнья сәламәтлек саклау оешмасы температурасы контрольдә тотылган санлы спектрофотометрияне эталон ысул дип саный. Бу анализда эритроцитлар гемолизатына глюкоза-6-фосфат һәм NADP+ кушыла, ә барлыкка килгән NADPH 340 nm дулкын озынлыгында оптик тыгызлыкның артуы буенча күзәтелә. Үзгәреш тизлеге фермент активлыгына пропорциональ; гадәттә ул бер грамм гемоглобинга туры килгән берәмлекләр рәвешендә нормалаштырыла. Хәзерге клиник лаборатория практикасы Mayo тестлар каталогының G6PD активлыгына багышланган язмасында кыскача тасвирланган.
Нәтиҗәләрне аңлатканда лабораториядә расланган референс диапазон кулланыла; ул еш кына популяциядәге нормаль активлыкка карата билгеләнә. Җитешсезлек гадәттә 30 процент бусагасы тирәсендә, ә арадаш активлык аннан югары дәрәҗәдә карала. Бөтендөнья сәламәтлек саклау оешмасының G6PD тестлары өчен максатчан продукт профильләре (2022) бу диагностик нигезне билгели. Күптән түгел булган гемолиз яки кан салу фенотипны билгеләүне ышанычсыз итсә, эритроцитлар популяциясе яңадан тигезләнешкә килгәч тестны кабатларга кирәк; молекуляр тестлар ферментны үлчәүне алыштырмыйча өстәмә мәгълүмат бирә ала.
Сакларга кирәкле чик
Бу анализларда метилен зәңгәресе — ex vivo лаборатория реагенты. Бу факт метилен зәңгәресен пациентка бирүнең куркынычсызлыгы турындагы мәсьәләдән аерым каралырга тиеш; ул метилен зәңгәресенә каршы күрсәтмәләр буенча белешмәдә яктыртыла. Аларны биохимия бәйли, чөнки дару да NADPH-ка бәйле кайтарылуга таяна, ләкин пробиркадагы буягыч кан агымындагы доза түгел. Буягычның башка шартларда буяу чарасы буларак үзен ничек тотуы турында метилен зәңгәресе белән буяу принципларын карагыз; ә ул кергән химик төркем турында мәгълүмат өчен лабораториядәге редокс-буягычлар темасына мөрәҗәгать итегез.
Скрининг кайтару сәләтенең сакланган булып күренүен тикшерә. Раслаучы анализ ферментның чынлыкта күпме булуын ачыклый. Буягыч беренче сорауга яхшы җавап бирә — бары тик аннан икенчесенә җавап таләп итмәгән очракта.