Мәкалә
Зебра-данио тикшеренүләрендә метилен зәңгәре: карау өстәмәсе һәм эксперимент нәтиҗәләрен бутаучы фактор
Зебра-данио уылдыгы өчен су еш кына җиңелчә зәңгәр төстә була, һәм моның сәбәбен беркем дә диярлек язып куймый. Бу төсне гөмбәгә каршы кушылган метилен зәңгәре бирә, ә күпчелек протоколлар аны фон шартларының бер өлеше дип карый. Монда «фон» — дөрес төшенчә түгел. Аны исемлеккә кертелмәгән эксперименталь фактор дип атау урынлырак: тәэсиргә дучар ителгән савытларда бар, контроль савытларда юк, кулланылган концентрацияләрдә фармакологик яктан актив һәм эксперимент үлчи торган күрсәткечләрне үзгәртә ала торган матдә.
Түбәндәге бөтен фикер йөртү шушы аермага нигезләнә. Гөмбәгә каршы көндәлек карау — бер мәсьәлә. Өстәмәнең сезнең анализга карата нейтраль булу-булмавы — башка мәсьәлә. Зебра-данио турындагы соңгы фәнни әдәбият беренчесенә тынычландырырлык, икенчесенә борчу тудырырлык җавап бирә.
Күрсәтмәләр чынлыкта нәрсә куша
Бердәм стандарт юк, һәм бу — проблеманың бер өлеше. Канаданың хайваннарны карау советы күрсәтмәләре гөмбә үсешен киметү өчен уылдык һәм личинкаларны ташу эремәсендә 0.5 mg/L, ягъни 0.00005%, кулланырга рөхсәт итә. Европаның лаборатория хайваннары турындагы күрсәтмәләрендә эмбрионнарның еш кына шул ук 0.00005% булган мохиттә тотылуы тасвирлана. Cold Spring Harbor E3 рецепты ингредиент буларак моның ике тапкыр күбрәген — 1 mg/L, ягъни 0.0001% — күрсәтә. Әмма моңа каршы ачык бер төшеп калу бар: OECD балык эмбрионнарының токсиклыгын сынау күрсәтмәсе яңадан әзерләнгән сыекландыру суын һәм сынау химикатын билгели, ләкин аның 2013 елгы версиясендә дә, соңрак яңартылганында да метилен зәңгәре турында тәкъдим юк. Нәтиҗәдә, бер лаборатория зебра-данио эмбрионнарын гомерләренең беренче сәгатьләреннән үк метилен зәңгәре кушылган зәңгәр суда үстерә, икенчесе норматив эмбрион анализын төссез суда үткәрә, һәм икесе дә үз мохитен гадәти дип атый. Лабораторияләр арасындагы нәтиҗәләрне чагыштырган яки элекке контроль мәгълүматларын берләштергән һәркем шушы туры килмәүне мирас итеп ала.
Концентрацияләрнең күләмен аңлау өчен: 0.00005% якынча 1.56 микромолярга, ә 0.0001% якынча 3.13 микромолярга туры килә. Болар — кечкенә саннар, һәм аларны йогынты ясау өчен артык түбән дип кабул итү җиңел. Түбәндәге тикшеренүләр нәкъ шушы фаразны, нәкъ шушы концентрацияләрдә тикшерә.
Лабораториядән түгел, балык асрау өлкәсеннән килгән укучылар шул ук молекула белән башка шартларда очраша; бу аквариумда метилен зәңгәрен куллану белешмәсендә карала. Химиясе бер үк; буяуның күзәнәкләрдә электроннарны ничек күчерүе турындагы аңлатма оксидлашу-кайтарылу ягыннан актив кушылманың ни өчен метаболизм турындагы мәкаләләрдә даими очравын күрсәтә. Алдагы бүлекләр зебра-данио уылдыгы өчен метилен зәңгәре кушылган суга гына кагыла.
Метаболизм: йогынты юнәлеше үсеш этабына карап үзгәрә
Иң мәгълүматлы тикшеренүдә гадәти үсештәге зебра-даниолар гомерләренең беренче көненнән алып аталанудан соң 5 көнгә кадәр буяу тәэсиренә дучар ителгән, һәм һәр этапта оксидлашу метаболизмы үлчәнгән; бу эмбрионнарның метаболизмы буенча экспериментларның басылып чыккан хисабында тасвирлана. Үзгәрешләр эзлеклелеген төгәл итеп әйтү мөһим, чөнки аның юнәлеше кирегә борыла.
Аталанудан соң 1 көндә тәэсиргә дучар ителгән эмбрионнарның базаль кислород куллануы карауда кулланыла торган ике концентрациядә дә арткан. 2 көндә личинкаларның өслек катламындагы митохондрия мембранасы потенциалы 0.00005%, 0.0001% һәм 0.0003% тәэсирләрендә югарырак булган. 4–5 көнгә, уылдыктан чыкканнан соң, юнәлеш кирегә үзгәргән: оксидлашу юлы белән энергия сарыф итү кимегән. Бу тәэсир аталанудан бирле өзлексез дәвам иткәндә дә, бары тик 3 көннән 4 көнгә кадәрге кыска вакытлы тәэсирдә дә күзәтелгән. Шул ук вакытта митохондрияләрнең сулыш комплекслары субберәмлекләренә туры килә торган транскриптлар 1 һәм 4 көндә дә кимегән; стероидогенез һәм глюконеогенез белән бәйле транскриптлар да кимегән.
Тагын ике күзәтү бу күренешне ачыклый. Карауда кулланыла торган югарырак концентрациядә уылдыктан чыгу бераз иртәрәк барган: 2 көндә тәэсиргә дучар ителгән эмбрионнар алда булган, ә 3 көнгә контроль төркем аларны куып җиткән. Стресс күчәре исә сакланган булып күренгән: 5 көнлек личинкаларны су бөтерелүе белән стресс тәэсиренә дучар иткәндә, ике төркемдә дә бөтен тәндәге кортизол дәрәҗәсе гадәттәгечә күтәрелгән. Димәк, бу күләмнәрдә буяу үсешне гомумән агулый торган матдә түгел һәм ул һәр физиологик җавапны да басмый. Ул энергия метаболизмын үсеш этабына бәйле рәвештә үзгәртә: уылдыктан чыкканчы арттыра, чыкканнан соң киметә.
Үз-үзеңне тоту: ни өчен ике тикшеренү килешми һәм ни өчен икесе дә дөрес була ала
Үз-үзеңне тоту турындагы әдәбият, тәэсир схемаларын янәшә куеп караганчы, каршылыклы булып күренә. Бер үсеш һәм үз-үзеңне тоту куркынычсызлыгын тикшерүдә эмбрионнар аталанудан соң якынча 6 сәгатьтән башлап 10 микромолярга кадәрге концентрацияләргә дучар ителгән. Эремәләр 4 көнгә кадәр көн саен яңартылган, аннары личинкалар 5 һәм 6 көннәрдә буяусыз мохиткә күчерелгән, һәм 6 көндә аларның хәрәкәт активлыгы яктылык-караңгылык анализында тикшерелгән. Нәтиҗә: үлем, уылдыктан чыгу яки морфологиягә статистик әһәмиятле йогынты булмаган, хәрәкәт активлыгына да эшкәртүнең тәэсире табылмаган. Авторлар үз шартларында 10 микромолярны югары чик итеп тәкъдим иткән, һәм бу нигезле булган.
Авторларының бер өлеше метаболизм тикшеренүе белән уртак булган икенче төркем тәэсирне көндәлек караудагыча оештырган: буяу аталанудан соң 2–3 сәгатьтән башлап мохиттә булган, көн саен өлешчә яңартылган, ә үз-үзеңне тоту тәэсир дәвам иткәндә яки күптән түгел тәмамланганда үлчәнгән. Шул ук гадәти концентрацияләрдә личинкалар 24 сәгатьлек анализда кимегән хәрәкәт активлыгы күрсәткән. Бу нәтиҗә төрле линияләрдә һәм лабораторияләрдә кабатланган. Үз-үзеңне тоту нәтиҗәләрен бутау турындагы тикшеренү йогынтыны серотонинергик тонус белән бәйләгән; бу буяуның моноаминоксидазаны тоткарлавы турындагы билгеле мәгълүматка туры килә. Иң ачык мисал: метилен зәңгәре булган эмбрион мохите SSRI флуоксетинга көтелгән хәрәкәт җавабын яшергән. Шуңа күрә зәңгәр суда үткәрелгән скрининг анализы төссез суда күренерлек булган дару тәэсирен күрми калырга мөмкин.
Чын каршылык юк. Бер анализда матдәне юып чыгарганнан соң ике көн үткәч аның тәэсиренең ачыкланырлык эзе калмаска мөмкин, ә башка анализда, матдә мохиттә булганда, ул һаман актив була ала. Гамәли яктан моны болай аңларга кирәк: тәэсир табылмаган нәтиҗә нейтральлек турында белдерергә түгел, ә концентрациянең югары чиген билгеләргә нигез бирә. Ә тәэсир табылган нәтиҗә нәкъ мөһим куркынычны тасвирлый: күпчелек лабораторияләр куллана торган шартларда үлчәү чорында актив тәэсир булуын.
Оксидлашу-кайтарылу анализы эчендәге оксидлашу-кайтарылу буявы
Тагын бер тозак аерым абзацка лаек, чөнки ул хайванны түгел, ә үлчәү ысулын боза. Энергия сарыфын үлчәүче Alamar Blue анализы үзе үк оксидлашу-кайтарылу химиясенә нигезләнә: резазурин флуоресцент резоруфинга кадәр кайтарыла. Метилен зәңгәре дә оксидлашу-кайтарылу химиясендә катнаша. Күзәнәксез контроль сынауларда карауда кулланыла торган ике концентрация дә 24 сәгатьтән соң Alamar Blue флуоресценциясен аз гына, әмма статистик әһәмиятле дәрәҗәдә киметкән. Хайваннар белән экспериментларда тәэсиргә дучар ителгән эмбрионнар анализ алдыннан буяусыз мохиттә кимендә өч тапкыр юылган, һәм уылдыктан чыккан личинкалардагы биологик йогынты күзәнәксез сынаудагы комачаулаудан зуррак булган. Димәк, ике фикер дә дөрес: юылган хайваннарда чын метаболик йогынты саклана, ә юылмый калган буяу моңа турыдан-туры химик артефакт өсти. Контроль сынаулар боларны аерырга тиеш, югыйсә ике санның да мәгънәсе булмый. Буяуга нигезләнгән анализ нәтиҗәләрен аңлау турындагы гомуми күрсәтмәләр монда аеруча мөһим.
Үсеш этаплары буенча вакыт сызыгы
Бу мәкалә өчен махсус әзерләнгән материал. Башкача күрсәтелмәсә, концентрацияләр — карауда кулланыла торган ике стандарт кыйммәт: 0.00005% һәм 0.0001%.
| Этап | Нәрсә тикшерелгән | Карауда кулланыла торган концентрацияләрдәге нәтиҗә |
|---|---|---|
| 0–1 dpf, уылдыктан чыкмаган эмбрион | Базаль кислород куллану, митохондрия транскриптлары | Куллану арткан; I һәм IV комплекслар транскриптлары кимегән |
| 2 dpf, уылдыктан чыгу чоры | Мембрана потенциалы; уылдыктан чыгу барышы | Потенциал 0.00005%–0.0003% аралыгында арткан; 0.0001% булганда уылдыктан чыгу вакытлыча алга күчкән |
| 3–4 dpf, уылдыктан чыкканнан соң кыска вакытлы тәэсир | Бары тик 24 h тәэсирдән соң энергия сарыфы | Сарыф кимегән, өзлексез тәэсирдәге нәтиҗәгә туры килгән |
| 4–5 dpf, уылдыктан чыккан личинкалар | Энергия сарыфы; митохондрия транскриптлары | Сарыф 24 һәм 48 h үткәч кимегән; I, II, III комплекслар һәм ATP-синтаза транскриптлары кимегән |
| 5–6 dpf, личинкаларның үз-үзен тотуы | 24 сәгатьлек хәрәкәт активлыгы; флуоксетинга җавап | Хәрәкәт активлыгы кимегән; SSRI җавабы яшерелгән |
| 2 көнлек юып чыгару чорыннан соң 6 dpf | Яктылык-караңгылык шартларындагы хәрәкәт активлыгы; морфология | 10 микромолярга кадәр калдык тәэсир табылмаган |
Истәлекле төп күренеш — метаболик күрсәткечләрнең башта күтәрелүе, соңрак төшүе. Үз-үзеңне тотуга йогынты тәэсир вакытында бар, ә матдә организмнан чыгарылганнан соң, моны тикшергән бер анализда, ул ачыкланмый.
Контроль сынауларны планлаштыру исемлеге
Икенче махсус әзерләнгән материал. Метилен зәңгәре кулланылган зебра-данио протоколлары эксперимент белән кисешкәндә, шушы исемлектән файдаланыгыз.
- Буяуны суның бер өлеше түгел, ә реагент буларак күрсәтегез. Концентрацияне процентларда да, микромолярда да, тәэсирнең башын һәм ахырын аталанудан соңгы сәгатьләрдә яки көннәрдә, яңарту графигын һәм һәр үлчәү алдыннан юып чыгару вакытын языгыз.
- Контроль төркемнәрне сорауга туры китерегез. Сынау химикатын тикшерү өчен буяусыз контроль төркемнәр кирәк; карауны тикшерү өчен буяусыз һәм буяулы төркемнәрне чагыштырырга һәм гөмбәгә каршы нәтиҗәне теркәргә кирәк, чөнки телгә алынган ике тикшеренүнең берсе дә гөмбәгә каршы нәтиҗәлелекне үлчәмәгән.
- Оксидлашу-кайтарылу анализлары алдыннан юыгыз, аннары тикшерегез. Буяусыз мохиттә кимендә өч тапкыр чайкагыз һәм янәшәдә буяу белән реагенттан торган күзәнәксез контроль сынау үткәрегез, чөнки буяу Alamar Blue сигналын турыдан-туры киметә.
- Үз-үзеңне тоту һәм моноамин күрсәткечләрен югары куркынычлы дип карагыз. Хәрәкәт активлыгы, кинәт сискәнү, борчылуга охшаш үз-үзеңне тоту, антидепрессантлар һәм MAO ингибиторлары тикшеренүләрендә үлчәү вакытында буяудан баш тартырга яки аның конкрет күрсәткечкә карата нейтральлеген күрсәтергә кирәк; бер-ике көнлек юып чыгару бер хәрәкәт тәэсирен бетергән, ләкин башка тикшерү схемалары өчен бу расланмаган.
- Метаболик һәм митохондрия күрсәткечләрен һәр этапта югары куркынычлы дип карагыз. Кислород куллану, энергия сарыфы, мембрана потенциалы һәм сулыш чылбыры транскриптлары карауда кулланыла торган концентрацияләрдә үзгәрә; уылдыктан чыкканчы һәм чыкканнан соң юнәлешләре капма-каршы була.
- Бер схемадагы нейтральлекне икенчесенә күчермәгез. Юып чыгарганнан соң тәэсир табылмау дәвамлы тәэсиргә кагылмый; морфологик тәэсир табылмау метаболизмга яки дару белән үзара тәэсиргә кагылмый; бер линиядә, температурада яки анализ дәвамлылыгында алынган нәтиҗә башкаларына кагылмый.
- Үзегез тоткан күрсәтмәне һәм аның альтернативасын языгыз. CCAC, Европа яки Cold Spring Harbor концентрацияләрен ачыктан-ачык атагыз һәм OECD эмбрион сынавында буяуның күрсәтелмәвен искәртегез, шул чакта укучы хайваннарыгызның нинди шартларда тотылганын аңлый ала.
Боларның берсе дә уылдыкны исән саклау өчен буяу куллануга каршы дәлил түгел. Алар карау өчен сайланган чараның тикшерелмичә мәгълүматларга йогынты ясавына каршы дәлил. Савыттагы зәңгәр төс — үз фармакологиясе булган молекула; ә иң җиңел бозылырга мөмкин экспериментлар — хәзер яшь зебра-даниолар өстен күрелә торган югары үткәрүчәнлекле метаболик һәм нейроүз-үзеңне тоту скрининглары. Аны теркәгез, контрольдә тотыгыз, үлчәү алдыннан юып чыгарыгыз һәм ул сиздермичә катнаша алган анализны тикшерегез.