Метилен зәңгәре белән тәҗрибәләрдә кислородның реактив формаларын үлчәү

Ике лаборатория тәҗрибә үткәрә, һәм һәркайсы аны метилен зәңгәренең антиоксидант тәҗрибәсе дип атый. Берсе буягычның кислородның реактив формаларын киметүен хәбәр итә. Икенчесе аларны барлыкка китерүен хәбәр итә. Икесе дә ачык доза–җавап кәкреләре күрсәтә. Икесе дә ихлас. Аерма алдауда яки компетентсызлыкта түгел. Ике төркем төрле яктырту шартларында, төрле сорауларга җавап бирүче зондлар белән төрле күренешләрне үлчәгән, аннары ике җавапны да бер үк сүз белән тасвирлаган: ROS.

Метилен зәңгәрен төгәл үлчәү авыр, чөнки ул күзәтергә тиеш булган химик процессларда үзе дә катнаша. Караңгыда ул электроннарны донорлар белән акцепторлар арасында күчерә һәм, яңадан циклга керергә әзер булып, башлангыч формасына кайта. Яктылыкта ул фотосенсибилизаторга әверелә: ярсыган триплет халәткә күчә һәм шул халәттән кислородка энергия биреп синглет кислород барлыкка китерә ала, яки электроннар күчереп радикаллар һәм водород пероксиды ясый ала. Бу системага кертелгән теләсә кайсы зонд буягычның үзе тарафыннан оксидлаштырылырга, кайтарылырга, төссезләндерелергә яки оптик яктан капланырга мөмкин. Шуңа күрә теләсә кайсы ROS үлчәвендә беренче сорау санның күпме булуы турында түгел. Ул анализның чынлыкта нәрсә ачыклавы һәм буягычның анализга ничек тәэсир итүе турында.

Amplex Red: водород пероксидын билгеләү өчен калибрланган анализ

Дөрес оештырылганда, метилен зәңгәре белән Amplex Red кушылмасы бу өлкә әдәбиятында иң нык нигезләнгән пар булып тора. Химик реакция специфик: керән пероксидазасы водород пероксидын кулланып, Amplex субстратын флуоресцент продуктка — резоруфинга — якынча бергә бер стехиометрия белән оксидлаштыра. Үрнәктәге пероксид детекторда флуоресценциягә әверелә. ROSның гадәти төркемендәге башка бер матдә дә бу реакцияне турыдан-туры китереп чыгармый.

Хәлиткеч өстенлек — калибрлау. Игътибарлы тикшеренүче пероксидның билгеле стандартларын шул ук буферда, пероксидаза һәм субстратның шул ук концентрацияләре, шул ук инкубация вакыты һәм шул ук оптик көйләүләр белән үлчи, аннары үрнәкләрне шул кәкрегә карап бәяли. Бу ысулның нигезен тәшкил иткән, баш миеннән аерып алынган митохондрияләрне тикшерүдә авторлар нәкъ шулай эшләгән: һәр үлчәү ахырында билгеле күләмдә пероксид өстәгәннәр, һәм саннар шартлы флуоресценция берәмлекләре рәвешендә түгел, ә бер миллиграмм аксымга минутына пикомольләрдә тизлек итеп бирелгән. Яктыруны үлчәүгә әйләндерә торган нәрсә — шул.

Бу тикшеренүдәге өч детальне үрнәк итеп алырга кирәк. Беренчедән, авторлар сигналны пероксидны таркатучы каталаза белән тикшергән. Каталаза өстәгәч, метилен зәңгәре китереп чыгарган флуоресценция артуы туктаган; бу сигналның оптик артефакт түгел, ә пероксид булуын раслаган. Икенчедән, алар ярсыту нурын затвор белән чикләп, яктыртуны турыдан-туры сынаган: үрнәкләр гадәти яктылык дозасының сигездән бер өлешен генә алган, ә сигнал нибары тугыз процентка кимегән. Алар хәбәр иткән пероксидның туксан проценттан артыгы үлчәү яктылыгына бәйле булмаган. Өченчедән, алар пероксидның бетерелүен электрод белән аерым үлчәгән һәм буягычның бер үк вакытта аның барлыкка килүен арттыруын да, бетерелүен акрынайтуын да ачыклаган. Флуоресценциянең гомуми нәтиҗәсен генә күрсәтүче зонд бу ике эффектны бергә кушып күрсәткән булыр иде.

Анализда хаталарга китерә торган механизмнар барыбер бар, һәм метилен зәңгәре аларның берничәсен эшкә җигә. Буягыч резоруфин нур чыгарган шул ук кызыл өлкәдә яктылыкны киң диапазонда йота, шуңа күрә буягыч концентрациясе югары булганда үрнәк эчке фильтр эффектлары аша үз сигналын үзе каплый ала. Шуңа күрә стандартлардагы буягыч концентрациясе үрнәкләрдәге белән бер үк булырга тиеш. Amplex Red үзе дә фотооксидлаша ала, ә аның продукты резоруфин супероксид һәм пероксид барлыкка китерә торган фоторедокс циклларга керә ала; тәҗрибәдә фотосенсибилизатор да яктыртылганда бу аеруча мөһим. Практик чишелеш — буягыч белән зондны бергә яктырту урынына, башта метилен зәңгәре үрнәкләрен нурландыру, аннары аларның аликвоталарын Amplex реагентлары белән караңгыда анализлау. Ниһаять, супероксиддисмутаза Amplex сигналын гади генә киметми: супероксидны пероксидка әверелдерү аны арттыра ала. Флуоресценцияне арттырган SOD контроле уңышсыз түгел. Ул супероксидның реакция чылбырының алдагы баскычында катнашуын күрсәтә.

DCFDA: специфик булмаган оксидлашу индикаторы

Метилен зәңгәре белән DCFDA пары — буталчыклыкларның күбесенең чыганагы. DCFH-DA — күзәнәккә кертелә торган прекурсор. Күзәнәк эчендәге эстеразалар аның ацетат төркемнәрен алып ташлый, нәтиҗәдә флуоресценция бирми торган DCFH кала, ә DCFH оксидлашканда флуоресцент DCF барлыкка килә. Аны оксидлаштыра торган матдәләр исемлеге озын: гидроксил радикаллары, пероксидаза һәм гем реакцияләренең арадаш продуктлары, азот диоксиды, гипохлорит кислотасы һәм пероксинитриттан барлыкка килгән радикаллар. Водород пероксиды үзе генә аны үлчәү өчен җитәрлек тизлектә турыдан-туры оксидлаштырмый; пероксидка бәйле флуоресценция өчен гадәттә реакция чылбырында тимер, гем аксымнары яки пероксидаза химиясе кирәк.

Һәр ысуллар бүлеге сылтама бирергә тиешле тәнкыйть Калянараман һәм хезмәттәшләренең DCFHны зонд буларак анализлавыннан килә. Шул сәбәпле DCFDAдан баш тарткан баш мие митохондрияләре тикшеренүендә йомгакланганча, алар зондның акрын реакциягә керүен, стехиометриясенең билгесез булуын, дөрес калибрлау булмавын һәм ROS булмаган кушылмалар белән дә реакциягә керүен күрсәткән. Зонд үзе үлчәгән күренешне дә көчәйтә: DCFHның бер электронлы оксидлашуы DCF радикалын барлыкка китерә, ул кислород белән реакциягә кереп супероксид ясый, ә супероксид дисмутацияләнеп өстәмә пероксид бирә. Үлчәү процессы үзе хәбәр иткән химик күренешләрне өлешчә үзе үк тудыра.

Боларның берсе дә DCFDAны файдасыз итми. Алар аны идентификацияләү чарасы түгел, ә скрининг чарасы итә. DCF флуоресценциясенең артуы оксидантларга бәйле зонд оксидлашуы артканын аңлата. Бу пероксид артты дигән сүз түгел, һәм һич тә гомуми ROS артты дигән сүз түгел: бу күләмне бер генә зонд та үлчәми. Метилен зәңгәре буенча бер микромолярдан югары концентрацияләрдә DCF оксидлашуына таянган элеккеге эшләр прооксидант эффектлар турында хәбәр иткән, ә шул ук чордагы башка системаларда пероксид китереп чыгарган күзәнәк үлеменнән саклану күзәтелгән. Төрле редокс шартларында бер үк буягыч өчен ике күзәтү дә дөрес булырга мөмкин, һәм DCF нәтиҗәсе генә сигналның кайсы оксиданттан килгәнен әйтә алмый. Баш мие митохондрияләре буенча элеккеге эшнең әһәмияте шунда: ул бу скринингны пероксидны калибрлап үлчәү белән алыштырган һәм пероксид йөкләнешен турыдан-туры ачыклаган — хәтта йөз наномоляр буягыч та сыналган барлык субстратларда һәм сулыш халәтләрендә пероксид бүленеп чыгуын берничә тапкыр арттырган.

DCFDAның метилен зәңгәренә хас тагын бер тозагы бар. Буягычның төсе көчле һәм ул редокс-актив, шуңа күрә ул күзәнәк ROSларыннан бәйсез рәвештә флуоресценцияне сүндерә, нур чыгаруны баса яки зондны оксидлаштыра ала. Буягыч һәм зонд булган, ләкин күзәнәкләр булмаган күзәнәксез контроль — ихтыяри бизәк түгел. Бу — буягычның зонд белән үзара тәэсир итү-итмәвен күрсәтүче тәҗрибә.

Спин тоту һәм кислород йотылуы: төрен ачыклау һәм агым

Флуоресцент зондлар оксидлаша ала торган ниндидер матдә барлыкка килүен күрсәтсә, спин тоткычлар белән электрон спин резонансы аның нәрсә булуына якынрак җавап бирә. Метилен зәңгәренең фотохимиясе буенча классик тикшеренүдә буягыч, аскорбат һәм яктылык тәэсирендә барлыкка килгән аскорбат радикалын ачыклау өчен ESR кулланылган, аннары кислород йотылуы тәҗрибәләрендә пероксид барлыкка килүе, ә спин тоту тәҗрибәләрендә тимер катализлаган гидроксил радикалы барлыкка килүе күрсәтелгән. Һәр ысул башкалары җавап бирә алмаган сорауга җавап биргән: ESR радикалның төрен билгеләгән, кислород йотылуы теләсә кайсы флуоресцент зондтан бәйсез рәвештә реакция агымын күрсәткән, ә аларның бергә кулланылуы бер үк яктыртылган системада синглет кислород юлы да, радикал юллар да эшләвен күрсәткән.

1984 елгы бу нәтиҗә әле дә кисәтү кебек яңгырый. Яктырту һәм кайтаргыч булганда буягыч пероксид барлыкка китергән, ә тимер булганда система бу төркемдәге иң реактив форма — гидроксил радикалын ясаган. Авторлар моны күздәге аскорбат белән бәйләгән һәм офтальмологиядә уйламыйча куллануны шик астына куйган. Бүгенге укучылар шартларга игътибар итәргә тиеш: яктылык, кайтаргыч һәм тимер. Шуларның теләсә кайсысын алып ташласаң, бу юл зәгыйфьләнә яки юкка чыга.

Кислород электродлары үз урынын башкача аклый. Кларк тибындагы электрод кислородның нәтиҗәви кулланылышын үлчи; бу буягыч этәргеч биргән редокс химиясенең молекуляр кислородны куллануын раслый һәм бернинди флуоресценция артефакты да ялган күрсәтә алмаган кинетиканы бирә. Ул продуктның төрен билгеләми. Пероксид, супероксид һәм су барлыкка килү, шулай ук синглет кислородның таркалуы белән бәйле процесслар барысы да кислород куллана. Төре билгесез агым, агымы билгесез төр кебек үк, тулы мәгълүмат бирми. Шуңа күрә ышанычлы эшләрдә электродны пероксидны калибрлап билгеләү анализы яки тоткыч белән бергә кулланалар.

Ни өчен антиоксидант нәтиҗәләр бер-берсенә каршы килә

Өч төр үлчәү нәтиҗәсен янәшә куйсаң, метилен зәңгәре турындагы әдәбиятта күренгән каршылыклар ысуллар аермасына һәм өч биологик фактка кайтып кала.

Беренчедән, буягыч электрон күчерүче дә, пероксид чыганагы да булып тора. Электроннарны кислород супероксидка әвереләчәк сулыш урыннарыннан читкә юнәлтеп, ул бер ROSны киметә ала; шул ук вакытта аның кайтарылган формасы кислородны турыдан-туры пероксидка кадәр кайтарып, икенчесен арттыра. Шуңа күрә митохондрияләрдәге редокс химиясе һәм буягычның әйләнеч юлдагы роле белән эш итүче лаборатория зондка бәйле җаваплар көтәргә тиеш: бер үк кюветада супероксидка сизгер күрсәткеч кими, ә пероксид күрсәткече арта.

Икенчедән, аз дозаларда пероксид — зыян гына түгел, сигнал да. Элеккеге эштән соң үткәрелгән тычканның баш мие митохондрияләре тикшеренүендә нибары илле наномоляр буягычтан ук пероксид барлыкка килүе, терапевтик дәрәҗәләрдә исә митохондриаль ДНК зарарланмавы ачыкланган; алдан эшкәртүдән соң ротенон китереп чыгарган зарарланулардан саклану күзәтелгән. Буягыч терапевтик диапазоннан күпкә югары булган йөз микромоляр концентрациядә генә аерым ДНК фрагментларын зарарлаган, ә кызыл яктылык һәм егерме микромоляр буягыч барлык сыналган фрагментларны зарарлаган синглет кислород барлыкка китергән. Тәкъдим ителгән механизм — гормезис: пероксидның аз күләмдә барлыкка килүе Nrf2 белән бәйле антиоксидант саклану механизмнарын һәм митохондрияләр биогенезын эшкә җигә, шуңа күрә кыска вакытлы прооксидант күрсәткеч озаграк вакытлы антиоксидант нәтиҗәдән алда килә. Бер сәгатьтән соң укылган анализ белән бер көннән соң укылган анализ бер-берсенә туры килмәскә мөмкин, чөнки бу арада биологик процесслар үзгәргән.

Өченчедән, яктылык хәтта кайсы молекуланың булуын да билгели. Яктырту буягычтан метил төркемнәрен аерып, аны Azure B һәм аңа якын продуктларга әверелдерә, һәм савыт өстендәге микроскоп лампасы да аны фотосенсибилизацияләү өчен җитә. Караңгыда һәм яктыртып үткәрелгән тәҗрибәләр — төрле тәҗрибәләр, һәм теләсә кайсы протоколның яктыртуны һәм буягыч белән эш итүне контрольдә тоту бүлеге аларга шулай карарга тиеш.

Минималь контрольләр җыелмасы һәм теләсә кайсы раслауны ничек бәяләргә

Түбәндәге чагыштыру — бу мәкалә өчен әзерләнгән оригиналь белешмә материал. Метилен зәңгәре белән алынган теләсә кайсы ROS нәтиҗәсен кабул иткәнче, авторларның кайсы юлны үтәгәнен һәм кайсысын төшереп калдырганын тикшерегез.

Моннан практик бәяләү кагыйдәсе килеп чыга. Пероксидаза белән үткәрелгән, калибрланган һәм каталаза белән тикшерелгән Amplex анализы пероксид турында дәлил бирә. DCFDA зондның специфик булмаган оксидлашуы турында гына дәлил бирә, башка берни турында да түгел. Радикалларны йотучы матдәләр белән контрольләр кулланылган спин тоту радикалның төре турында дәлил бирә. Кислород йотылуы агым турында дәлил бирә. Анализ нигезли алганнан күбрәкне раслаучы җөмлә, никадәр ышанычлы итеп язылса да, буягыч турында түгел, зонд турында сөйли. Дозага бәйлелек һәм горметик диапазон, митохондрияләрдә электрон агымы, буялган үрнәкләрдә анализга комачаулыклар һәм микроскопиядә яктырту артефактлары турында бәйле фикер алышулар бу пунктларның һәрберсен киңәйтә; вакытлы сылтамалар чын сылтамалар белән алыштырылгач та, һәр пункт үз көчен саклый.