Метилен зәңгәре өчен калибрлау кәкре сызыгын төзү: буш үрнәкләр, диапазон һәм сызыклылык

Ике аналитик метилен зәңгәренең бер үк башлангыч эремә шешәсен куллана һәм һәркайсы калибрлау кәкре сызыгын төзи. Беренчесе координаталар башы аша үткән туры сызык ала һәм билгесез үрнәкләрне ышаныч белән үлчи. Икенчесендә югары өлеше бөгелгән сызык, нульгә якынлашмаган ирекле буын һәм сыегайтуга бәйле үзгәргән үрнәк нәтиҗәләре килеп чыга. Буягыч та, прибор да, дулкын озынлыгы да бер үк. Аерма осталыкта түгел. Ул тәҗрибәне оештыруда: буш үрнәккә нәрсә кергән, нинди концентрацияләр сайланган һәм тикшерелгән диапазон бер гади модель һаман да дөрес булган өлкәдә калганмы.

Калибрлау кәкре сызыгы — прибор сигналы белән концентрация арасындагы килешү; ул бары тик үзе төзелгән шартларда гына гамәлдә. Метилен зәңгәре өчен бу килешүнең билгеле зәгыйфь урыны бар. Буягыч суда үзара берләшә, шуңа күрә яктылыкны йотучы кисәкчәләрнең төре концентрациягә бәйле рәвештә үзгәрә. Бу үзгәрешне колачлаган кәкре сызык туры булмаячак, һәм моны бернинди статистика да төзәтә алмый. Бу мәкалә сызыкның мәгънәле булуын тәэмин итәрлек калибрлау тәртибен күрсәтә: дөрес буш үрнәк сайларга, диапазонны мономер өстенлек иткән өлкәдә тотарга, мөстәкыйль кабатлаулар үткәрергә һәм бөгелүне шау-шу түгел, ә мәгълүмат итеп кабул итәргә.

Стандартлардан түгел, буш үрнәктән башлагыз

Буш үрнәк нульне билгели, һәм метилен зәңгәре өчен анда буягычтан башка барлык компонентлар булырга тиеш. Суның сыйфат дәрәҗәсе, буфер һәм pH, тозлар, өстәмә эреткеч өлеше һәм температура бер үк булырга тиеш. Калибрлау үрнәкләрен дә нәкъ шул матрицада әзерләгез. Моның сәбәбе кәгазь таләпләрендә түгел, ә химиядә. Тоз һәм эреткеч мономер, димер һәм югарырак агрегатлар арасындагы балансны күчерә; бу үлчәү дулкын озынлыгындагы спектрны үзгәртә. Судан гына торган буш үрнәк матрица тәэсирендә химик төрләр нисбәтенең үзгәрүен төзәтә алмый. Метилен зәңгәренең судагы спектрларына глобаль анализда, аның ачык керүле язмасы аша да танышып була, натрий хлориды концентрациясе 0 дән 0.15 M га кадәр үзгәртелгән. Моның сәбәбе нәкъ менә ион көченең тигезләнешне күчерүе булган, һәм тоз арткан саен агрегатлашу да арткан.

Моннан бер гамәли нәтиҗә килеп чыга: беркайчан да деионлаштырылган суда калибрлап, аннары фосфат буферындагы яки агынты су фильтратындагы үрнәкләрне үлчәмәгез. Аналитсыз матрица булмаганда, үрнәкнең үзенә стандарт өстәү матрицага туры килмәгән тышкы калибрлау кәкре сызыгыннан яхшырак. Су эремәләрендәге анализларның дөреслеген саклау турында өстәмә киңәшләр матрица һәм комачаулаучы факторлар турындагы бүлектә бирелә, ә буягычларны сан ягыннан анализлауның гомуми принциплары анализны планлаштыруга күзәтүдә карала.

Бер химик төр өстенлек иткән диапазонны сайлагыз

664 nm тирәсендәге озын дулкынлы полосада сан ягыннан билгеләү буягычның күпчелеге мономер рәвешендә булуына нигезләнә. Гади суда бу фараз эремәләр сыек булып калган чакта гына, якынча түбән микромоляр өлкәдә, дөрес. Басылып чыккан эмпирик авышлык коэффициентлары чикне күрсәтә: 1 cm кюветаларда якынча 7 микромолярдан түбән тотылган калибрлаулар 82,000 M-1 cm-1 тирәсендәге авышлык коэффициентын бирә, ә якынча 37 микромолярга кадәр киңәйтелгән калибрлауда ул якынча 67,100 гә төшә, чөнки югары концентрацияле стандартларда инде сизелерлек күләмдә димер бар. Биредә китерелгән һәр коэффициент метилен зәңгәре өчен спектраль белешмәлектә үз шартлары белән күрсәтелгән; саннарны чагыштыру өчен шул белешмәлеккә мөрәҗәгать итәргә кирәк. Бу мәкалә аларны диапазонны билгеләү өчен генә куллана.

Тәҗрибәне оештыру кагыйдәләре моннан турыдан-туры килеп чыга:

1. Иң югары концентрацияле стандартны спектр формасы тотрыклы калырлык дәрәҗәдә сыек тотыгыз. Ысулны эшләгәндә, бер дулкын озынлыгында гына үлчәү урынына, һәр дәрәҗә өчен бөтен күренмә диапазонны сканерлагыз (якынча 550 дән 750 nm га кадәр). Нормальләштерелгән спектрларның формасы концентрация белән үзгәрсә, химик состав үзгәрә һәм диапазон артык киң дигән сүз.
2. Дәрәҗәләр буенча 610 nm тирәсендәге оптик тыгызлыкның 665 nm тирәсендәге оптик тыгызлыкка нисбәтен күзәтегез. Концентрация артканда нисбәт тә үссә, димерга хас спектраль җилкә көчәя һәм мономер моделе эшләми башлый дигән сүз. Бу диагностик билге агрегатлашу һәм концентрация тәэсирләре турындагы кулланмада тулырак аңлатыла.
3. Түбән микромоляр концентрацияләр белән эшләгәндә 1 cm кювета кулланыгыз. Авышлык коэффициенты 82,000 тирәсендә булганда, 5 микромоляр концентрация якынча 0.41, ә 10 микромоляр якынча 0.82 оптик тыгызлык бирә; икесе дә күпчелек приборлар өчен уңайлы.
4. Концентрацияләнгән башлангыч эремәләр өчен 1 дән күпкә югары оптик тыгызлыкны кабул итү урынына оптик юлны кыскартыгыз, ләкин кыска юлның химияне түгел, фотометрияне төзәтүен онытмагыз. Агрегатлашу оптик юл озынлыгына түгел, концентрациягә бәйле, шуңа күрә концентрацияләнгән башлангыч эремә өчен сыек мономер кәкре сызыгы түгел, ә химик төрләр нисбәтен исәпкә алган аерым алым кирәк.

Бу күренешнең зур өлешен нигезләгән глобаль модельгә туры китерү 1.1 микромолярдан 3.4 миллимолярга кадәрге 224 спектрны колачлаган һәм тетрамер сигналын инде 34 микромолярдан түбәндә дә ачыклап булуын күрсәткән. Бу нәтиҗә сак булырга этәрә: сызыклы өлкә интуитив көтелгәннән таррак, шуңа күрә аны фаразлап кына калмагыз, тикшерегез.

Дәрәҗәләр, кабатлаулар һәм тәртип

Өч нокталы кәкре сызык бернәрсә дә исбатламый. ICH Q2(R2) валидация күрсәтмәләре сызыклылыкны бәяләү өчен кимендә биш концентрация сорый, ә нульдән аермалы алты-сигез дәрәҗә ышанычлырак эш кәкре сызыгын бирә, бигрәк тә агрегатлашу башланган югары өлештә. Дәрәҗәләрне планлаштырылган үрнәкләр диапазонын колачларлык итеп урнаштырыгыз; бөгелү ихтималы зуррак булган урыннарда аларны ешрак куегыз, уңайлылык өчен генә сайланган геометрик рәт кулланмагыз.

Һәр дәрәҗәне ике яки өч кабатлауда үлчәгез; бер колбадан өч тапкыр үлчәү урынына, аларны мөстәкыйль әзерләгез. Мөстәкыйль кабатлаулар әзерләү хатасын күрсәтә; бер колбаны кабат үлчәү прибор шау-шуын гына күрсәтә. 2020 елгы глобаль тикшеренүдә һәр эремә өч тапкыр үлчәнгән, һәм бу һаман да нигезле гадәти сайлау булып кала. Сигналның акрын үзгәрүе, пыялага адсорбция яки температура үзгәреше бөгелү кебек күренмәсен өчен, үлчәү тәртибен очраклы итегез. Кварц кюветаларны тикшергәндә, 34 микромоляр эремәдәге буягычның якынча 3 проценты 10 минут эчендә адсорбцияләнүе ачыкланган, шуңа күрә бөтен үлчәү сериясе дәвамында контакт вакытын, кюветаны, чистартуны һәм эш тәртибен бертөрле тотыгыз.

Аңлату өчен исәпләү мисалы (үлчәнгән мәгълүмат түгел)

Түбәндәге саннар исәпләүне күрсәтү өчен уйлап чыгарылган. Алар лаборатория үлчәүләре түгел һәм метилен зәңгәре турындагы мәгълүмат буларак китерелергә тиеш түгел. Мөһиме — алар тирәсендәге тикшерүләр тәртибе.

Әйтик, бер үк буферда әзерләнгән алты стандарт 1 cm оптик юл белән 665 nm да матрицага туры килгән буш үрнәккә карата үлчәнә:

Уртача оптик тыгызлыкны концентрациягә бәйле туры сызык белән якынлаштыру һәр микромолярга якынча 0.0805 оптик тыгызлык берәмлеге булган авышлык коэффициентын һәм нульдән нибары берничә миллиоптик тыгызлык берәмлегенә аерылган ирекле буынны бирә. Авышлык коэффициентын оптик юл озынлыгына бүлү аны күренмә йоту коэффициентына әйләндерә: һәр микромолярга 0.0805 якынча 80,500 M-1 cm-1 га тигез, бу суда мономер өстенлек иткән интервалга туры килә. Мөһим тикшерүләр R квадраты белән чикләнми: ул ике очракта да бик яхшы күренәчәк. Алар — нульгә якын ирекле буын, S2 дән S5 кә кадәр тотрыклы A610/A665 нисбәте һәм билгеле бер тенденциясез таралган калдыклар. S6 дагы нисбәтнең бераз үсүе бу дәрәҗәне алып ташларга яки 7 микромолярны әлеге матрица һәм прибор кушылмасы өчен вакытлыча югары чик итеп билгеләргә кирәклеген ачык күрсәтә.

Шул ук шартларда 0.245 күрсәткече биргән билгесез үрнәк турыдан-туры исәпләнә: 0.245 не һәр микромолярга 0.0805 кә бүлү якынча 3.0 микромоляр бирә; бу исәпкә үрнәкне сыегайту коэффициенты әле кертелмәгән. Нәтиҗәне аның шартлары белән бергә күрсәтегез: дулкын озынлыгы, оптик юл, буш үрнәк матрицасы, калибрлау интервалы һәм дата.

Тутырыла торган калибрлау эш бите

Һәр яңа матрица өчен бу шаблонны лаборатория язмаларына күчерегез. Бер матрица, бер бит, бер кәкре сызык.

Реагент формасы өчен юл юкка гына кертелмәгән. Сатудагы метилен зәңгәре сусыз тоз яки тригидрат кебек гидрат булырга мөмкин, һәм дөрес булмаган моляр масса һәр номиналь концентрацияне сиздермичә тайпылдыра. Башлангыч материалның чисталыгын һәм спецификациягә туры килүен тикшерү сыйфат һәм дәрәҗә турындагы кулланмада карала.

Мөстәкыйль контроль стандарт белән тикшерегез

Калибрлау кәкре сызыгы беркайчан да үзен үзе бәяләргә тиеш түгел. Модельне туры китергәннән соң, аерым үлчәп алынган матдәдән ясалган башлангыч эремәдән бер контроль стандарт әзерләгез; аның концентрациясе кабул ителгән интервал уртасына якын булсын. Аны билгесез үрнәк итеп үлчәгез. Берничә процент эчендәге туры килү әзерләү чылбырының дөреслеген раслый; туры килмәү приборга түгел, башлангыч эремәгә яки сыегайтуларга шик тудыра. Контроль стандартны һәр үрнәкләр партиясе белән кабат үлчәгез. Кәкре сызык үзгәрмичә, контроль нәтиҗәсе үзгәрсә, үрнәкләргә шикләнүдән элек эш эремәләрен яки кюветаны тикшерегез. Бу бер гадәт күпчелек сизелми калган хаталарны ачыклый: сусыз матдә шешәсе өчен гидратның моляр массасын куллану, калибрлавы бозылган микропипетка, дөрес булмаган ион көче белән әзерләнгән буфер. Соңрак укучы сызыкның сызылган гына түгел, ә тикшерелгән дә булуын күрсен өчен, контроль стандартның табылган концентрациясен көтелгәненә карата процентларда эш битендә авышлык коэффициенты янына языгыз.

Сызыксызлыкны диагностик билге итеп аңлату

Кәкре сызык бөгелгәндә, тайпылышның формасы сәбәпне күрсәтә. Спектр формасы үзгәрмәгән килеш югары оптик тыгызлыкта аска таба бөгелү приборга ишарә итә: еш кына чит яктылык югары оптик тыгызлык күрсәткечләрен киметеп күрсәтә. 610 nm дагы спектраль җилкә үсүе белән бергә күзәтелгән бөгелү химиягә ишарә итә: димер һәм югарырак агрегатлар мономердан башкача йота. Нульләнмәгән буш үрнәк яки күрсәткечләре вакыт узу белән кимегән стандартлар савытка ишарә итә: пыялага яки кюветаларга адсорбция, бигрәк тә серия дәвамында контакт вакытлары төрле булса. Ә нокталар аша үткән чиста туры сызык үрнәкләр өчен һаман да дөрес булмаган нәтиҗәләр бирсә, сәбәп матрицада: үрнәкләр калибрлау үрнәкләреннән аерыла. Шуңа күрә кәкре сызыкны үрнәк матрицасында яңадан төзегез яки стандарт өстәү ысулына күчегез. Һәр очракта калдыкларны концентрациягә бәйле графикта күрсәтегез. Очраклы таралыш туры сызык моделен хуплый; елмаю яки кире елмаю сыман бөгелү аны R квадратының теләсә кайсы чик бәясенә караганда ышанычлырак кире кага. Валидация күрсәтмәләре бу фикерне ачыктан-ачык хуплый.

Метилен зәңгәре белән эшләгәндә мондый тәртип үзен аклый. Аның мономер полосасы көчле, химик үзлекләре яхшы өйрәнелгән, ә тайпылыш төрләре саннарны бозганчы ук спектрда күренә. Кәкре сызыкны тар диапазонда төзегез, дөрес буш үрнәк кулланыгыз, кабатлауларны мөстәкыйль әзерләгез һәм диапазонны спектрларның формасына нигезләнеп сайлагыз. Нәтиҗәдәге сызык кыска булачак, ләкин андагы һәр нокта дөрес булачак.

Бу мәкаләдәге аңлатмалы исәпләүләрдә ысулны күрсәтү өчен уйлап чыгарылган саннар кулланыла. Үлчәнгән белешмә коэффициентлары тулы шартлары белән сылтама бирелгән спектраль белешмәлектә китерелә, ә нигездәге агрегатлашу тикшеренүе PMID 33251415 астында индексланган.