EMB агарында E. coli һәм башка колонияләрнең күренешен бәяләү

Студент билгесез үрнәкне эозин-метилен зәңгәре агарына штрихлап чәчә, төн буе инкубацияли һәм икенче көнне яшел ялтыравыклы карасу колонияләр үскән тәлинкәне күрә. Дәфтәренә ул «E. coli, расланды» дип яза. Бу язма тәлинкә күрсәтә алганнан күбрәкне раслый. Тәлинкә билгеле шартлардагы үсү һәм ферментация фенотибын күрсәтә. Төрне билгеләү — аерым дәлилләр таләп итә торган аерым нәтиҗә.

Бу кулланмада EMB агары нәтиҗәләрен аңлату мәсьәләсе карала. Анда төп принцип аңлатыла, контроль үрнәкләр белән бергә тәлинкәләрнең иллюстратив атласы тәкъдим ителә һәм дәреслектәге күренешнең кайчан ялгыш нәтиҗәгә китерә алуы күрсәтелә.

Тәлинкә нигезендәге принцип

EMB агары — бер үк вакытта сайлап үстерүче һәм аерып күрсәтүче мохит. Эозин Y һәм метилен зәңгәре буягычлары күп кенә Грам-уңай организмнарның үсүен тоткарлый, шуңа күрә мохит Грам-тискәре организмнарның үсүенә өстенлек бирә. Шул ук буягычлар индикатор вазифасын да үти: организм мохиттәге шикәрне ферментацияләп, үз тирәсендә җитәрлек күләмдә кислота барлыкка китергәндә, колония буягычны күпләп сеңдерә һәм куе шәмәхәдән зәңгәрсу-карага кадәр төс ала. Кислота көчле барлыкка килгәндә, колония өслегендә металлсыман яшел төс уйнавы күренергә мөмкин. ASM оешмасының эозин-метилен зәңгәре агарлы тәлинкәләр өчен протоколы сайлап үстерү һәм аерып күрсәтүнең бу берләшмәсен тасвирлый һәм укыту өчен эталон фотосурәтләр бирә.

Теләсә кайсы нәтиҗәне бәяләгәнче бер мөһим детальне тикшерергә кирәк: нинди составтагы мохит кулланыла? Элекке Holt Harris Teague составында лактоза да, сахароза да бар, ә Levine EMB составында лактоза гына бар. Лактозаны түгел, ә сахарозаны ферментацияләүче организм, мәсәлән, күп кенә Serratia marcescens изолятлары, бу ике вариантта төрлечә күренергә мөмкин. EMB мохитләре җитештерүчесенең документларында бу состав аермасы ачык күрсәтелгән. Дәфтәрдә нәтиҗә белән бергә җитештерүчене һәм мохит составын да язып куегыз.

Әзер, чәчелмәгән EMB агары гадәттә кызылсу-көрәннән кызгылт-шәмәхәгә кадәр төстә була, кайчак яшелсу төсмере яки вак утырмасы була. Бу фон төсе үсүне аңлатмый. Һәр бәяләүне чәчелмәгән тәлинкә яки документларда күрсәтелгән башлангыч күренеш белән чагыштырыгыз; укыту протоколында башкача күрсәтелмәсә, беренчел тәлинкәне 35–37 C температурада якынча 18–24 сәгать аэроб инкубациядән соң бәяләгез. Озайтылган инкубация ферментация күренешен үзгәртә ала.

Тәлинкәне ничек карарга

Ике төрле яктырту кулланыгыз. Башта тәлинкәне чагылган яки яннан төшкән яктылыкта карагыз һәм авыштырыгыз: металлсыман ялтыравык төс уйнавы белән аерылып тора, һәм карау почмагына карап күренергә яки югалырга мөмкин. Аннары колония төсен һәм карасу үзәкләрен бәяләү өчен тәлинкә аша үткән яктылыкта карагыз. Яхшы аерылган колонияләр белән эшләгез, чөнки тыгыз үсү һәм күрше колонияләр тирә-яктагы кислота туплануын үзгәртә һәм төсне зәгыйфьләндерергә яки көчәйтергә мөмкин. ASM сурәтләр җыелмасы моны турыдан-туры күрсәтә: катнаш культурада E. coli көтелгән ялтыравыгын югалтырга мөмкин, чөнки тирәдәге организмнар кислоталы мохитне үзгәртә.

Күнегү мөмкинлек биргәндә контроль үрнәкләрне дә кулланыгыз. Укытуда еш кулланыла торган җыелмага зәңгәрсу-кара төс һәм металлсыман ялтыравык фенотибы өчен E. coli ATCC 25922, төссез фенотип өчен Salmonella Typhimurium ATCC 14028 яки Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 кебек ферментацияләми торган организм, шулай ук үсүне тоткарлау контроле өчен Enterococcus faecalis яки Staphylococcus aureus кебек Грам-уңай организм керә; болар EMB мохитләре өчен стандарт сыйфат контроле таблицаларында күрсәтелгән. Әгәр уңай контрольдә ялтыравык булмаса, билгесез үрнәккә шикләнер алдыннан инкубация шартларын, тыгыз үсүне яки мохит составын тикшерегез.

Тәлинкәләрнең иллюстратив атласы

Түбәндәге тәлинкәләр — ясалган иллюстрацияләр, чын культураларның фотосурәтләре түгел. Алар аерым бер штаммның төгәл төсмерен түгел, ә нәрсәгә игътибар итәргә кирәклеген күрсәтә. Аларны ASM эталон фотосурәтләре һәм укыту лабораториясендәге чын тәлинкәләр белән чагыштырыгыз.

Тәлинкә 1: EMB агарында Escherichia coli — лактозаны көчле ферментацияләүче организм

EMB агарында E. coli гадәттә куе шәмәхәдән зәңгәрсу-карага кадәр төстә була, еш кына карасу үзәге һәм кислота көчле барлыкка килүдән металлсыман яшел ялтыравыгы була. Бу ялтыравык — студентлар эзләгән танылган билге, ләкин аны билгеләмә итеп түгел, ә өстәмә дәлил итеп карагыз. Ялтыравык көче штаммга, инкубация вакытына, колонияләр тыгызлыгына һәм карау почмагына карап үзгәрә. Ялтыравык булмау E. coli булуын кире какмый, ә ялтыравыксыз карасу колония башка берничә ферментацияләүче организмга да ишарә итә. Алдагы эш өчен тыгыз үскән секторны бәяләү урынына яхшы аерылган колонияне сайлагыз.

Тәлинкә 2: EMB агарында Klebsiella pneumoniae — лайлалы колонияләр барлыкка китерүче ферментацияләүче организм

EMB агарында Klebsiella pneumoniae гадәттә алсу-шәмәхәдән көрәнсу-шәмәхәгә кадәр төсмерле эре, ялтырап торган, лайлалы колонияләр барлыкка китерә; аларның үзәкләре еш кына карасу була, әмма көчле металлсыман ялтыравык гадәттә булмый. Охшаш морфология Enterobacter кебек якын ферментацияләүче организмнарда да очрый. Лайлалы текстура һәм колония зурлыгы да бәяләүгә керә: кечкенә һәм яссы алсу колония эре, гөмбәзсыман лайлалы колониягә караганда башкача мәгънәгә ия. E. coli очрагындагы кебек үк, тәлинкә ферментация фенотибын фаразларга мөмкинлек бирә, ә төр дәрәҗәсендә исемләү өчен түбәндә тасвирланган биохимик раслау кирәк.

Тәлинкә 3: EMB агарында Salmonella һәм башка ферментацияләми торган организмнар — төссез колонияләр

EMB агарында Salmonella һәм лактозаны ферментацияләми торган охшаш организмнар, шул исәптән Shigella һәм күп кенә Pseudomonas изолятлары, гадәттә төссез, ярым үтә күренмәле яки тонык гәрәбә төсендәге колонияләр булып үсә. Кайбер составлар һәм шартлар зәгыйфь алсу төсмер бирә, шуңа күрә тонык алсу колония автоматик рәвештә ферментацияләүче организм дигән сүз түгел. EMB Salmonella организмнарын Shigella яки башка ферментацияләми торган организмнардан аермый; бу аерма соңрак үткәрелә торган тестлар белән билгеләнә. Шулай ук E. coli колонияләренә охшаган металлсыман колонияләр барлыкка китерүче лактоза-уңай Salmonella штаммнары теркәлгәнен дә истә тотыгыз: бу бер тәлинкә генә мәсьәләгә нокта куя алмавының тагын бер сәбәбе.

Тәлинкә 4: Serratia marcescens һәм мохит составыннан туган ялгышлык

Serratia marcescens аерым бүлеккә лаек, чөнки студентлар еш кына кызыл колонияләр көтә һәм шуңа күрә тәлинкәне дөрес бәяләми. Күпчелек клиник изолятлар лактозаны ферментацияләми, шуңа күрә Levine EMB мохитендә алар гадәттә тонык яки зәгыйфь буялган булып күренә. Күп кенә изолятлар сахарозаны ферментацияләгәнгә, сахарозалы состав карасурак яки кислота барлыкка килү белән көчлерәк бәйле реакция бирергә мөмкин. 35–37 C температурада классик кызыл продигиозин пигментын да көтмәгез; инкубатор температурасында пигментның барлыкка килүе тотрыклы түгел. Протоколда EMB агарындагы Serratia marcescens турында әйтелсә, бу раслауның нинди составны күздә тотуын тикшерегез. Serratia метаболизмына күзәтү бу ялгышлык нигезендәге лактоза-тискәре һәм сахароза буенча үзгәрүчән күренешне гомумиләштерә.

Тәлинкә 5: контроль үрнәкләр һәм үсүе тоткарланган организмнар

Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus һәм Bacillus кебек Грам-уңай организмнарның үсүе EMB агарында гадәттә тоткарлана яки шактый кими, әмма бу тоткарлау һәр штамм өчен дә абсолют түгел. Контроль үрнәкләр җыелмасы бәяләүне нигезле итә: E. coli контроле зәңгәрсу-кара төс һәм ялтыравык белән яхшы үсәргә, ферментацияләми торган организм контроле төссез үсәргә, ә үсүне тоткарлау контроле аз үсәргә яки бөтенләй үсмәскә тиеш. Әгәр үсүне тоткарлау контроле яхшы үссә, сайлап үстерү этабы эшләмәгән, һәм шул партиядәге башка барлык бәяләүләр дә шикле. Буяу ысуллары культура мохитләреннән башка сорауга җавап бирә; лабораториядә предмет пыяласын буяу турында метилен зәңгәре белән буяу атласын карагыз.

Чикләрне исәпкә алган чагыштыру

Ялгыш нәтиҗәгә китерә торган күренешләрне өч җөмлә белән гомумиләштереп була. Карасу төс E. coli дигән сүз түгел, чөнки Klebsiella, Enterobacter һәм башка ферментацияләүче организмнар ялтыравыксыз карасу үзәкләр барлыкка китерә. Алсу төс Klebsiella дигән сүз түгел, чөнки уртача яки акрын ферментацияләүче организмнар һәм гадәттә ферментацияләми дип саналган кайбер организмнар алсу яки ачык шәмәхә булып күренә. Ялтыравык E. coli төгәл расланган дигән сүз түгел, чөнки аны башка көчле ферментацияләүче организмнар да барлыкка китерә ала. Укыту протоколы һәм андагы катнаш культура сурәтләре бу ялгышлыкларның һәрберсен күрсәтә.

Раслау чикләре

EMB агары төрне түгел, ә фенотипны күрсәтә. Төрле организмнарның колонияләре бер үк күренешкә ия булырга мөмкин, ә бер организмның күренеше штаммга, яшенә, тыгыз үсүгә, мохит составына һәм инкубациягә карап дәреслектәге сурәттән аерылырга мөмкин. Шуңа күрә укыту һәм клиник эш тәртипләрендә EMB морфологиясе фараз өчен нигез итеп карала.

Студент өчен нигезле эш тәртибе түбәндәгечә: аерылган колонияне тасвирларга (зурлык, төс, үзәк, яннан төшкән яктылыктагы ялтыравык, лайлалы характер), мохит составын, инкубация вакытын һәм температурасын, контроль үрнәкләрне теркәргә; аннары теләсә кайсы раслау тесты алдыннан яхшы аерылган колонияне саф культура алу өчен яңадан чәчәргә. Гадәти алдагы тикшерүләргә E. coli һәм колиформ бактерияләрне фаразлап билгеләү өчен Грам буенча буяу һәм IMViC реакцияләре, эчәк организмнары өчен TSI яки KIA һәм организмга хас биохимик тестлар җыелмалары керә; бурыч таләп иткәндә серологик, MALDI TOF яки башка валидацияләнгән идентификация ысуллары кулланыла. EMB мохитенең эчәк организмнары өчен сайлап үстерүче һәм аерып күрсәтүче мохитләр арасында урыны турында белү өчен эчәк организмнарын үстерү мохитләренә кереш материалларны һәм Грам буенча буяу белән алдагы тикшерүне карагыз. Предмет пыяласындагы зәңгәр буяу нәрсәне раслый ала һәм нәрсәне раслый алмый дигән бәйле сорауда метилен зәңгәре белән буяу атласы шул ук принцип буенча күзәтүне нәтиҗәдән аерып карый.

Башта күзәтүне, аннары нәтиҗәне языгыз. «Levine EMB мохитендә 24 сәгатьтән соң карау почмагына бәйле яшел ялтыравыклы карасу зәңгәрсу-кара колонияләр; лактозаның көчле ферментациясенә туры килә» — нигезле язма. «E. coli, расланды» дигән язма исә тәлинкә үзе генә бирә алмаган раслау этабын таләп итә.