Metilen mavisi ve ATP: daha fazla oksijen kullanımı daha fazla enerji demek mi?

İzole edilmiş bir mitokondri, yakıt bulunan ancak ADP bulunmayan bir haznededir. Oksijeni yavaşça tüketir. ADP eklendiğinde oksijen tüketimi birkaç kat artar. ADP tükenene kadar beklendiğinde oksijen tüketimi yeniden düşer. Yakıt hiç değişmemiştir. Değişen tek şey ATP talebidir.

Bu kısa süreç, makalenin ele aldığı ayrımın tamamını içerir. Oksijen tüketimi, elektronların solunum zinciri boyunca oksijene ne kadar hızlı aktığını ölçer. ATP üretimi ise bu akışın ne kadarının kullanılabilir enerji olarak depolandığını ölçer. İkisinin ortak bir ara basamağı vardır: mitokondrinin iç zarı boyunca oluşan proton gradyanı. Bu gradyanın ATP sentezine ne kadar sıkı kenetlendiğini değiştiren herhangi bir etken, iki ölçüm sonucunu farklı yönlere taşıyabilir. Metilen mavisi bu ayrımı anlamak için yararlı bir örnektir; çünkü her iki davranışı da göstermiştir: bazı preparatlarda ATP ile birlikte oksijen kullanımını artırırken, diğerlerinde ATP sabit kalmasına veya azalmasına rağmen oksijen kullanımını artırmıştır.

Önce elektron aktarımının genel çerçevesini görmek isteyen okuyucular, metilen mavisinin solunum zinciri boyunca elektronları nasıl taşıdığıyla başlayabilir. İlk oksijen deneylerinde kullanılan terimleri öğrenmek isteyenler ise ilk solunum ölçümlerinin gerçekte ne gösterdiğini okuyabilir.

Solunum, ATP ve aralarındaki gradyan

NADH ve FADH2 kaynaklı elektronlar zincire kompleks I ve II üzerinden girer, kompleks III üzerinden sitokrom c'ye, ardından kompleks IV üzerinden oksijene geçer. Kompleks I, III ve IV'te açığa çıkan enerji, protonları matriksten zarlar arası boşluğa pompalar. Elektrik yükü ve asitlikte oluşan bu ayrım, proton itici kuvveti oluşturur. Bunun elektriksel bileşeni olan zar potansiyeli, genellikle baskın bileşendir.

ATP sentaz, protonların matrikse geri akmasına izin verir ve açığa çıkan enerjiyi ADP ile fosfatı birleştirerek ATP oluşturmak için kullanır. Dolayısıyla süreç şu sırayla ilerler:

oksijen tüketimi, ardından proton pompalanması, ardından gradyan, ardından ATP sentezi.

Ancak protonlar başka yollardan da geri dönebilir. ATP sentazı devre dışı bırakan her geri dönüş, proton sızıntısıdır. Sızıntı, zar potansiyelini sabit tutmak için zinciri aynı protonları yeniden pompalamaya zorlar. Bu da daha fazla ATP üretmeden daha fazla oksijen tüketilmesine yol açar. Yeterince güçlü bir sızıntı, kenetlenmenin bozulması anlamına gelir: oksijen kullanımı artarken ATP sabit kalır veya azalır, boşa harcanan enerji ise ısı olarak açığa çıkar.

Durum 3, durum 4 ve solunum kontrol oranı

Bu konudaki klasik terminoloji, izole mitokondri çalışmalarından gelir. Durum 3, substrat ve ADP varlığındaki solunumdur: ATP sentaz gradyanı azaltır, zar potansiyeli düşer, zincir gradyanı yeniden oluşturmak için hızlanır ve ATP üretildiği için oksijen kullanımı yüksektir. Durum 4 ise ADP tükendikten sonraki solunumdur: ATP sentazın etkinliği durma noktasına gelir, gradyan yükselir, yüksek zar potansiyeli daha fazla proton pompalanmasına karşı koyar ve oksijen kullanımı yalnızca sızıntıyı telafi etmek için gereken düzeye düşer.

Bu nedenle, durum 3'ün durum 4'e bölünmesiyle hesaplanan solunum kontrol oranı, preparatta solunum ile ATP sentezinin ne kadar sıkı kenetlendiğini gösterir. Yüksek bir oran, ADP'nin solunumu güçlü biçimde kontrol ettiği anlamına gelir. Durum 4 artarken oranın düşmesi, sızıntının baskın hâle geldiğini gösterir. Aşağıdaki metilen mavisi sonuçları bu çerçevede anlam kazanır.

Bir zihinsel modeli akılda tutmak yararlıdır. Yüksek zar potansiyeli zinciri yavaşlatır. Potansiyelin dağılması ise zinciri hızlandırır. Zincir, doğrudan ATP üretilip üretilmediğine değil, proton pompalamanın ne kadar zorlaştığına tepki verir.

Ölçüm sonuçları birlikte değiştiğinde

Kenetlenmenin korunduğu en açık örnek, solunum kompleksleri bloke edilmiş izole kobay beyni mitokondrilerinden gelir. 100 nanomolar ile 1 mikromolar arasındaki metilen mavisi konsantrasyonlarında, yakıt olarak glutamat ve malat, süksinat veya gliserofosfat kullanıldığında dinlenme hâlindeki oksijen tüketimi arttı; ADP ile uyarılan solunum ise değişmedi. Kompleks I veya kompleks III düzeyinde zehirlenmiş mitokondrilerde boya, ATP üretimini sınırlı ölçüde artırdı, zar potansiyelini yeniden sağladı ve kalsiyum alımını iyileştirdi. Önerilen yol bir kestirmedir: boya, blokajın öncesindeki basamaklardan elektronları alır ve hasarlı kompleksi atlayarak sitokrom c'ye aktarır.

İkinci bir birlikte değişim örneğinde, tamamen farklı bir ATP kaynağı kullanılır. ATP sentazı inhibe edilmiş izole beyin mitokondrilerinde metilen mavisi, test edilen her substratta solunumu yine uyardı. Ancak ATP sentezi yalnızca süksinil CoA oluşturan iki substrat olan alfa ketoglutarat ve glutamat kullanıldığında arttı. Oligomisinin ATP sentazı bloke ettiği koşullarda ek ATP, oksidatif fosforilasyondan değil, sitrik asit döngüsünde süksinil CoA ligaz aracılığıyla gerçekleşen substrat düzeyinde fosforilasyondan kaynaklandı. Boya, kompleks I ve ATP sentaz birlikte inhibe edildiğinde de zar potansiyelini yeniden sağladı. Burada oksijen kullanımı ile ATP birlikte değişti, ancak yalnızca substratın ikinci ATP üretim yoluna izin verdiği koşullarda. Süksinat veya malat kullanıldığında solunum arttı, fakat ek ATP üretilmedi. Aynı boya, aynı hazne, farklı yakıt, farklı sonuç.

Ölçüm sonuçları birbirinden ayrıldığında

Sonuçların birbirinden ayrıldığı örnekler de yayımlanmış çalışmalara dayanır ve aynı ölçüde öğreticidir. 1997 tarihli bir izole sıçan karaciğeri mitokondrisi çalışmasında metilen mavisi, süksinatla solunum yapan ve solunum ile ATP sentezi sıkı biçimde kenetlenmiş mitokondrilerde durum 4 solunumunu hızlandırdı. Bu da solunum kontrol oranını düşürdü. Etki 0.5 mikromolardan itibaren gözlendi ve 5 mikromolarda güçlüydü. Bu konsantrasyon, 100 miligramlık intravenöz bolus sonrasındaki plazma düzeylerine yakındır. 5 mikromolarda mitokondriler ayrıca şişti. Ancak kenetlenme bozukluğu önce daha düşük konsantrasyonlarda ortaya çıktı. Bu bulgu, sızıntının yapısal hasardan kaynaklanmak yerine ondan önce başladığını destekler. Kenetlenmesi bozulmuş mitokondrilerde boya, solunumu doygunluğa ulaşabilen ve konsantrasyona bağlı bir biçimde uyardı. Her iki preparatta da oksijen kullanımı arttı. Tüketilen oksijen başına ATP sentezi ise artmadı. Bu, aynı molekülde bir araya gelen, klasik bir kenetlenme bozulması ve elektron taşıma örneğidir.

En çarpıcı ayrışma retinada görülür. AIF eksikliği olan farelerde ve rotenon uygulanmış fotoreseptör hücrelerde metilen mavisi, retina kalınlığını, fotoreseptör belirteçlerini ve mitokondri yapısını korudu. Ayrıca NADH/NAD oranını düşürdü ve katlanmamış protein yanıtı ile mitofaji dâhil stres yolaklarının etkinliğini azalttı. Bunları ATP açığını gidermeden yaptı. Enerji düzeyi yeniden sağlanmadan koruma görülmesi, yararın ek ATP üzerinden değil, redoks dengesi ve mitokondri bütünlüğü üzerinden gerçekleştiğini gösterir. Dokunun canlı kalmasını enerji üretiminin yeniden sağlanmasıyla eş tutan biri, bu deneyi tamamen yanlış yorumlamış olur.

Beyin mitokondrileri üzerine yapılan çalışma, aynı değerlendirmeye bir maliyet boyutu ekler. Biyoenerjetik işlevleri iyileştiren aynı düşük konsantrasyonlar, test edilen her koşulda hidrojen peroksit oluşumunu da artırdı ve giderilmesini yavaşlattı. Bu etkiler, özgül olmayan bir boya yerine kalibre edilmiş bir Amplex testiyle ölçüldü. Daha fazla ATP ve daha fazla oksidan birlikte ortaya çıktı.

Okuma için pratik bir kontrol listesi

Dört soru, kenetlenmenin korunduğu bir sonucu kenetlenmenin bozulduğu bir sonuçtan ayırır.

Birincisi, gerçekte hangi ölçümün yapıldığıdır. Oksijen tüketimi tek başına ATP hakkında bilgi veremez. ATP sentezi, zar potansiyeli ve solunum kontrol oranının her biri, oksijen elektrodunun göremediği bir parçayı ekler. Metilen mavisi araştırmalarındaki iddiaları okuma rehberi, ölçülen sonuçlara odaklanan bu yaklaşımı ayrıntılı olarak ele alır.

İkincisi, mitokondrileri hangi substratın beslediğidir. Süksinil CoA sonucu, yakıt seçiminin ek solunumun ek ATP'ye dönüşüp dönüşemeyeceğini belirleyebildiğini gösterir.

Üçüncüsü, hangi konsantrasyonun kullanıldığıdır. Beyin mitokondrilerinde nanomolar ile düşük mikromolar aralığındaki metilen mavisi, oksidan oluşumu pahasına sınırlı biyoenerjetik kazanımlar sağladı; karaciğer mitokondrilerinde yarım mikromolar ve üzeri konsantrasyonlar kenetlenmeyi zayıflattı; 5 mikromolarda bunlara şişme de eklendi. Konsantrasyon, arka plandaki bir ayrıntı değil, mekanizmanın bir parçasıdır.

Dördüncüsü, sonucun hangi modelde elde edildiğidir. İzole mitokondriler, sistemin bağlantılarını ortaya koyar. Ancak bütünlüğü korunmuş hücre ve dokularda taşıma, renksiz forma indirgenme ve elektronları almak için rekabet eden diğer yollar da devreye girer. Konsantrasyonun ve protokolün metilen mavisinin etkilerini nasıl şekillendirdiği dâhil laboratuvar dozlama çalışmaları, haznede ölçülen değerler ile bir insan hakkında öne sürülen herhangi bir iddia arasındaki köprüdür.

Oksijen tüketimi elektron akışını gösterir. ATP ise bu akışın ne kadarının enerji olarak depolandığını gösterir. Metilen mavisi bunların her birini değiştirebilir. Yukarıdaki deneyler, ortaya çıkan dört kombinasyonun tamamını gösterir: ikisi de artar, solunum yalnızca substratın izin verdiği koşullarda ATP artışıyla birlikte yükselir, kenetlenme zayıflarken solunum artar ve ATP sabit kalırken doku korunur. Oksijen elektrodundaki sayı, yorumlamanın sonu değil, başlangıcıdır.