Metilen mavisi ve Bartonella: laboratuvar bulguları ve klinik kanıtların sınırları

Bir kültür kabı ile bir hasta için aynı sözcük kullanılır: enfeksiyon. Ancak bu sözcük iki durumda aynı kavramı ifade etmez. Kültür kabında enfeksiyon, agar üzerindeki kolonilerin sayısıdır. Hastada ise hücrelerin ve damarların içindeki bakterileri, kan ve dokularda taşınan ilaçları ve işin bir kısmını üstlenen bağışıklık sistemini kapsar. Bu ikisini birbirine karıştırırsanız, çarpıcı bir laboratuvar sonucu bir tedavi gibi görünmeye başlar. Ayrı tutarsanız, aynı sonuç gerçekte olduğu şeye dönüşür: bir sonraki deneyi yapmak için bir gerekçe.

Metilen mavisi ve Bartonella hakkındaki bu incelemenin temel amacı bu ayrımı korumaktır. Aynı araştırma grubunun iki laboratuvar çalışması, metilen mavisini çoğalmayan durumdaki Bartonella henselae'ye karşı test etti. Her ikisi de cam ve plastik kaplarda güçlü aktivite bildirdi. Hiçbiri insanlarda test yapmadı.

Araştırmacılar neden durağan fazı test eder?

Antibiyotik testlerinin çoğunda çoğalan hücreler kullanılır. Bu model daha zorlu bir durumu gözden kaçırır: bölünmeyi bırakmış ve çoğalan türdeşlerini öldüren ilaçlara tolerans gösteren hücreler.

Bartonella, eritrositlerin ve endotel hücrelerinin içi de dahil olmak üzere vücutta varlığını sürdürebilir. Bu nedenle araştırma grubu, B. henselae durağan faza girdikten sonra hangi onaylı ilaçların onu öldürebildiğini araştırdı. Çoğalan hücrelere karşı düşük bir MIC, durağan fazdaki hücrelerin öldürülmesini öngörmüyordu. Rifampinin MIC değeri çok düşük olmasına rağmen durağan hücreleri öldürme gücü zayıftı; daha yüksek MIC değerlerine sahip bileşikler ise bu hücreleri etkili biçimde öldürüyordu. Bu tür makaleleri değerlendirmek için genel bir yöntem arayan okuyucular, metilen mavisi araştırmalarını okuma rehberine başvurabilir.

İlk tarama: Li ve çalışma arkadaşları, 2019

Antibiotics dergisindeki 2019 durağan faz taramasında tek bir suş, B. henselae JK53, kullanıldı. Bu suş, yüzde 10 fetal sığır serumu içeren Schneider besiyerinde, 37 C'de ve yüzde 5 CO2 ortamında yetiştirildi. Bir günlük kültürler çoğunlukla dağınık haldeki bölünen hücrelerden oluşuyordu. mL başına yaklaşık 10 üzeri 8 koloni oluşturan birim içeren beş günlük kültürler durağan faz olarak kabul edildi ve görünür kümeler içeriyordu.

Testte propidyum iyodür ile birlikte SYBR Green I kullanıldı; test, canlı ve izopropanolle öldürülmüş hücrelerin karışımlarına göre kalibre edildi. Metilen mavisi yoğun renkli olduğundan, taramada aktif bulunan bileşikler mikroskopiyle, ardından daha sıkı bir sonlanım ölçütü olan kanlı agardaki koloni sayımlarıyla doğrulandı.

50 mikromolar konsantrasyonda taranan 1,581 onaylı ilaç arasında metilen mavisi, plaka okuyucusuna göre yüzde 16, mikroskopiye göre yüzde 25 canlılık bıraktı. Daptomisin için bu değer yüzde 21, çeşitli azoller için yüzde 22 ile 27, gentamisin için yüzde 32, eritromisin için yüzde 66 ve siprofloksasin için yüzde 74 idi. Pirvinyum pamoat, okuyucuda daha güçlü görünüyordu; ancak kendi floresansı nedeniyle mikroskopiyle değerlendirilemedi.

Çoğalan B. henselae'ye karşı metilen mavisinin MIC değeri mL başına 0.08 ile 0.16 mikrogramdı. Beş günlük durağan hücrelerde, mL başına 5 mikrogram konsantrasyonda bir günlük maruziyetin ardından saptanabilir koloni kalmadı. Bu sonuç, test edilen konsantrasyonlardaki daptomisin ve pirvinyum pamoatla aynıydı. Ayrı bir zamana bağlı öldürme deneyinde mL başına 10 mikrogram kullanıldı. Bunlar doz değil, laboratuvar maruziyet düzeyleridir ve makale de bunları böyle tanımlar. Makalede atıf yapılan, insanlarda mL başına yaklaşık 3.9 mikrogramlık doruk plazma değeri yalnızca arka plan bilgisi olarak yer alır. Metilen mavisinin farmakokinetiğine genel bakış, bir plazma değerinin neden doku değeri olarak yorumlanamayacağını açıklar.

Makalede iki sınırlama açıkça belirtilmiştir. Biyofilm modeli kullanılmamış ve metilen mavisi kombinasyonları test edilmemiştir. Beş günlük kümeler, durağan sıvı kültürdeki hücre kümeleriydi; doğrulanmış bir biyofilm deneyinin parçası değildi. Yazarlar hayvan çalışmalarına, kombinasyon çalışmalarına, biyofilm çalışmalarına ve diğer Bartonella türlerinde testlere ihtiyaç olduğunu belirtti.

Kombinasyonlar ve biyofilmden elde edilen hücreler: Zheng ve çalışma arkadaşları, 2020

BMC Microbiology dergisindeki 2020 takip çalışması aynı suşu ve besiyerini kullandı; ancak altı günlük durağan kültürlere geçti ve ilk makalede bulunmayan iki unsuru ekledi: iki ilaçlı kombinasyonlar ve biyofilmden elde edilen hücre modeli.

Tek ilaçların tümü 24 saat boyunca mL başına 5 mikrogram konsantrasyonda test edildiğinde metilen mavisi, mL başına yaklaşık 2.8 çarpı 10 üzeri 10 koloni oluşturan birim içeren kontrole karşı mL başına 3.2 çarpı 10 üzeri 4 koloni oluşturan birim bıraktı. Siprofloksasin, gentamisin ve nitrofurantoin aynı zaman noktasında daha az koloni bıraktı. Bu, aynı nominal düzeyde bir gün sonra saptanabilir koloni kalmayan 2019 sonucundan farklıdır. Kültürün yaşı, yoğunluğu ve işlenişi farklı olduğundan, öldürücü etki yön açısından tekrarlanabilir olsa da büyüklük açısından aynı değildi. Deneyler arasındaki bu değişim, standart güvenlik ve etkileşim kontrollerinde laboratuvar etkinliğinin klinik etkiden ayrı ele alınmasının nedenlerinden biridir.

Kombinasyon taraması, çalışmanın en çok alıntılanan bölümüdür. Her bileşenin konsantrasyonu mL başına 5 mikrogramda sabit tutuldu. Hem azitromisin artı metilen mavisi hem de rifampin artı metilen mavisi ile 24 saatte saptanabilir durağan faz kolonisi kalmadı. Siprofloksasin içeren iki kombinasyonda da aynı sonuç görüldü; test edilen 25 ikili kombinasyon arasında yalnızca bu dördü bu sonucu verdi. Sistematik bir sinerji analizi yapılmadığından, doğru ifade kanıtlanmış sinerji değil, bu koşullar altında aktif kombinasyondur.

Biyofilm deneyinde, bozulmuş genç bir biyofilmden alınan hücreler test edildi; sağlam, olgun bir biyofilme nüfuz etme değerlendirilmedi. Kültürler beş gün yetiştirildi, seyreltilerek kuyucuklu plakalara aktarıldı ve beş gün daha yetiştirildi. Biyofilm oluşumu kristal viyole boyamasıyla doğrulandı; ardından ilaç maruziyetinden önce kazınarak toplandı. mL başına 5 mikrogram konsantrasyonda tek başına metilen mavisi, 6. günde sayıyı 2.3 çarpı 10 üzeri 2'ye düşürdü. Bu, tek ilaçlar arasındaki en iyi sonuçlardan biriydi, ancak sıfır değildi. Metilen mavisi içeren iki kombinasyon da 6. günde sıfıra ulaştı; siprofloksasin içeren iki kombinasyonda da aynı sonuç görüldü.

Yazarlar, dikkatli bir okuyucunun da fark edeceği sınırlamaları vurguladı: eski ve sağlam bir biyofilm yerine genç, kazınmış bir biyofilm; her ilacın kendi gerçekçi doruk konsantrasyonu yerine tüm ilaçlar için pratik olarak seçilmiş tek bir konsantrasyon; yalnızca azitromisin veya rifampin etrafında seçilmiş ikili kombinasyonlar; tek bir suş; hayvan ve hasta verisinin bulunmaması. Daha sonra üç ilaçlı çalışmalar önerildi, ancak sonuçları bildirilmedi.

Çalışma tasarımlarının karşılaştırılması

Bu tablo, makalenin ana fikrini özetler. Son sütunun solundaki her şey kültür çalışmasıdır. İki makalenin hiçbirindeki veriler son sütunda yer almaz.

Bartonella, Borrelia değildir

Her iki makale de Lyme hastalığına neden olan spiroket Borrelia burgdorferi'den söz eder. Bunun nedeni, boya testinin aynı laboratuvarda daha önce yapılan Borrelia durağan faz çalışmalarından gelmesidir; bu çalışmalarda metilen mavisi ve daptomisin de aktif bulunmuştu. Bu geçmiş, yararlı bir bağlam sağlamakla birlikte sık karşılaşılan bir hata kaynağıdır.

Bartonella makalelerinin hiçbirindeki deneyde Borrelia ile Bartonella yan yana test edilmemiştir. Organizmalar, besiyerleri ve konsantrasyonlar farklıdır. Metilen mavisinin Bartonella'da varsayılan zar etkisi de daha fazla araştırma gerektiren bir spekülasyon olarak sunulmuştur. Sonuçlar bir türden diğerine aktarılmamalıdır ve iki makale de parazitlere ilişkin geniş kapsamlı iddiaları desteklemez. Borrelia ve Bartonella persister hücrelerinin karşılaştırılması, bu nedenle iki literatürü ayrı tutar.

Kültür sonuçları neden bir protokole dönüşmez?

Metilen mavisi ve Bartonella için bir protokol arayışına duyulan ilgi anlaşılabilir. Bu makaleler, söz konusu ifadenin neden bir alışveriş listesi değil, bir uyarı işareti olarak ele alınması gerektiğini gösterir.

İlk olarak, bir kuyucuktaki mL başına 5 mikrogram konsantrasyon bir reçete değildir. Bu değere ilişkin emilim, dağılım, proteinlere bağlanma, hücre içine nüfuz etme veya tolere edilebilirlik bilgisi yoktur. Yazarlar bu değeri, antibiyotiklerin doruk konsantrasyonlarının kabaca bir ortalaması olarak seçmiş ve gelecekteki çalışmalarda her ilacın kendi gerçekçi düzeyinde kullanılması gerektiğini belirtmiştir.

İkinci olarak, sıfır koloni, dokunun steril olduğu değil, söz konusu ekim koşullarında koloni saptanmadığı anlamına gelir. Persister hücreler, hücre içi bakteriler ve örnekleme sınırlamaları agar plağının kapsamı dışındadır.

Üçüncü olarak, bir kuyucuğu steril hale getiren kombinasyonlar vücutta başarısız olabilir veya zarar verebilir. Azitromisin artı metilen mavisi ve rifampin artı metilen mavisi, laboratuvar maruziyet düzeylerinde test edilmiş laboratuvar kombinasyonlarıdır. Hayvan farmakokinetiği ve kontrollü insan verileri olmadan belirlenmiş bir doz, süre veya yarar-risk oranı yoktur. Seçenekleri değerlendiren herkes, kültür kabı verilerinden herhangi bir sonuç çıkarmadan önce bunları bir hekimle görüşmeli ve metilen mavisi kullanımının hangi durumlarda tıbbi gözetim gerektirdiğini incelemelidir.

Bu makalelerin desteklediği dar kapsamlı sonuç şudur: Metilen mavisi, iki ilaçlı laboratuvar kombinasyonları da dahil olmak üzere, çoğalmayan B. henselae JK53'e karşı in vitro ortamda tekrarlanabilir aktivite gösterir. Kombinasyonlar ve biyofilmden elde edilen hücreler açısından en güçlü sonuçlar 2020 çalışmasından gelmektedir. Bu aktivitenin insanlardaki bartonelloz açısından önem taşıyıp taşımadığı dahil, bunun dışındaki her şey henüz test edilmemiştir.