Metilen mavisinin absorpsiyon spektrumu ve molar absorptivitesi: koşulları belirtilmiş bir başvuru kaynağı

Metilen mavisi spektrumu, içindeki bir sayıyı başka bir ölçümde kullanmaya çalışana kadar basit görünür. Bir laboratuvar yaklaşık 82,000 değerinde bir molar ekstinksiyon katsayısı bildirir. Bir başkası 67,000 bildirir. Üçüncüsü ise 100,000 üzerinde bir değer bildirir. Üçü de kendi ölçümlerini doğru biçimde tanımlıyor olabilir; ancak hiçbiri boya için evrensel bir sabit değildir.

Karışıklık, iki farklı kavramın birbirine karıştırılmasından kaynaklanır. Absorbans, belirli bir çözeltinin belirli bir küvette ölçülen değeridir. Genellikle epsilon ile gösterilen molar absorptivite ise bu çözeltinin modelindeki bir parametredir. Metilen mavisinin birleşme durumu değiştiğinde model de değişir; dolayısıyla parametre de değişir. Yararlı yaklaşım, her katsayıyı koşulları belirtilmiş bir değer olarak ele almaktır: dalga boyu, çözücü, pH veya tampon, sıcaklık, konsantrasyon aralığı ve optik yol uzunluğu sayıyla birlikte verilmelidir.

Seyreltik sulu çözeltide monomer bandı

Seyreltik sulu çözeltide metilen mavisi katyonunun baskın bandı 664 ila 665 nm yakınındadır; farklı cihazlar ve kalibrasyon tercihleri için genellikle 664 ila 668 nm aralığında bildirilir. Çözelti, boyanın büyük bölümü monomer hâlinde olacak kadar seyreltik olduğunda nicel tayin için doğru seçim bu banttır.

Literatürdeki üç değer, koşulların neden öne çıkarılan sayıdan daha önemli olduğunu gösterir. Sulu örnekleri 1 cm küvetlerde yaklaşık 7 micromolar altında tutan kil araştırmacıları, 665 nm'de yaklaşık 82,000 M-1 cm-1 epsilon değeri bildirmiştir. Bu değer, çok seyreltik sulu örnekler için deneysel bir kalibrasyon eğimi olarak alışılmadık derecede iyi belgelenmiştir. Daha sonra yapılan, 2.34 ila 37.52 micromolar aralığını ve 1 cm optik yolu kullanan bir deiyonize suda birincil kalibrasyon çalışması, toplam boya için 665 nm'de yaklaşık 67,100 M-1 cm-1 vermiştir. Kalibrasyon aralığının üst yarısında zaten kayda değer miktarda dimer bulunduğundan, bu düşük sonuç beklenen bir durumdur; çelişki değildir. 664 nm'de yaklaşık 73,460 M-1 cm-1 olan üçüncü değer ise pH 6.86 ve 293 K koşullarında gözlenen spektrumu monomer ve dimer bileşenlerine ayıran bir çalışmadan gelir; bu çalışma metilen mavisinin fotofiziğine ilişkin yakın tarihli eleştirel derlemede özetlenmiştir. Bu sayı, dekonvolüsyonla ayrıştırılmış monomer bileşenine aittir; absorbansın toplam boya konsantrasyonuna karşı doğrudan eğimi değildir.

Pratik sonuç şudur: koşulları örneklerinizle örtüşen katsayıyı seçin veya kendi kalibrasyonunuzu yapın. 82,000 değerini 30 micromolar fosfat tamponlu bir tayine aktarıp doğrusallığın hâlâ geçerli olduğunu varsaymayın.

Kısa dalga boyundaki omuz bir karışımdır

Konsantrasyon arttıkça, 600 ila 615 nm yakınındaki omuz 664 nm pikine göre büyür. Güncel çalışmalar, H tipi dimer katkısını genellikle 605 ila 610 nm yakınında konumlandırır. Sudaki metilen mavisinin küresel spektral analizi, 664 ve 650 nm'deki monomer rezonans bileşenleriyle birlikte, 607 nm'de bir dimer maksimumunu ve 600 nm'de daha yüksek dereceli bir agregat maksimumunu ayrıştırır. Tam metne PMID 33251415 için açık erişim kaydı üzerinden ulaşılabilir.

Bu omuz, saf dimer absorbansı olarak etiketlenmemelidir. Monomerin vibronik yapısı da aynı bölgeye katkıda bulunur; bu nedenle ölçülen yükseklik, katkıların üst üste binmesidir. Bir küresel uyumlama çalışmasında, monomer ve dimer modelinin 1.1 micromolar ila 3.4 millimolar aralığının tamamında yetersiz kaldığı, tetramer eklenmesinin ise en iyi uyumu sağladığı görülmüştür; tetramer sinyali 34 micromolar altında bile saptanabilmiştir. Uyumlanan bileşenlerin katsayıları yüksektir: tamponlanmamış deiyonize suda, 0 ila 0.15 M sodyum klorür ve 282 ila 333 K sıcaklık koşullarında, ana monomer bileşeni için 664 nm'de yaklaşık 107,800 M-1 cm-1, dimer için 607 nm'de yaklaşık 101,400 ve tetramer için 600 nm'de yaklaşık 138,500. Bunlar modelle ayrıştırılmış bileşenlerdir; dolayısıyla deneysel bir Beer-Lambert eğiminin yerine kullanılmamalıdır.

Dimerleşmenin ne ölçüde gerçekleştiği doğrudan nicelleştirilmiştir. Bir çalışmada, pH 6.86 ve 293 K koşullarında yaklaşık 3,900 M-1 değerinde bir dimerleşme sabiti elde edilmiştir. Bu büyüklük, 5 micromolar çalışma çözeltisinin neden yaklaşık doğrusal davranırken 50 micromolar stok çözeltinin doğrusal davranmadığını açıklar. Yöntem geliştirme sırasında yararlı bir kontrol, 610 nm yakınındaki absorbansın 665 nm yakınındaki absorbansa oranıdır. Bu oran konsantrasyonla birlikte arttığında, 664 nm'deki epsilon artık değişmeyen tek bir türü tanımlamaz.

Birbirine dönüşen tek bir tür çiftinin baskın olduğu konsantrasyon aralığında spektrumlar ortak bir izosbestik noktaya sahip olabilir; sulu çözelti serilerinde bu nokta deneysel olarak 625 nm yakınındadır. Belirgin ve sabit bir nokta, iki baskın türün varlığıyla tutarlıdır. Konsantrasyon arttıkça nokta kayıyor veya kayboluyorsa bunu cihaz hatası olarak değil, daha yüksek dereceli agregatların veya değişen dengelerin devreye girdiğine ilişkin bir uyarı olarak değerlendirin.

Çözücü, pH ve sıcaklık spektrumu değiştirir

Su, birleşmeyi destekler. PMID 30933781 olarak indekslenen su ve DMSO karışımlarında metilen mavisine ilişkin çözücü çalışmasına göre dimetil sülfoksit eklenmesi dimerleşmeyi baskılar, absorpsiyon ve floresans maksimumlarını daha uzun dalga boylarına kaydırır ve floresans kuantum verimini yaklaşık dört kat artırır. Bu çalışma, sulu çözelti spektrumlarını 650 ila 670 nm yakınında monomer absorbansı ve 580 ila 615 nm yakınında dimer absorbansı içeren bir monomer-dimer dengesi olarak ele alır ve 293.15 K'de kaydedilen spektrumlardan dimerleşme sabitlerini türetir.

Alkoller hem konumu hem de görünür bant şiddetini değiştirir; ancak agregasyonu ortadan kaldırmaz. Metilen mavisine ilişkin bir çözücü çalışmasında bildirilen, 31.3 micromolar ve oda sıcaklığında yapılan bir birincil karşılaştırmada, uzun dalga boyu maksimumu suda 665 nm, metanolde ise 655 nm bulunmuştur; çözeltinin tamamı için görünür değerler suda yaklaşık 37,100, metanolde ise 60,800 olmuştur. 298 K'de mutlak etanolde yapılan ayrı bir doğrulama, yaklaşık 68,000 epsilon değeriyle 655 nm'de bir maksimum vermiştir.

Olağan pH değişimleri, spektrumu birçok protokolün varsaydığından daha az kaydırır. Yukarıda atıf yapılan eleştirel derleme, yaklaşık pH 2 ile pH 12 arasında maksimumun 665 nm yakınında kaldığını ve pH 11'e kadar bant şiddetinde yalnızca küçük değişiklikler olduğunu bildirir. Tamponun türü ve iyonik şiddet, sonuçları nominal pH kadar değiştirebilir; bu nedenle yalnızca pH metre okumasını değil, kullanılan tamponu ve tuzu da kaydedin. Kuvvetli asit veya kuvvetli alkali ayrı bir durumdur; çünkü boya tersinir birleşme yerine kimyasal değişime uğrayabilir. Sıcaklık ve tuz da dengeyi kaydırır; 2020 tarihli su çalışmasında her ikisinin de bilinçli olarak değiştirilmesinin nedeni budur.

Sayının geçerliliğini koruyacak şekilde ölçüm yapmak

Nicel çalışmalar, absorbansın epsilon, konsantrasyon ve optik yol uzunluğunun çarpımına eşit olduğunu belirten Beer-Lambert bağıntısına ve doğrusal aralığın sizin koşullarınızda gerçekten geçerli olduğunun kanıtlanmasına dayanır.

Düşük micromolar düzeyindeki çalışmalar için 1 cm küvet kullanın. Epsilon yaklaşık 82,000 olduğunda, 5 micromolar yaklaşık 0.41 absorbans, 10 micromolar ise yaklaşık 0.82 absorbans verir. Katkısız suda monomere odaklanan ölçümler için yaklaşık 5 ila 7 micromolar düzeyinde veya altında kalmak, onlarca micromolar düzeyine uzanan bir kalibrasyondan daha güvenlidir. Konsantre stok çözeltiler için, 1'in çok üzerindeki absorbansı kabul etmek yerine optik yolu kısaltın.

Kör ölçümü aynı matriksle yapın: aynı kalitede su, aynı yardımcı çözücü oranı, aynı tampon ve tuzlar; yalnızca boya olmamalıdır. Kalibrasyon çözeltilerini aynı matrikste ve aynı sıcaklıkta hazırlayın. Geliştirme sırasında tek bir dalga boyunda okumak yerine görünür bölgenin tamamını, ideal olarak yaklaşık 550 ila 750 nm aralığını tarayın. Yalnızca yüksekliği değil, şekli de izleyin. Seri seyreltme normalize edilmiş şekli değiştiriyorsa, sistem kimyasal açıdan konsantrasyona bağımlıdır. Sabit bir maksimum ve sabit bir 610 ila 665 nm absorbans oranı, kabul edilebilir bir aralık için tek başına yüksek bir R kare değerinden daha güçlü kanıtlardır.

Reaktifin formunu belgeleyin. Ticari ürün susuz metiltiyoninyum klorür veya trihidrat gibi bir hidrat olabilir; bu nedenle stok çözelti hesaplamalarında kullanılan molar kütle, şişedeki gerçek ürünle eşleşmelidir. Bu adım tek başına, laboratuvarlar arasındaki nominal molar konsantrasyon farklılıklarının bir bölümünü açıklar. Sonuçlar nicel tayin hesaplamalarında kullanıldığında, spektrumlar formülasyon stabilitesi kontrollerini desteklediğinde ve safsızlık profilleri saflık ile spesifikasyon incelemesi gerektirdiğinde de benzer bir titizlik gerekir.

Koşulları belirtilmiş özet

Bu tabloyu, birbirinin yerine kullanılabilecek sabitlerin kaynağı olarak değil, laboratuvar kaydı için başlangıç şablonu olarak kullanın.

Dolayısıyla metilen mavisinin absorbans dalga boyu, uzun bir dipnot gerektiren kısa bir yanıttır. Ölçtüğünüz piki, ölçtüğünüz çözeltide ve ölçtüğünüz konsantrasyonda bildirin. Bu alışkanlık, 664 nm yakınındaki tek bir seyreltik sulu çözelti değerinin yanlış bir evrensel sabite dönüşmesini önler.