EMB agar ve MacConkey agar: besiyeri seçimi ve yorumlama

Bir öğrenci aynı su örneğini iki plağa ekim yapar. Birinde yeşil metalik parlaklığa sahip koyu renkli koloniler belirir. Diğerinde bulanık bir hale ile çevrili parlak pembe koloniler görülür. Her iki plak da aynı tüpten inoküle edilmiş, yan yana inkübe edilmiş ve aynı saatte değerlendirilmiştir. Öğrenci hangi plağın doğru olduğunu sorar.

Her iki plak da doğrudur. Farklı sorulara yanıt verirler. Karışıklık, bu iki besiyerinin bağırsak bakterileri için birbirinin yerine kullanılabilen tarama araçları olarak görülmesinden kaynaklanır. Ortak amaçları Gram negatif enterik organizmaları seçmek ve laktoz fermentörlerini fermentasyon yapmayanlardan ayırmaktır; ancak bu amacı farklı kimyalar ve farklı görsel mantıklarla gerçekleştirirler. Altta yatan iki kavramı gördüğünüzde, plak seçimi ve koloni değerlendirmesi rutin hale gelir.

Kısa yanıt

EMB agar, eosin Y ve methylene blue olmak üzere iki boya kullanır ve bu boyalar iki görevi birden üstlenir: Gram pozitiflerin üremesini baskılar ve güçlü asit üreticilerinin çevresinde çökelerek koyu renkli koloniler oluştururlar; Escherichia coli için klasik görünüm metalik yeşil parlaklıktır. MacConkey agar görevleri ayırır: safra tuzları ve crystal violet Gram pozitifleri baskılar, laktoz fermentasyon için substrat sağlar ve neutral red oluşan asidi pembe veya kırmızı koloniler olarak gösterir. Amaç E. coli için dikkat çekici bir presumptif gösterimse EMB uygundur. Amaç, özellikle dışkı veya idrar iş akışlarında, laktoz fermentörlerini fermentasyon yapmayanlardan net biçimde pembe ve renksiz olarak ayırmaksa MacConkey genellikle daha kolay yorumlanır. Hiçbir plak yalnızca renge bakılarak bir organizmanın kimliğini belirlemez.

EMB: aynı anda seçen ve gösteren boyalar

EMB yaklaşımı, seçicilik ve göstergelik işlevlerini aynı moleküllerde birleştirir. ASM eosin methylene blue agar protokolü, EMB'yi hem seçici hem de ayırt edici olarak tanımlar; boya çifti birçok Gram pozitif organizmayı inhibe ederken laktoz fermentasyonu boya alımını ve çökelmesini tetikler. Standart bir Levine formülasyonu, Levine EMB agar için FDA BAM yönteminde listelendiği üzere pepton, laktoz, fosfat, eosin Y, methylene blue ve agar içerir. Eski EMB reçetelerinde bazen laktoza ek olarak sakkaroz da bulunduğunu, Levine EMB'nin ise sakkaroz içermeden laktoz içerdiğini unutmayın; bu nedenle laboratuvarınızda hangi formülasyonun bulunduğunu kaydedin.

EMB'yi yorumlamak, boyaların davranışını yorumlamak demektir. Güçlü laktoz fermentasyonu, yoğun boya çökelmesini tetikleyecek kadar asit üretir; bunun sonucunda E. coli koyu mavi-siyah merkezlere ve klasik durumda yansıyan ışıkta metalik yeşil parlaklığa sahip olur. Enterobacter ve Klebsiella gibi daha zayıf fermentörler genellikle bu parlaklık olmadan pembe ile mor arasında değişen mukoid koloniler oluşturur. Salmonella, Shigella ve Proteus gibi fermentasyon yapmayanlar, boyaları çökeltecek ani asit üretimini gerçekleştirmedikleri için genellikle renksiz veya yarı saydam koloniler halinde büyür. Gram pozitifler çoğunlukla baskılanır, ancak baskılanma derecelidir ve suşa ve ürüne göre değişir. Methylene blue'nun neden katyonik bir boya olarak davrandığı da dahil olmak üzere ayrıntılı boya hazırlama kimyası, boya formülasyonlarına ilişkin ayrı bir tartışmanın konusudur; genel mikroskopi bağlamı ise boyama yöntemleri atlasında yer alır. Bu makale plak seçimi ve yorumlamaya odaklanmaktadır.

Yukarıdaki şekil açıklama amaçlıdır. Beklenen görsel mantığı gösterir: EMB'de koyu ve parlak koloniler, pembe mukoid tipler ve soluk tipler; MacConkey'de ise pembe ve soluk tiplerin karşılaştırılması. Deseni öğrenmek için bunu kullanın, ardından her değerlendirmeyi fotoğraflanmış kontrollerle ve tezgâhınızdaki tam besiyerine ait ürün prospektüsüyle doğrulayın.

MacConkey: ayrılmış görevler, daha basit görsel kural

MacConkey yaklaşımında her görev ayrı bir bileşene atanır. ASM MacConkey agar protokolü aynı seçici ve ayırt edici çerçeveyi sunar ve MacConkey agar için FDA BAM yöntemi işlevsel bileşenleri listeler: peptonlar, laktoz, safra tuzları, tuz, neutral red, crystal violet ve agar. Safra tuzları ile crystal violet Gram pozitiflere karşı seçicilik sağlar. Laktoz fermentasyon substratını oluşturur. Neutral red pH göstergesi olarak işlev görür ve asit oluşan bölgelerde pembe ile kırmızı arasında renk verir; güçlü fermentörlerin çevresinde bazen safra çökelmesi de görülür.

Yorumlama kuralı özellikle basittir: pembe, laktoz fermentörü anlamına gelir; renksiz veya soluk ise fermentasyon yapmayan anlamına gelir. E. coli pembe ile kırmızı arasında görünür ve çoğu zaman safra çökelme halesi bulunur. Klebsiella ve Enterobacter pembe görünür ve kapsülleri nedeniyle sıklıkla mukoiddir. Salmonella, Shigella, Proteus ve birçok başka Gram negatif basil renksiz görünür. Eğitim laboratuvarlarında ek bir avantaj da önemlidir: safra tuzları genellikle Proteus yayılmasını azaltır; bu nedenle MacConkey üzerinde izole koloniler elde etmek, seçici olmayan besiyerlerine göre daha kolaydır. Ancak baskılama mutlak değildir ve yayılma kontrolünün öncelikli olduğu durumlarda tuzsuz alternatifler mevcuttur.

Boyaların bu şekilde davranmasının moleküler nedeni yük ve yapıya dayanır. Methylene blue, katyonik bir fenotiyazin boyasıdır ve yapısı ve özellikleri, asidik bakteri yüzeylerine olan ilgisini açıklar; aynı etkileşim EMB üzerindeki asidik bölgelerde çökelirken de rol oynar.

Bir bakışta karşılaştırma

Tabloyu bir karar prosedürü olarak okuyun. Uygulama, öğrencilerin fermentasyon gücündeki bir gradyanı çarpıcı bir uç noktayla görmesini gerektiriyorsa bunu EMB gösterir. Uygulama, biyokimyasal doğrulamadan önce hızlı bir ikili ayrım gerektiriyorsa bunu MacConkey gösterir.

Hangi örnek için hangi besiyeri

Presumptif fekal koliform veya E. coli tanımayı amaçlayan su uygulamalarında EMB caziptir çünkü parlaklık görsel olarak ayırt edicidir. MacConkey de enterik Gram negatifleri destekler ve geçmişte su analizlerinde kullanılmıştır; ancak hiçbir plak, teste bağlı olarak modified mTEC veya MI gibi besiyerlerini şart koşabilecek düzenleyici bir su yönteminin yerine geçmez. Laboratuvarınızın uyması gereken yöntemi kontrol edin.

Fermentörleri fermentasyon yapmayanlardan ayırmayı amaçlayan dışkı tipi uygulamalarda MacConkey genellikle ikisi arasında daha kullanışlıdır. Salmonella veya Shigella için gerçek dışkı çalışmalarında yalnızca MacConkey'e güvenmek yerine normalde XLD veya Hektoen enteric gibi daha seçici enterik besiyerleri de eklenir.

Klinik iş akışını taklit eden idrar tipi eğitimlerde MacConkey'i kanlı agar ile eşleştirin. MacConkey erken Gram negatif ayrımı sağlarken kanlı agar, MacConkey'in baskıladığı organizmaların üremesine olanak verir. Bu eşleştirme, idrar kültürü kurulumuna ilişkin klinik tanımlarda standarttır.

Salt kavram öğretimi için ikisini de kullanın. EMB, fermentasyon gücünün önemli olduğunu ve tek bir molekülün iki görevi yerine getirebileceğini öğretir. MacConkey modüler tasarımı öğretir: seçici bileşen, substrat ve gösterge birbirinden ayrı tutulur. Bilinen bir E. coli, bilinen bir Klebsiella aerogenes ve bilinen bir Salmonella suşunu her iki besiyerine yan yana eken öğrenciler, iki yaklaşımın mantığını sonrasında nadiren karıştırır.

Her dönemde tekrarlanan yorumlama hataları

En yaygın hata yalnızca renge göre tanımlama yapmaktır. MacConkey üzerindeki pembe renk E. coli, Klebsiella, Enterobacter veya başka bir fermentörü gösterebilir. Renksiz görünüm Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas veya başka bir fermentasyon yapmayan organizmayı gösterebilir. Renk, Gram boyama, oksidaz, biyokimyasal paneller veya cihazla tanımlama gibi doğrulama çalışmalarını yönlendiren bir tarama fenotipidir; bir tür adı değildir.

İkinci hata, parlaklık görülmemesini fazla yorumlamaktır. Bazı gerçek E. coli kolonileri, özellikle izole olanlar, EMB üzerinde çok az metalik parlaklık üretir veya hiç üretmez. Parlaklığın olmaması E. coli'yi dışlamaz ve parlaklığın bulunması da onu kanıtlamaz. Parlaklığı presumptif bir ipucu olarak değerlendirin.

Üçüncü hata, farklı yaşlardaki plakları karşılaştırmaktır. Gecikmiş laktoz fermentörleri uzun süreli inkübasyondan sonra MacConkey üzerinde pembeleşebilir ve bu durum fermentör ile fermentasyon yapmayan arasındaki net ayrımı bulanıklaştırır. Laboratuvar tarafından belirtilen saatte değerlendirin ve sonuçla birlikte inkübasyon süresini kaydedin.

Dördüncü hata, karışık üremeyi tek bir organizma gibi değerlendirmektir. Renksiz bir koloninin yanındaki pembe koloni bir ara fenotipi değil, iki fenotipi gösterir. İyi izole edilmiş kolonileri seçin ve her morfotipi ayrı değerlendirin. Mukoid doku da benzer bir tuzak oluşturur: hem Klebsiella hem de Enterobacter mukoid görünebilir, dolayısıyla yalnızca kapsül hiçbir zaman adı kesinleştirmez. Eskiden Enterobacter aerogenes olarak öğretilen organizma artık Klebsiella aerogenes olarak sınıflandırılmaktadır; eski çizelgeler ile yeni etiketlerin neden farklı göründüğünü bu açıklar.

Kontroller ve son bir kural

Her oturumda fotoğraflanmış veya taze kontroller kullanın: güçlü fermentör reaksiyonu için E. coli, klasik parlaklık olmadan mukoid fermentasyon için Klebsiella aerogenes, renksiz fermentasyon yapmayan reaksiyon için bir Salmonella suşu ve kullandığınız üründe Gram pozitif baskılanmasını doğrulamak için Staphylococcus aureus. Suş numaralarını ve kabul kriterlerini üretici prospektüsüyle eşleştirin; çünkü seçicilik safra, crystal violet ve boya içeriğine göre değişir.

Tezgâh başında tek bir cümleyi hatırlayın. EMB hem seçen hem de gösteren boyalar kullanır; bunun karşılığında daha incelikli bir yorum gerektirse de çarpıcı bir E. coli sinyali sağlar. MacConkey seçme işlevini gösterme işlevinden ayırır; bunun karşılığında fermentasyon hakkında daha az ayrıntı sunsa da net bir pembe ve soluk ayrımı sağlar. Kavramı soruyla eşleşen besiyerini seçin, rengi uygun testlerle doğrulayın; böylece iki plak birbiriyle rekabet etmek yerine birlikte çalışır.