Pananaliksik sa antimikrobyal at antifungal na methylene blue: liwanag laban sa dilim

Dalawang mambabasa ang makakakita sa pariralang antimikrobyal na methylene blue at mag-iisip ng magkaibang bagay. Iisipin ng isa ang isang asul na likidong lumalason sa mga mikrobyo kapag nadikit dito. Iisipin naman ng isa ang isang pamamaraang gumagamit ng tina at pulang liwanag upang sirain ang mga ito. May bahagyang katotohanan ang dalawang larawang ito. Ngunit hindi kumpleto ang alinman, at sa paghahalo ng dalawa nagkakamali ang karamihan sa mga pahayag sa internet.

Ang pagkakaibang ito ang paksa ng pagsusuring ito. May katamtamang toksisidad ang methylene blue sa dilim kapag sapat ang konsentrasyon. Sa pulang liwanag, nagiging photosensitizer ito: sumisipsip ito ng photon, umaabot sa reaktibong triplet state, at nagpapasimula ng mga reaksiyong oksidatibo na nakapipinsala sa maraming target nang sabay-sabay. May sariling pangalan ang paraang ito na pinapagana ng liwanag, antimikrobyal na photodynamic therapy, at may sarili itong mga kondisyon. Hindi sapat ang konsentrasyon lamang upang tukuyin ito. Ang wavelength, dosis ng liwanag, inkubasyon, oxygen, at organismo ang nagpapasiya sa resulta.

Ang dalawang konsepto ng pagpatay

Unahin ang konsepto sa dilim. Ang methylene blue ay isang phenothiazinium na tina na may positibong karga. Kumakapit ito sa mga pambalot ng mikrobyo, pumapasok sa mga selula sa iba't ibang antas, at nakikilahok sa mga reaksiyong redox at pagbubuklod. Walang photon na kasangkot. Nagaganap ang pagpatay, ngunit sa mga konsentrasyong malaki ang pagkakaiba depende sa organismo, at hindi nakatuon ang mekanismo sa iisang tiyak na target.

Nagdaragdag ng liwanag ang konseptong photodynamic. Ang mga pulang photon sa paligid ng 630 hanggang 680 nm ay tumutugma sa banda ng pagsipsip ng tina, na may rurok para sa monomer malapit sa 664 nm. Dahil sa pagsipsip, napupunta ang tina sa panandaliang singlet state, at pagkatapos ay sa mas matagal na triplet state. Mula rito, sumusunod ang dalawang pangkat ng reaksiyon. Sa Type I na mga reaksiyon, naglilipat ang triplet ng electron sa isang substrate at nagsisimula ng mga reaksiyong radikal na may kasamang superoxide at mga hydroxyl species. Sa Type II na mga reaksiyon, direktang inililipat nito ang enerhiya sa oxygen na nasa ground state at lumilikha ng singlet oxygen. Maaaring mangyari ang dalawa nang sabay, kaya labis na pagpapasimple ang pagtawag sa tina bilang ahenteng singlet oxygen lamang. Direktang ipinapakita ito ng isang pagsusuri ng ugnayan ng estruktura at aktibidad ng mga phenothiazinium photosensitizer: sa magkakaugnay na tina, hindi nakabatay sa dami ng nalilikhang singlet oxygen lamang ang phototoxicity sa bakterya, dahil kasinghalaga ng photophysics ang pagpasok sa selula, lokasyon sa loob nito, at reduksiyon tungo sa hindi aktibong leuco form. Ipinaliliwanag ang photochemistry sa likod ng tuntunin sa wavelength sa kaugnay na pagsusuri ng tina at pulang liwanag.

Sentral ang singlet oxygen sa isang kapaki-pakinabang na katangian. Nakikipagreaksiyon ito sa maraming biomolecule nang sabay-sabay, kaya maraming salik ang saklaw ng pag-atake sa halip na iisang enzyme o protinang nagbubuklod lamang. Inilarawan ng isang pundamental na paliwanag ng photodynamic antimicrobial chemotherapy ito bilang dahilan kung bakit hindi gaanong mahalaga ang karaniwang mga profile ng resistensiya: hindi nahaharangan ng dagdag na penicillin binding protein o ng topoisomerase na may mutasyon ang biglang pagdami ng reaktibong oxygen. Napatunayan ang lohikang ito sa pagsusuri laban sa Staphylococcus aureus na lumalaban sa methicillin at enterococci na lumalaban sa vancomycin, gaya ng ipinapakita sa talahanayan sa ibaba. Hindi nito ibig sabihin na imposibleng magkaroon ng resistensiya, kundi iba ang paraan nito. Maaari pa ring baguhin ng mga efflux pump at mga depensang antioxidant ang kinakailangang dosis, lalo na sa fungi.

Talahanayan ng mga organismo at modelo ng pag-aaral

Ang talahanayang ito ang pangunahing nilalaman ng artikulo. Tiyak sa bawat protokol ang bawat halaga: parehong tina, ngunit ibang dosis ng liwanag o inkubasyon, kaya ibang bilang. Huwag ituring na magkakapareho ang MBC, MLC, at MIC. Dito, ang MBC at MLC ay nangangahulugang walang nakaligtas kapag muling kinultura, samantalang ang MIC ay nangangahulugang pagpigil sa paglago. Nakasaad sa bawat tala ang mga kondisyon ng liwanag.

Organismo at modelo	Resulta sa dilim	Resulta sa liwanag	Mga kondisyon
S. aureus NCTC 6571, suspensiyon ng malayang mga selula	MBC 5 uM	MBC 5 uM	Talahanayan sa pagsusuri, puting liwanag na 12 J per cm2
S. aureus NCTC 6571, suspensiyon ng malayang mga selula	MLC 2.5 uM	MLC 1 uM	Pangunahing protokol noong 1997, 1.7 mW per cm2 sa loob ng 1 hour, humigit-kumulang 6.3 J per cm2, inokulum na malapit sa 10^6 CFU per mL, iniulat sa orihinal na pag-aaral ng pagpatay ng phenothiazinium sa bakterya sa tulong ng liwanag
MRSA EMRSA-15, malayang mga selula	MBC 80 uM	MBC 20 uM	Talahanayan sa pagsusuri, humigit-kumulang 12 J per cm2, apat na ulit na pagtaas ng pagiging sensitibo
MRSA EMRSA-16, malayang mga selula	MBC 40 uM	MBC 10 uM	Kaparehong protokol ng nasa itaas
E. coli NCTC 9001, malayang mga selula	MBC 500 uM	MBC 100 uM	Kaparehong protokol, limang ulit na pagtaas ng pagiging sensitibo
P. aeruginosa NCTC 10622, malayang mga selula	MBC 500 uM	MBC 25 uM	Kaparehong protokol, dalawampung ulit na pagtaas ng pagiging sensitibo
E. faecalis NCTC 775, malayang mga selula	MLC 100 uM	MLC 100 uM	Protokol noong 1997 sa 6.3 J per cm2, walang pagbuti para sa strain at dosis na ito
E. faecium na lumalaban sa vancomycin, malayang mga selula	MBC 400 uM	MBC 400 uM	Talahanayan sa pagsusuri, walang pagbuti sa orihinal na tina, samantalang nagkaroon ng pagbuti sa mas hydrophobic na mga deribatibong nilagyan ng methyl, ayon sa pag-aaral ng enterococcus na lumalaban sa vancomycin
Candida albicans, malayang mga selula	MIC na higit sa 12.79 ug per mL	MIC 12.79, 6.39, at 1.59 ug per mL sa 5, 10, at 15 J per cm2	Paunang inkubasyon sa dilim sa loob ng 30 minute, pulang LED na 600 hanggang 650 nm na may rurok sa 635 nm, ayon sa pag-aaral ng tugon sa dosis ng antifungal na photodynamic na pagkilos ng methylene blue
C. albicans YEM14 kumpara sa may labis na produksiyon ng mga efflux pump, pagpatay batay sa CFU	Hindi naaangkop	Humigit-kumulang 5 log na pagpatay sa orihinal na strain, halos walang pagpatay sa may labis na produksiyon ng CDR1/CDR2	100 uM na tina, inkubasyon sa loob ng 30 minute, 660 nm sa 60 J per cm2, ayon sa pag-aaral ng mga epekto ng efflux pump sa pagpatay ng methylene blue sa tulong ng liwanag
Hyphae ng Trichophyton rubrum kumpara sa mga spore	Hindi naaangkop	MIC ng hyphae na humigit-kumulang 6.3 ug per mL, mga spore na humigit-kumulang 2.0 ug per mL; para sa ganap na pagpigil sa CFU, kinailangan ang 5 ug per mL at 100 J per cm2 para sa hyphae kumpara sa 1.25 ug per mL at 40 J per cm2 para sa mga spore	Photodynamic na protokol na 635 nm, ayon sa pag-aaral ng pagiging sensitibo sa iba't ibang yugto ng dermatophyte
Ganap na nabuong biofilm sa ilalim ng gilagid na may 33 species, aparatong Calgary, araw 6	MB lamang: higit sa 80 percent na pagbaba sa kabuuang bilang	MB at 660 nm LED: humigit-kumulang 55 percent na pagbaba sa aktibidad na metaboliko, walang malawakang pagbabago sa komposisyon ng komunidad	0.01 percent na tina (100 ug per mL), 660 nm sa humigit-kumulang 330 mW per cm2 sa loob ng 5 minutes, paglago nang walang oxygen, ayon sa in vitro na pag-aaral ng biofilm sa bibig na binubuo ng maraming species

Tatlong padron ang kapansin-pansin. Una, namamatay ang Gram-positive na staphylococci sa mababang antas na micromolar, samantalang nangangailangan ang Gram-negative na mga bakteryang hugis-baras ng humigit-kumulang isang daang ulit na mas maraming tina sa dilim, dahil nililimitahan ng panlabas na lamad ng Gram-negative na bakterya ang pagpasok. Pinapaliit ng liwanag ang agwat ngunit hindi ito ganap na inaalis. Ikalawa, tunay ngunit nakadepende sa mga kondisyon ang antifungal na pagkilos ng methylene blue: mabilis na tumataas ang antifungal na pagpatay ng methylene blue sa Candida habang tumataas ang dosis ng liwanag, at maaaring mawala ang 5 log na pagpatay sa parehong dosis dahil sa iisang pagbabago sa phenotype, gaya ng labis na produksiyon ng mga efflux pump. Ikatlo, naiiba ang kilos ng ganap na nabuong biofilm sa mga suspensiyon, at dito nabibilang ang tala tungkol sa biofilm sa bibig.

Bakterya: kung saan pinakanakatutulong ang liwanag, at kung saan hindi

Staphylococci ang sensitibong halimbawa. Maging ang mga halaga sa talahanayan ng pagsusuri para sa epidemikong MRSA ay katumbas o mas mababa kaysa sa vancomycin na ginamit na paghahambing kapag inilapat ang liwanag. Mas mahusay pa ang mga deribatibong may dalawang methyl group dahil pinataas ng methylation ang lipophilicity at dami ng nalilikhang singlet oxygen habang nilalabanan ang reduksiyon tungo sa leuco form. Mahalaga ang detalyeng iyon sa kimika: ipinapakita nitong bunga ang pagpatay ng paghahatid at photophysics, hindi ng photophysics lamang.

Ipinapakita ng mga Gram-negative na organismo ang papel ng paghahatid. Kinailangan ng Pseudomonas ang 500 uM sa dilim at 25 uM sa liwanag, isang dalawampung ulit na pagbuti, ngunit mas mataas pa rin nang malaki ang halaga sa liwanag kaysa sa saklaw para sa staphylococci. Tinutulungan ng positibong karga ang tina na lumapit sa panlabas na lamad, ngunit nananatiling limitasyon ang pagtagos. Mas nababago ng mga pormulasyon, tagal ng inkubasyon, at pagpili ng deribatibo ang mga bilang na ito kaysa sa paulit-ulit na paggamit ng parehong tina sa mas mataas na dosis.

Nagbibigay naman ng babala ang enterococci. Sa mga mas lumang protokol, walang anumang kalamangang naidulot ang liwanag sa E. faecalis, at nangailangan ang E. faecium na lumalaban sa vancomycin ng ibang molekula sa halip na mas maraming liwanag. Maling pagbasa sa literatura ang pagbanggit sa iisang MBC ng methylene blue bilang pangkalahatang di-nagbabagong halaga ng pagkilos laban sa bakterya. Walang ganoong halaga. Mayroon lamang mga halagang tiyak sa strain, midyum, inokulum, inkubasyon, wavelength, at fluence. Tinatalakay sa gabay sa pagbibigay-kahulugan sa mga kurba ng pagpatay kung paano basahin ang mga halagang iyon nang hindi nililinlang ang sarili.

Fungi: sensitibo, ngunit yugto at mga pump ang nagpapasiya

Ibang problema sa pagpasok kaysa sa bakterya ang dulot ng mga dingding ng fungi na binubuo ng mga glucan, mannan, at chitin, at mayroon ding mga aktibong depensa ang fungi. Ang resulta tungkol sa efflux ng Candida sa itaas ang pinakamalinaw na halimbawa: parehong tina, parehong liwanag, parehong midyum, ngunit nakaligtas ang strain na may labis na produksiyon ng mga efflux pump habang nawalan ang orihinal na strain ng humigit-kumulang 99.999 percent ng mga yunit na bumubuo ng kolonya. Nagdaragdag ang dermatophytes ng salik na nakabatay sa yugto ng pag-unlad. Mas madaling mamatay ang mga spore kaysa sa hyphae, kaya ang protokol na nag-aalis ng mga spore ay maaari pa ring mag-iwan ng mga buhay na piraso ng hyphae sa parehong dosis.

Iyon ang dahilan kung bakit kailangan ng mga ulat tungkol sa antifungal na methylene blue ang parehong mahigpit na pagkontrol sa liwanag gaya ng mga ulat tungkol sa bakterya. Ipinares ng mga klinikal na photodynamic na pag-aaral sa kuko at balat ang 1 hanggang 2 percent na tina sa sinukat na pulang liwanag, na may tiyak na mga fluence at kasunod na pagsubaybay, at pinaghiwalay nila ang klinikal na hitsura sa pagkawala ng fungi na napatunayan sa pagsusuri. Sinusuri ang mga pagsubok na iyon sa buod ng photodynamic na ebidensiya para sa fungi sa kuko at balat. Ginagaya lamang ng pagpapahid ng malabnaw na tina sa isang lesyon sa liwanag ng silid ang kulay, habang inaalis ang mismong pamamaraan.

Pagsusuri sa biofilm: isang modelo sa bibig na may 33 species

Karapat-dapat pagtuunan ang pag-aaral noong 2024 ng biofilm sa bibig na may maraming species dahil sinusubok nito ang mahirap na kaso sa halip na ang madali. Tatlumpu't tatlong species sa bibig, kabilang ang Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium, at streptococci sa bibig, ang lumago nang walang oxygen at naging ganap na nabuong biofilm sa araw 6. Ang ginamit ay 0.01 percent na tina at 660 nm LED sa loob ng 5 minutes na may mataas na irradiance. Malaki ang ibinaba ng kabuuang bilang gamit ang tina lamang at liwanag lamang, at binawasan ng kombinasyon ang aktibidad na metaboliko nang humigit-kumulang kalahati. Gayunman, hindi nagbago ang komposisyon ng komunidad at hindi nasterilisa ang biofilm.

Tunay na epekto iyon na may malinaw na limitasyon. Sinusuportahan nito ang photodynamic na paggamot bilang lokal na pandagdag sa isang nalinis na bulsa sa gilagid, hindi bilang pangmumog na mag-isang gumagamot sa nasuring periodontitis. Dinadala tayo nito sa pangkalahatang agwat.

Bakit hindi katumbas ng paggamot ang pagpatay sa laboratoryo

Sa pagsukat ng MBC sa malayang mga selula, inilalantad ang magkakatulad na selula sa pantay na tina at pantay na liwanag sa isang midyum na may oxygen. Wala sa mga iyon ang matitiyak sa isang lesyon. Pinababagal ng matrix ang pagpasok, natitiis ng mga kalagayang kahawig ng persister ang oksidasyon, sinisipsip ng dugo at likidong lumalabas sa sugat ang liwanag, lumilikha ng mga anino ang hugis ng tisyu, at pinahihina ng mga bulsang kulang sa oxygen ang Type II na mga reaksiyon dahil, ayon mismo sa depinisyon, nangangailangan ang singlet oxygen ng molecular oxygen. Nagdaragdag ang mga impeksiyong may halong mikrobyo ng mga species na magkakaiba sa pagpasok ng tina at pagiging sensitibo, kaya hindi maaaring kumatawan sa buong lugar ang halaga mula sa iisang batayang strain.

Ginagawang konkreto ng halimbawa sa bibig ang agwat. Ang pagpapababa ng Porphyromonas o streptococci sa isang sisidlang panglaboratoryo, o ang pagsugpo sa kinulturang biofilm nang kalahati, ay hindi nagpapatunay na ginagamot ng asul na pangmumog ang periodontitis, nagpapagaling ng impeksiyon sa loob ng ngipin, o nag-aalis ng bakterya sa dugo. Nakadepende ang klinikal na pangangalaga sa periodontal sa mekanikal na pagsira at pag-aalis ng biofilm, kasama ang pangangasiwa sa anatomiya ng bulsa sa gilagid. Pinag-aaralan ang paggamot gamit ang liwanag bilang lokal na pandagdag. Walang tiyak na ugnayan ang konsentrasyon ng tina na pumapatay sa isang balon ng laboratoryong plato at ang konsentrasyong nakararating sa bakterya sa ilalim ng gilagid, at hindi katumbas ng dosis na 660 nm ang liwanag ng silid. Ang pagtukoy sa dosis, kaligtasan, at mga limitasyon ng interaksiyon para sa anumang paggamit sa bibig ay dapat pangasiwaan ng isang clinician, gaya ng inilalarawan sa sanggunian sa kaligtasan at mga interaksiyon.

Kung ano ang hindi ipinapakita ng ebidensiyang ito

Hindi ito pahayag na maaari itong gamiting pambahay na pandisimpekta. Gumagamit ang mga talahanayan ng pagpatay sa bakterya ng tiyak na mga strain, midyum, tagal ng pagdikit, spectrum, at fluence. Wala silang sinasabi tungkol sa mga ibabaw sa kusina, kinakailangang tagal ng pagdikit kapag may organikong dumi, o mga pamantayan ng regulasyon sa pagdidisimpekta.

Hindi rin ito pamalit sa antibiyotiko na kumikilos sa buong katawan. Nangangailangan ang karaniwang photodynamic na pagkilos ng tina, nasipsip na liwanag, at oxygen sa parehong lugar at oras. Hindi nakararating ang liwanag sa malalalim o kalat-kalat na lugar sa katawan gaya ng pagdating sa dugo ng isang nilunok na gamot. Inilalagay ng literatura ang pamamaraang ito para sa lokal na impeksiyong madaling maabot o bilang pandagdag, gaya mismo ng unang paglalarawan ni Wainwright sa lokal na pagdidisimpekta.

Mas makitid ang makatarungang buod, ngunit kawili-wili pa rin. May katamtamang antimikrobyal na aktibidad ang methylene blue sa dilim, at pinapagana ng pulang liwanag ang mas malaking photodynamic na epekto para sa maraming bakterya at fungi. Malaki ang pagkakaiba sa mga halaga sa liwanag kumpara sa dilim, gaya ng 500 patungong 25 uM para sa Pseudomonas at 80 patungong 20 uM para sa epidemikong MRSA, kasabay ng mga kabiguang nagbibigay ng mahalagang aral sa enterococci at Candida na may aktibong kakayahang mag-efflux. Ang paglalapat ng mga natuklasan ay nakadepende sa paghahatid, pisyolohiya ng biofilm, at oxygen, na kasinghalaga ng nominal na konsentrasyon ng tina. Panatilihing malinaw ang mga kondisyong iyon at may kahulugan ang mga bilang. Alisin ang mga iyon at wala nang kahulugan ang mga bilang.