Pagbasa sa anyo ng E. coli at iba pang kolonya sa EMB agar

Ikinakalat ng isang estudyante sa pamamagitan ng paghagod ang isang hindi pa natutukoy na organismo sa eosin methylene blue agar, pinapainkubahan ito nang magdamag, at bumabalik sa isang plato ng maiitim na kolonya na may berdeng kinang. Ang nakasulat sa kuwaderno ay "E. coli, nakumpirma." Higit ang ipinapahayag ng talang iyon kaysa sa kayang patunayan ng plato. Ipinapakita ng plato ang penotipo ng paglago at pagbuburo sa ilalim ng tiyak na mga kondisyon. Ang pagkakakilanlan ng espesye ay hiwalay na konklusyon na nangangailangan ng hiwalay na ebidensya.

Tinatalakay ng gabay na ito ang mga resulta sa EMB agar bilang isang gawain ng interpretasyon. Ipinapaliwanag nito ang batayang prinsipyo, inilalahad ang isang atlas ng mga ilustrasyon ng plato na may mga kontrol, at tinutukoy ang mga sitwasyon kung saan nakalilinlang ang larawang nasa aklat.

Ang prinsipyong nasa likod ng plato

Ang EMB agar ay kapwa selektibo at mapagbukod. Pinipigil ng mga pangkulay na eosin Y at methylene blue ang maraming organismong Gram positive, kaya mas pinapaboran ng medium ang paglago ng Gram negative. Nagsisilbi ring mga pananda ang parehong pangkulay: kapag binuburo ng isang organismo ang magagamit na asukal at lumilikha ng sapat na asido sa paligid nito, sumisipsip ang kolonya ng maraming pangkulay at nagiging madilim na lila hanggang asul-itim. Kapag masigla ang paglikha ng asido, maaaring magpakita ang ibabaw ng kolonya ng metalikong berdeng kinang na nagbabago ayon sa anggulo ng pagtingin. Inilalarawan ng protokol ng ASM para sa mga plato ng eosin methylene blue agar ang kombinasyong ito ng pagpili at pagbubukod at nagbibigay ng mga sangguniang larawan para sa pagtuturo.

May isang mahalagang detalye bago basahin ang anumang resulta: suriin kung aling pormulasyon ang ginagamit. Ang mas lumang pormulasyong Holt Harris Teague ay naglalaman ng lactose at sucrose, samantalang lactose lamang ang nasa Levine EMB. Ang isang organismong nagbuburo ng sucrose ngunit hindi ng lactose, gaya ng maraming nakahiwalay na strain ng Serratia marcescens, ay maaaring magmukhang iba sa dalawang bersyon. Tahasang isinasaad ng dokumentasyon ng tagagawa para sa mga EMB medium ang pagkakaibang ito sa pormulasyon. Itala ang tagagawa at pormulasyon sa kuwaderno kasama ng resulta.

Ang inihandang EMB agar na hindi pa nalalagyan ng inokulum ay karaniwang pula-kayumanggi hanggang mapulang lila, kung minsan ay may bahagyang berdeng kulay o pinong namuo. Ang kulay na iyon ng medium ay hindi paglago. Ihambing ang bawat pagbasa sa isang platong hindi pa nalalagyan ng inokulum o sa nakatalang batayang anyo, at basahin ang pangunahing plato pagkatapos ng humigit-kumulang 18 hanggang 24 oras ng inkubasyong may oksiheno sa 35 hanggang 37 C maliban kung iba ang itinakda ng protokol sa pagtuturo. Maaaring baguhin ng mas mahabang inkubasyon ang anyo ng pagbuburo.

Paano tingnan ang plato

Gumamit ng dalawang uri ng liwanag. Una, suriin ang plato sa ilalim ng sinasalamin o pahilis na liwanag at ikiling ito: ang metalikong kinang ay nagbabago ayon sa anggulo ng pagtingin at maaaring lumitaw o mawala. Pagkatapos, suriin ito gamit ang liwanag na tumatagos sa plato upang mataya ang kulay ng kolonya at ang maiitim na gitna. Gumamit ng mga kolonyang malinaw na magkakahiwalay, dahil binabago ng pagsisiksikan at mga katabing kolonya ang lokal na pag-ipon ng asido at maaaring pahinain o palitawin nang labis ang kulay. Direktang ipinapakita ito ng kalipunan ng mga larawan ng ASM: maaaring mawala ang inaasahang kinang ng E. coli sa kulturang may halong mga organismo dahil binabago ng mga nakapaligid na organismo ang kaasiman sa paligid nito.

Magsama ng mga kontrol kapag pinahihintulutan ng gawain. Isang karaniwang pangkat para sa pagtuturo ang E. coli ATCC 25922 para sa penotipong asul-itim at may metalikong kinang, isang organismong hindi nagbuburo gaya ng Salmonella Typhimurium ATCC 14028 o Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 para sa walang-kulay na penotipo, at isang Gram positive gaya ng Enterococcus faecalis o Staphylococcus aureus bilang kontrol sa pagpigil ng paglago, gaya ng nakalista sa mga pamantayang talahanayan ng QC para sa mga EMB medium. Kung walang kinang ang positibong kontrol, pagdudahan muna ang inkubasyon, pagsisiksikan, o pormulasyon bago ang hindi pa natutukoy na organismo.

Atlas ng mga ilustrasyon ng plato

Ang mga plato sa ibaba ay mga nilikhang ilustrasyon, hindi mga litrato ng tunay na kultura. Ipinapakita ng mga ito ang padron na dapat hanapin, hindi ang eksaktong kulay ng anumang partikular na strain. Ihambing ang mga ito sa mga sangguniang larawan ng ASM at sa mga tunay na plato mula sa laboratoryo sa pagtuturo.

Plato 1: Escherichia coli sa EMB agar, masiglang nagbuburo ng lactose

Ang E. coli sa EMB agar ay karaniwang madilim na lila hanggang asul-itim, madalas na may maitim na gitna at metalikong berdeng kinang mula sa masiglang paglikha ng asido. Ang kinang ang kilalang katangiang hinahanap ng mga estudyante, ngunit ituring itong sumusuportang ebidensya sa halip na isang depinisyon. Nag-iiba ang tindi ng kinang ayon sa strain, tagal ng inkubasyon, siksik ng mga kolonya, at anggulo ng pagtingin. Hindi inaalis ng kawalan ng kinang ang posibilidad na E. coli ito, at ang maitim na kolonyang walang kinang ay maaari ring tumukoy sa ilang ibang organismong nagbuburo. Pumili ng isang malinaw na nakahiwalay na kolonya para sa anumang kasunod na pagsusuri sa halip na magbasa mula sa isang bahaging siksikan.

Plato 2: Klebsiella pneumoniae sa EMB agar, malapot na organismong nagbuburo

Ang Klebsiella pneumoniae sa EMB agar ay karaniwang bumubuo ng malalaki, makintab, at malalapot na kolonya na may kulay rosas-lila hanggang kayumanggi-lila, madalas na may maiitim na gitna ngunit karaniwang walang matinding metalikong kinang. Makikita ang katulad na morpolohiya sa mga kaugnay na organismong nagbuburo gaya ng Enterobacter. Bahagi ng pagbasa ang malapot na tekstura at laki ng kolonya: iba ang bigat sa interpretasyon ng isang maliit at patag na rosas na kolonya kaysa sa isang malaki, nakaumbok, at malapot na kolonya. Gaya ng sa E. coli, nagpapahiwatig ang plato ng isang penotipo ng pagbuburo, at ang pagtukoy sa antas ng espesye ay nangangailangan ng biyokemikal na pagkumpirmang inilalarawan sa ibaba.

Plato 3: Salmonella sa EMB agar at iba pang organismong hindi nagbuburo, walang-kulay na mga kolonya

Ang Salmonella sa EMB agar at mga kaugnay na organismong hindi nagbuburo ng lactose, kabilang ang Shigella at maraming nakahiwalay na strain ng Pseudomonas, ay karaniwang tumutubo bilang walang-kulay hanggang bahagyang naaaninag o mapusyaw na ambar na mga kolonya. Nagbibigay ang ilang pormulasyon at kondisyon ng bahagyang mapulang-rosas na kulay, kaya ang isang mapusyaw na rosas na kolonya ay hindi awtomatikong organismong nagbuburo. Hindi naibubukod ng EMB ang Salmonella mula sa Shigella o sa iba pang organismong hindi nagbuburo; ginagawa ang pagbubukod na iyon sa mga susunod na pagsusuri. Tandaan din na may mga naitalang strain ng Salmonella na nagbuburo ng lactose at may mga metalikong kolonyang kahawig ng E. coli, na isa pang dahilan kung bakit hindi sapat ang isang plato lamang upang tapusin ang pagtukoy.

Plato 4: Serratia marcescens at ang bitag ng pormulasyon

May sariling seksyon ang Serratia marcescens dahil madalas na umaasa ang mga estudyante sa pulang kolonya at pagkatapos ay nagkakamali sa pagbasa ng plato. Hindi nagbuburo ng lactose ang karamihan ng mga klinikal na nakahiwalay na strain, kaya sa Levine EMB ay karaniwang mapusyaw hanggang bahagyang may kulay ang mga ito. Dahil maraming nakahiwalay na strain ang nagbuburo ng sucrose, maaaring magbigay ang pormulasyong may sucrose ng mas maitim na reaksiyon o reaksiyong mas nagpapakita ng paglikha ng asido. Huwag ding asahan ang klasikong pulang pigmentong prodigiosin sa 35 hanggang 37 C; hindi maaasahan ang paglikha ng pigmento sa temperatura ng inkubador. Kapag binabanggit ng protokol ang Serratia marcescens sa EMB agar, suriin kung aling pormulasyon ang ipinapalagay ng pahayag. Binubuod ng pagsusuri sa metabolismo ng Serratia ang padron ng hindi pagbuburo ng lactose at pabago-bagong pagbuburo ng sucrose na nasa likod ng bitag na ito.

Plato 5: mga kontrol at mga organismong napipigilan ang paglago

Ang mga organismong Gram positive gaya ng Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, at Bacillus ay karaniwang napipigilan o lubhang nababawasan ang paglago sa EMB agar, bagaman hindi ganap ang pagpigil para sa bawat strain. Nagbibigay ng maaasahang batayan sa pagbasa ang isang pangkat ng mga kontrol: dapat magpakita ang kontrol na E. coli ng mahusay na paglago na may asul-itim na kulay at kinang, dapat magpakita ang kontrol na hindi nagbuburo ng walang-kulay na paglago, at dapat magpakita ang kontrol sa pagpigil ng paglago ng kaunti o walang paglago. Kung mahusay ang paglago ng kontrol sa pagpigil, nabigo ang selektibong hakbang at kaduda-duda ang lahat ng iba pang pagbasa sa pangkat na iyon. Ibang tanong ang sinasagot ng mga paraan ng paglamlam kaysa sa mga medium ng kultura; para sa paglamlam ng slide sa laboratoryo, tingnan ang atlas ng paglamlam gamit ang methylene blue.

Paghahambing na may malinaw na mga limitasyon

Tatlong pangungusap ang nagbubuod sa mga nakalilinlang na anyo. Hindi nangangahulugang E. coli ang maitim, dahil nagkakaroon ng maiitim na gitna na walang kinang ang Klebsiella, Enterobacter, at iba pang organismong nagbuburo. Hindi nangangahulugang Klebsiella ang rosas, dahil nagmumukhang rosas o mapusyaw na lila ang mga katamtaman o mabagal na nagbuburo at ang ilang karaniwang itinuturing na hindi nagbuburo. Hindi nangangahulugang tiyak na E. coli ang kinang, dahil maaari rin itong likhain ng ibang masiglang nagbuburo. Inilalarawan ng protokol sa pagtuturo at ng mga larawan nito ng kulturang may halong mga organismo ang bawat isa sa mga pagkakamaling ito.

Mga limitasyon ng pagkumpirma

Isang penotipo ang ipinapakita ng EMB agar, hindi isang espesye. Maaaring magkapareho ang anyo ng kolonya ng iba't ibang organismo, at maaaring lumihis ang isang organismo sa karaniwang larawang nasa aklat dahil sa strain, edad, pagsisiksikan, pormulasyon, at inkubasyon. Kaya itinuturing sa mga proseso ng pagtuturo at klinikal na gawain ang morpolohiya sa EMB bilang paunang palatandaan lamang.

Isang maipagtatanggol na proseso para sa estudyante ang sumusunod: ilarawan ang nakahiwalay na kolonya (laki, kulay, gitna, kinang sa pahilis na liwanag, malapot na katangian), itala ang pormulasyon, tagal at temperatura ng inkubasyon, at mga kontrol; pagkatapos ay muling ikultura ang isang malinaw na nakahiwalay na kolonya hanggang makakuha ng purong kultura bago ang anumang pagsusuri para sa pagkumpirma. Karaniwang kasunod nito ang paglamlam na Gram at mga reaksiyong IMViC para sa paunang pagtukoy ng E. coli at mga coliform, TSI o KIA at mga pangkat ng biyokemikal na pagsusuring tiyak sa organismo para sa mga organismong mula sa bituka, kasama ang serolohikal, MALDI TOF, o iba pang napatunayang paraan ng pagkilala kapag kailangan sa gawain. Para sa batayang kaalaman kung paano nabibilang ang EMB sa mga selektibo at mapagbukod na medium para sa mga organismong mula sa bituka, tingnan ang mga panimulang paliwanag sa mga medium ng kultura para sa mga organismong mula sa bituka at kasunod na pagsusuri gamit ang paglamlam na Gram. Para sa kaugnay na tanong tungkol sa kung ano ang kayang patunayan at hindi kayang patunayan ng asul na paglamlam ng slide, pinananatiling magkahiwalay ng atlas ng paglamlam gamit ang methylene blue ang obserbasyon at konklusyon sa parehong diwa.

Isulat ang obserbasyon bago ang konklusyon. Maipagtatanggol ang "Madidilim na asul-itim na kolonya na may berdeng kinang na nagbabago ayon sa anggulo sa Levine EMB sa 24 oras, na naaayon sa masiglang pagbuburo ng lactose." Ang "E. coli, nakumpirma" ay nangangailangan ng hakbang ng pagkumpirma na hindi kayang ibigay ng plato lamang.