Methylene blue sa pananaliksik sa zebrafish: pandagdag sa pag-aalaga at salik na nakagugulo sa eksperimento

Madalas na bahagyang asul ang tubig para sa mga itlog ng zebrafish, at halos walang nagtatala kung bakit. Ang tina ay methylene blue, na idinaragdag laban sa fungi, at itinuturing lamang ito ng karamihan sa mga protokol bilang bahagi ng karaniwang kalagayan. Mali ang ganitong pananaw dito. Mas angkop itong ituring na isang hindi nakalistang salik sa eksperimento: isang bagay na nasa mga sisidlang nilagyan nito ngunit wala sa mga kontrol, may aktibidad na parmakolohikal sa mga konsentrasyong ginagamit, at kayang baguhin mismo ang mga sukatan na sinusuri ng eksperimento.

Ang pagkakaibang iyon ang batayan ng lahat ng kasunod na talakayan. Isang usapin ang karaniwang paggamit laban sa fungi sa pag-aalaga. Ibang usapin naman kung walang epekto ang pandagdag sa iyong pagsusuri. Nakapanatag ang sagot ng mga kamakailang literatura sa zebrafish sa una, ngunit nakakabahala ang sagot sa ikalawa.

Ano talaga ang itinatakda ng mga gabay

Walang iisang pamantayan, at bahagi iyon ng problema. Pinapayagan ng gabay ng Canadian Council on Animal Care ang 0.5 mg/L, o 0.00005%, sa solusyong ginagamit sa pagbiyahe ng mga itlog at larba upang mabawasan ang paglago ng fungi. Inilalarawan ng gabay sa mga hayop sa laboratoryo sa Europa ang mga embryong pinananatili sa medium na madalas ay may parehong 0.00005%. Itinatakda naman ng resipe ng Cold Spring Harbor para sa E3 ang doble nito, 1 mg/L o 0.0001%, bilang sangkap ng resipe. Kabaligtaran nito ang isang kapansin-pansing hindi pagsasama: itinatakda ng gabay ng OECD para sa pagsusuri ng toksisidad sa embryo ng isda ang muling binuong tubig na pampalabnaw at ang kemikal na susuriin, nang walang rekomendasyon sa methylene blue sa bersiyong 2013 o sa sumunod na rebisyon. Kaya nagpapalaki ang isang laboratoryo ng mga embryo ng zebrafish sa asul na tubig na may methylene blue mula sa mga unang oras ng buhay, samantalang isinasagawa ng isa pa ang pagsusuri sa embryo para sa regulasyon sa malinaw na tubig, at pareho nilang tinatawag na normal ang kanilang medium. Namamana ng sinumang naghahambing ng mga resulta sa iba't ibang laboratoryo, o nagsasama-sama ng mga kontrol mula sa mga nakaraang pag-aaral, ang hindi pagkakatugmang iyon.

Bilang konteksto sa mga konsentrasyon, ang 0.00005% ay humigit-kumulang 1.56 micromolar at ang 0.0001% ay humigit-kumulang 3.13 micromolar. Mababa ang mga bilang na ito, at madaling isipin na napakababa ng mga ito para magkaroon ng epekto. Ang palagay na iyon mismo ang sinusubok ng mga pag-aaral sa ibaba, sa mismong mga konsentrasyong iyon.

Ang mga mambabasang mula sa pag-aalaga ng isda sa halip na sa laboratoryo ay nakakasalamuha rin ng parehong molekula sa ibang sitwasyon, na tinatalakay sa gabay sa methylene blue para sa akwaryum. Pareho ang kemistri; ipinapaliwanag ng talakayan kung paano nagpapalipat-lipat ng mga elektron ang tina sa loob ng mga selula kung bakit laging lumilitaw sa mga papel tungkol sa metabolismo ang isang tambalang aktibo sa redox. Ang sumusunod ay partikular sa tubig para sa mga itlog ng zebrafish na may methylene blue.

Metabolismo: nagbabago ang direksiyon ng epekto ayon sa yugto

Inilantad ng pinakanagbibigay-kaalamang pag-aaral ang mga zebrafish na normal ang pag-unlad mula sa unang araw ng buhay hanggang 5 araw pagkatapos ng pertilisasyon at sinukat ang oksidatibong metabolismo sa bawat yugto, gaya ng inilalarawan sa inilathalang ulat ng mga eksperimento sa metabolismo ng embryo. Mahalagang ilahad nang maingat ang padron dahil bumabaligtad ang direksiyon nito.

Sa 1 araw pagkatapos ng pertilisasyon, tumaas ang batayang pagkonsumo ng oxygen sa mga nalantad na embryo sa parehong konsentrasyong ginagamit sa pag-aalaga. Sa 2 araw, tumaas ang potensiyal ng lamad ng mitochondria sa panlabas na suson ng larba sa mga pagkakalantad na 0.00005%, 0.0001%, at 0.0003%. Pagsapit ng 4 hanggang 5 araw, matapos mapisa, bumaligtad ang direksiyon: bumaba ang oksidatibong paggugol ng enerhiya, tuloy-tuloy man ang pagkakalantad mula sa pertilisasyon o panandalian lamang mula araw 3 hanggang araw 4. Kasabay nito, nabawasan ang mga transkripto para sa mga subunit ng mga kompleks ng respirasyon sa mitochondria sa parehong 1 at 4 araw, pati ang mga transkriptong kaugnay ng steroidogenesis at gluconeogenesis.

Dalawa pang obserbasyon ang nagpapalinaw sa larawan. Bahagyang napaaga ang pagpisa sa mas mataas na konsentrasyong ginagamit sa pag-aalaga: nauna ang mga nalantad na embryo sa 2 araw at nakahabol ang mga kontrol pagsapit ng araw 3. At tila nanatiling buo ang mismong sistema ng pagtugon sa stress: nang ilantad ang mga larbang 5 araw ang edad sa paikot na galaw na nagdudulot ng stress, normal na tumaas ang cortisol sa buong katawan sa parehong grupo. Kaya hindi pangkalahatang lason sa pag-unlad ang tina sa mga dosis na ito, at hindi nito pinapahina ang lahat ng tugong pisyolohikal. Binabago nito ang metabolismo ng enerhiya ayon sa yugto: tumataas bago mapisa at bumababa pagkatapos.

Pag-uugali: bakit hindi magkatugma ang dalawang pag-aaral, at bakit maaaring parehong tama

Mukhang magkasalungat ang literatura tungkol sa pag-uugali hangga't hindi naihahambing nang magkatabi ang mga disenyo ng pagkakalantad. Sa isang pag-aaral sa kaligtasan ng pag-unlad at pag-uugali, inilantad ang mga embryo mula humigit-kumulang 6 oras pagkatapos ng pertilisasyon sa mga konsentrasyong hanggang 10 micromolar, pinalitan ang mga solusyon araw-araw hanggang araw 4, saka inilipat ang mga larba sa medium na walang tina para sa mga araw 5 at 6 at sinuri ang paggalaw sa isang pagsusuring may liwanag at dilim sa araw 6. Ang resulta: walang makabuluhang epekto sa pagkamatay, pagpisa, o morpolohiya, at walang epekto ng paggamot sa paggalaw. Makatuwirang inirekomenda ng mga may-akda ang 10 micromolar bilang pinakamataas na hangganan sa ilalim ng kanilang mga kondisyon.

Isinagawa ng ikalawang grupo, na may ilan sa parehong mga may-akda ng pag-aaral sa metabolismo, ang pagkakalantad ayon sa aktuwal na paraan ng pag-aalaga: may tina mula 2 hanggang 3 oras pagkatapos ng pertilisasyon, may bahagyang pagpapalit araw-araw, at sinusukat ang pag-uugali habang nagpapatuloy pa o katatapos lamang ng pagkakalantad. Sa parehong karaniwang mga konsentrasyon, nabawasan ang paggalaw ng mga larba sa isang 24-oras na pagsusuri, na naulit sa iba't ibang lahi at laboratoryo, at iniugnay ng pag-aaral sa panggugulo sa resulta ng pag-uugali ang epekto sa antas ng aktibidad ng sistemang serotonin, na tugma sa kilalang pagpigil ng tina sa monoamine oxidase. Pinakamalinaw sa lahat, natakpan ng medium ng embryo na may methylene blue ang inaasahang tugon ng paggalaw sa SSRI na fluoxetine. Kaya maaaring hindi matukoy ng isang pagsusuring pang-screening sa asul na tubig ang epekto ng gamot na makikita sana sa malinaw na tubig.

Walang tunay na pagsasalungatan. Maaaring walang matukoy na natitirang epekto ang isang tambalan dalawang araw matapos alisin ang pagkakalantad sa isang pagsusuri, ngunit aktibo pa rin ito habang naroon sa isa pa. Ang praktikal na pagbasa rito ay sinusuportahan ng resultang walang nakitang epekto ang isang pinakamataas na hangganan ng konsentrasyon, hindi ang pag-angking walang epekto ang tina, samantalang inilalarawan ng resultang may nakitang epekto ang mahalagang panganib: aktibong pagkakalantad habang isinasagawa ang pagsukat, sa mismong kaayusang ginagamit ng karamihan sa mga laboratoryo.

Isang redox na tina sa loob ng isang redox na pagsusuri

May isa pang bitag na nararapat sa sarili nitong talata dahil ginugulo nito ang instrumento ng pagsukat sa halip na ang hayop. Ang pagsusuri ng Alamar Blue sa paggugol ng enerhiya ay kemistriyang redox mismo: ang resazurin ay nirereduce upang maging resorufin na naglalabas ng fluorescence. Gumagana rin sa pamamagitan ng kemistriyang redox ang methylene blue. Sa mga kontrol na walang selula, bahagyang ngunit makabuluhang pinababa ng parehong konsentrasyong ginagamit sa pag-aalaga ang fluorescence ng Alamar Blue pagkatapos ng 24 oras. Sa mga eksperimento sa hayop, hinugasan ang mga nalantad na embryo nang hindi bababa sa tatlong beses sa medium na walang tina bago ang pagsusuri, at mas malaki ang biyolohikal na epekto sa mga napisang larba kaysa sa panghihimasok na nakita nang walang selula. Kaya parehong totoo ang dalawang bagay: may tunay na epekto sa metabolismo ang mga nahugasang hayop, at nagdaragdag naman ng direktang kemikal na artepakto ang hindi naalis na tina. Kailangang paghiwalayin ng mga kontrol ang dalawa, kung hindi ay walang saysay ang alinmang bilang. Lalong mahalaga rito ang pangkalahatang gabay sa pagbasa ng mga resulta ng pagsusuring gumagamit ng tina.

Talatakdaan ng mga yugto ng pag-unlad

Ang orihinal na materyal para sa artikulong ito. Ang mga konsentrasyon ay ang dalawang karaniwang halaga sa pag-aalaga, 0.00005% at 0.0001%, maliban kung may ibang nakasaad.

Ang padrong dapat tandaan ay ang maagang pagtaas at kalaunang pagbaba ng mga sukatan ng metabolismo, na may mga epekto sa pag-uugali habang nalalantad at walang matukoy na epekto matapos maalis ang tina sa katawan sa nag-iisang pagsusuring sumubok nito.

Talaan para sa disenyo ng mga kontrol

Ang ikalawang orihinal na materyal. Gamitin ito kapag nagsasangkot ng eksperimento ang mga protokol sa zebrafish na gumagamit ng methylene blue.

1. Iulat ang tina bilang reagent, hindi bilang tubig. Ilahad ang konsentrasyon sa parehong porsiyento at micromolar, ang simula at pagtatapos sa oras o araw pagkatapos ng pertilisasyon, ang iskedyul ng pagpapalit, at ang pagitan ng pag-alis sa pagkakalantad at bawat pagsukat.
2. Iangkop ang mga kontrol sa tanong. Kailangan ng pag-aaral sa kemikal na sinusubok ng mga kontrol na walang tina; kailangan naman ng pag-aaral sa pag-aalaga ng mga grupong walang tina at may tina, na may pagtatala ng resulta laban sa fungi, dahil walang sinukat na bisa laban sa fungi ang alinman sa mga binanggit na pag-aaral.
3. Maghugas bago ang mga pagsusuring redox, saka tiyakin ang resulta. Banlawan nang hindi bababa sa tatlong beses sa medium na walang tina at magsagawa kasabay nito ng kontrol na may tina at reagent ngunit walang selula, dahil direktang pinapababa ng tina ang signal ng Alamar Blue.
4. Ituring na mataas ang panganib sa mga sukatan ng pag-uugali at monoamine. Dapat iwasan ng mga pag-aaral sa paggalaw, pagkagulat, pag-uugaling katulad ng pagkabalisa, antidepressant, at mga inhibitor ng MAO ang tina habang sumusukat, o ipakita na wala itong epekto sa partikular na sukatan; naalis ng isa hanggang dalawang araw na walang pagkakalantad ang isang epekto sa paggalaw, ngunit hindi pa ito napatunayan para sa ibang mga pamamaraan ng pagsusuri.
5. Ituring na mataas ang panganib sa mga sukatan ng metabolismo at mitochondria sa bawat yugto. Nagbabago ang pagkonsumo ng oxygen, paggugol ng enerhiya, potensiyal ng lamad, at mga transkripto ng kadena ng respirasyon sa mga konsentrasyong ginagamit sa pag-aalaga, sa magkasalungat na direksiyon bago at pagkatapos mapisa.
6. Huwag ilipat sa ibang disenyo ang pagpapalagay na walang epekto. Ang resultang walang nakitang epekto matapos alisin ang pagkakalantad ay hindi sumasaklaw sa patuloy na pagkakalantad; ang resultang walang nakitang epekto sa morpolohiya ay hindi sumasaklaw sa metabolismo o interaksiyon sa gamot; ang resulta sa isang lahi, temperatura, o tagal ng pagsusuri ay hindi sumasaklaw sa iba.
7. Ilahad ang gabay na sinunod mo at ang alternatibo nito. Tahasang tukuyin ang mga konsentrasyon ng CCAC, ng gabay sa Europa, o ng Cold Spring Harbor, at banggitin kung saan hindi isinasama ng pagsusuri ng OECD sa embryo ang tina, upang matukoy ng mambabasa ang mga kondisyong kinalakihan ng iyong mga hayop.

Wala sa mga ito ang tumututol sa paggamit ng tina upang mapanatiling buhay ang mga itlog. Ang tinututulan nito ay ang pagpapahintulot na makaimpluwensiya sa datos ang isang pagpili sa pag-aalaga nang hindi sinusuri. Ang asul sa sisidlan ay isang molekulang may mga katangiang parmakolohikal, at ang mga eksperimentong pinakamalamang na magulo nito ay ang mismong mga pagsusuring pang-screening sa metabolismo at paggana ng nerbiyos at pag-uugali na may mataas na kapasidad, kung saan mas pinipili ngayon ang mga batang zebrafish. Itala ito, kontrolin ito, alisin ito bago ka magsukat, at suriin ang pagsusuring maaaring tahimik itong nakikilahok.