Methylene blue sa mga pagsusuri ng G6PD sa laboratoryo: ano talaga ang ginagawa ng pangkulay

Pinagmamasdan ng isang estudyante ang dalawang tubo pagkatapos ng inkubasyon. Ang isa ay nagkaroon ng inaasahang kulay. Ang isa naman ay hindi. Napagpasyahan ng estudyante na kulang sa glucose-6-phosphate dehydrogenase ang ikalawang pasyente. Maaaring tama ang konklusyong iyon, ngunit nilalaktawan ng pangangatwiran ang konseptong nagpapagana sa pagsusuri. Walang anumang nasa tubo na direktang sumusukat sa enzyme. Sinusukat ng tubo ang nagagawa ng enzyme, gamit ang methylene blue bilang tagapamagitan.

Kapag malinaw na ang di-tuwirang pagsukat na ito, hindi na magmumukhang walang batayan ang pamamaraan, mga kontrol, at mahabang listahan ng mga maling resulta.

Ang maikling sagot

Ang methylene blue sa pagsusuri ng G6PD ay isang tagapagpahiwatig ng redox. Gumagawa ng NADPH ang enzyme na G6PD, at ang mga sistemang umaasa sa NADPH ay nagre-reduce sa asul na methylene blue tungo sa walang-kulay nitong anyong leuco (o ginagamit ito upang maglipat ng mga electron). Nagbibigay ng mahusay na reduksiyon ang normal na aktibidad ng enzyme. Nagbibigay naman ng mabagal o hindi kumpletong reduksiyon ang kulang na aktibidad. Iyon ang kabuuan ng senyas.

Dalawang makasaysayang pamamaraan ang gumagamit ng parehong pangkulay ngunit magkaiba ang panghuling palatandaan. Ihiwalay ang dalawa at mawawala ang karamihan ng pagkalito.

Dalawang pagsusuri, isang pangkulay, magkaibang panghuling palatandaan

Ang una ay ang direktang pagsusuri ng reduksiyon ng methylene blue, na inilarawan ni Sass at ng mga kasamahan niya at kalaunan ay sinuri ni Gibbs. Dito, ang panghuling palatandaan ay ang pangkulay mismo: ang na-oxidize na asul na methylene blue ay sumasailalim sa reduksiyon tungo sa walang-kulay na leucomethylene blue, at ang bilis ng pagbabagong iyon ay sumasalamin sa kakayahang gumawa ng NADPH. Nakaindeks ang pangunahing papel tungkol sa paunang pagsusuring ito sa PubMed sa ilalim ng Sass et al. (1966).

Ang ikalawa ay ang pagsusuring Brewer para sa reduksiyon ng methemoglobin. Unang ino-oxidize ng sodium nitrite ang hemoglobin upang maging kayumangging methemoglobin. Pagkatapos, nagsisilbing tagapamagitan sa paglilipat ng electron ang methylene blue: ipinapasa ng methylene blue na sumailalim sa reduksiyon ang mga katumbas na reduksiyon sa methemoglobin, na nagbabalik dito sa pulang hemoglobin. Samakatuwid, ang nakikitang panghuling palatandaan ay kayumanggi laban sa pula, hindi asul laban sa walang kulay. Inilathala ang orihinal na pamamaraan sa Bulletin of the World Health Organization (Brewer et al., 1960).

Hindi eksakto sa kimika ang pagtawag sa pagsusuring Brewer na pagsusuri ng pagkawala ng kulay ng pangkulay. Paulit-ulit na umiikot ang pangkulay sa mga anyo nito; ang hemoglobin ang nagbabago ng kulay. Ipinapakita ng dayagram sa ibaba ang dalawang landas.

Ang reaksiyong pinagbabatayan

Pinapabilis ng G6PD ang unang hakbang ng oksidasyon sa landas ng pentose phosphate:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Lubos na umaasa ang mga ganap nang hinog na pulang selula ng dugo sa landas na ito para sa NADPH, gaya ng tinalakay sa Blood nina Luzzatto at mga kasamahan (2020). Pinananatili ng NADPH ang glutathione sa reduced na anyo at pinoprotektahan ang selula laban sa pinsalang dulot ng oksidasyon. Pumapasok ang methylene blue sa sistemang ito bilang tagatanggap ng electron. Ang sapat na G6PD ay nagbibigay ng sapat na NADPH, na nagbibigay naman ng mahusay na reduksiyon. Pinuputol ng mababang G6PD ang kadena sa unang kawing nito.

Isipin ang pangkulay bilang panukat ng gasolina, hindi ang makina. Ipinapakita nito ang suplay ng NADPH. Anumang ibang bagay na nagbabago sa suplay na iyon, o sa pagbasa ng resulta, ay maaaring magpagalaw sa panukat nang walang anumang pagbabago sa gene.

Paano isinasagawa ang pamamaraang uri ng Brewer

Nagbago ang mga pormulasyon ng reagent sa paglipas ng mga dekada, kaya hindi dapat ituring na klinikal na protokol ang isang paglalarawang para sa pagtuturo. Sinusunod ng bawat laboratoryo ang sarili nitong napatunayang pamantayang pamamaraan ng operasyon. Sa pag-iingat na iyon, ganito gumagana ang klasikong paghahanda ng mga tubo, sa anyong dokumentado gamit ang tatlong tubo at 3 oras na inkubasyon sa inilathalang pagsasagawang ito:

1. Tubo ng pasyente: buong dugo kasama ang glucose, sodium nitrite, at methylene blue. Lumilikha ng methemoglobin ang nitrite, nagbibigay ng sangkap para sa metabolismo ng pulang selula ang glucose, at nagsisilbing tagapaglipat na umaasa sa NADPH ang pangkulay.
2. Kontrol na na-oxidize: dugo kasama ang nitrite at glucose ngunit walang methylene blue. Ipinapakita nito ang kayumangging panghuling palatandaan ng methemoglobin, ang padron ng kakulangan.
3. Kontrol ng hemoglobin: dugo kasama ang tubig. Ipinapakita nito ang pulang panghuling palatandaan ng hemoglobin, ang normal na padron.
4. I-inkuba ang lahat ng tubo sa temperaturang malapit sa 37 C, karaniwang sa loob ng 3 oras, habang marahang hinahalo.
5. Palabnawin ang isang maliit na takal mula sa bawat tubo sa tubig na distilado upang masira ang mga selula at maging malinaw ang paghahambing ng kulay.
6. Ihambing ang tubo ng pasyente sa dalawang kontrol. Ang pagbabalik tungo sa pula ay nagpapahiwatig ng malaking kakayahang magsagawa ng reduksiyon. Ang pananatiling kayumanggi ay nagmumungkahi ng matinding kakulangan.

Isang makasaysayang pormulasyon ang gumamit ng humigit-kumulang 1 mL ng dugo kasama ang mga reagent na malapit sa 180 mM sodium nitrite, 280 mM dextrose, at 0.4 mM methylene blue. Ituring ang mga bilang na iyon bilang halimbawa mula sa literatura, hindi bilang isang espesipikasyong para sa lahat.

Pagbasa sa resulta

Pinakamahusay na nakapag-iiba ng mga resulta ang isang kwalitatibong paunang pagsusuri sa paligid ng 30 hanggang 40 porsiyento ng normal na aktibidad, gaya ng tinalakay sa rebyung ito sa Malaria Journal tungkol sa mga puwang sa pagtukoy ng G6PD. Samakatuwid, ang normal na resulta ng paunang pagsusuri ay nangangahulugang hindi natukoy ng pagsusuri ang matinding kakulangan. Hindi nito pinatutunayang ganap na normal ang aktibidad.

Bakit maaaring makapanlinlang ang paunang pagsusuri

Reticulocytosis pagkatapos ng hemolysis ang klasikong sanhi ng maling normal na resulta. Mas maraming G6PD ang nasa mga batang pulang selula ng dugo at reticulocyte kaysa sa matatandang selula. Sa isang talamak na yugto ng hemolysis, maaaring nasira na ang pinakamatatanda at pinakakulang na selula, kaya naiiwan ang isang batang populasyon na nagpapakita ng normal na aktibidad sa pagsusuri. Nalilinlang din ng parehong biyolohikal na proseso ang mga kuwantitatibong pagsusuri, hindi lamang ang mga paunang pagsusuring gumagamit ng pangkulay.

Kamakailang pagsasalin ng dugo ay nagtatago ng kakulangan dahil nag-aambag ang mga pulang selula mula sa donor ng sarili nilang enzyme sa specimen. Inililista ng Mayo Clinic Laboratories ang pagsasalin ng dugo sa mga sanhi ng hindi mapagkakatiwalaang resulta ng enzyme, kasama ng reticulocytosis at panghihimasok ng leukocyte sa pagsusuri.

Mga babaeng heterozygous ang pinakamahirap na kaso. Ang sapalarang hindi pagpapagana ng X-chromosome ay nagbubunga ng halo ng normal at kulang na mga pulang selula ng dugo, at ang kabuuang aktibidad ay maaaring maging anuman mula sa matinding kakulangan hanggang sa mukhang normal. Madalas na hindi natutukoy ng mga kwalitatibong paunang pagsusuri ang mga phenotype na nasa pagitan. Detalyadong tinatalakay ng dokumentasyon ng WHO tungkol sa pagsusuri ng G6PD ang limitasyong ito.

Ang tagal mula nang kunin ang specimen, temperatura ng pag-iimbak, pansariling paghatol sa nakikitang panghuling palatandaan, hematocrit, at kalidad ng reagent ay nagdaragdag ng pag-iiba sa pagsukat bukod pa sa mga biyolohikal na epektong ito.

Ang paunang pagsusuri ay hindi diyagnosis

Ang resulta ng paunang pagsusuri na nagpapakita ng kakulangan, nasa pagitan, o hindi tugma sa klinikal na kalagayan ay nangangailangan ng kuwantitatibong pagsusuri ng enzyme na G6PD. Itinuturing ng WHO ang kuwantitatibong spectrophotometry na may kontroladong temperatura bilang pamamaraang batayan. Sa pagsusuring iyon, nilalagyan ng glucose-6-phosphate at NADP+ ang hemolysate ng mga pulang selula, at sinusubaybayan ang nabubuong NADPH sa pamamagitan ng pagtaas ng absorbance sa 340 nm. Proporsiyonal sa aktibidad ng enzyme ang bilis ng pagbabago, at karaniwang iniaayon ito sa dami ng hemoglobin bilang mga yunit bawat gramo. Nakabuod ang kasalukuyang gawain sa mga klinikal na laboratoryo sa tala sa katalogo ng pagsusuri ng Mayo para sa aktibidad ng G6PD.

Ginagamit sa interpretasyon ang saklaw ng sangguniang napatunayan ng laboratoryo, na madalas inilalahad kaugnay ng normal na aktibidad sa populasyon, at karaniwang tinatalakay ang kakulangan malapit sa hangganang 30 porsiyento at ang aktibidad na nasa pagitan na mas mataas dito. Inilalahad ng mga target na profile ng produkto ng WHO para sa mga pagsusuri ng G6PD (2022) ang balangkas na iyon para sa diyagnosis. Kung hindi mapagkakatiwalaan ang pagtukoy sa phenotype dahil sa kamakailang hemolysis o pagsasalin ng dugo, ulitin ang pagsusuri matapos muling maging balanse ang populasyon ng pulang selula. Makapagdaragdag ng impormasyon ang molekular na pagsusuri nang hindi pinapalitan ang pagsukat ng enzyme.

Isang pagkakaibang dapat panatilihin

Ang methylene blue sa mga pagsusuring ito ay isang reagent sa laboratoryo na ginagamit ex vivo. Ibang talakayan ang katotohanang iyon kaysa sa kaligtasan ng pagbibigay ng methylene blue sa pasyente, na saklaw ng gabay tungkol sa mga kontraindikasyon ng methylene blue. Pinag-uugnay sila ng biyokimika, dahil umaasa rin ang gamot sa reduksiyong nakadepende sa NADPH, ngunit ang pangkulay sa isang test tube ay hindi katumbas ng dosis sa daluyan ng dugo. Para sa konteksto kung paano gumagana ang pangkulay bilang pangkulay ng specimen sa ibang sitwasyon, tingnan ang mga prinsipyo ng paglamlam gamit ang methylene blue, at para sa pangkat na kinabibilangan nito sa kimika, ang mga pangkulay na redox sa laboratoryo.

Itinatanong ng paunang pagsusuri kung mukhang buo ang kakayahang magsagawa ng reduksiyon. Itinatanong naman ng pagsusuri para sa kumpirmasyon kung gaano karaming enzyme ang talagang naroon. Mahusay na nagsisilbi ang pangkulay sa unang tanong, basta walang humihiling dito na sagutin ang ikalawa.