Mga pagsusuri ng lebadura gamit ang methylene blue: pagbilang ng buhay na selula kumpara sa pagsukat ng oras ng respirasyon

May dalawang tubo sa mesa ng laboratoryo. Parehong asul. Sa isa, ang mga asul na selula sa ilalim ng mikroskopyo ay nangangahulugang patay ang lebadura. Sa isa naman, ang tubong nagiging walang kulay mula sa asul ay nangangahulugang buhay at nagrerespira ang lebadura. Iisang pangkulay, magkasalungat na interpretasyon. Kapag napaghalo ang dalawang pagsusuri, mababaligtad ang bawat konklusyon.

Ang pagkakaibang ito ang paksa ng buong artikulo. Ang methylene blue ay isang pangkulay na redox: asul ito kapag oksidado, at nagiging walang kulay na leucomethylene blue kapag nareduse. Ginagamit ng pagbilang ng buhay na selula ang kimikang iyon sa isang maikling pagmamasid sa mikroskopyo. Ginagamit naman ito ng eksperimento sa respirasyon sa isang reaksiyong sinusukat ang oras sa kabuuang halo. Kailangan ng bawat isa ang sarili nitong protokol, mga kontrol, at mapanuring pagtingin.

Ang pagbilang ng buhay na selula: maikling pagkulay, agad na pagbasa

Ang protokol na ginagamit sa paggawa ng serbesa ang bersiyong may pinakapamantayang pamamaraan. Maghanda ng 0.01% w/v methylene blue sa 2% sodium citrate, ihalo ito nang 1:1 sa suspensiyon ng lebadura, at suriin ang halo matapos ang isang maikli at nakatakdang agwat. Nagkakaiba ang mga inilathalang agwat: mula 1 hanggang 2 minuto sa manwal ng Brewing Science Institute hanggang humigit-kumulang 5 minuto sa mga protokol ng pananaliksik, samantalang hinihingi ng pamamaraan ng OIV para sa mikrobiolohiya ng alak na magsuri sa loob ng 10 minuto. Umaabot sa humigit-kumulang 0.005% ang pangkulay sa halong bibilangin. Lagyan ang isang improved Neubauer chamber, at sa humigit-kumulang 400x, uriin ang mga selulang matingkad na asul bilang hindi na kayang mabuhay at ang mga walang kulay bilang kayang mabuhay. Itinuturing na buhay ang mga selulang mapusyaw na asul sa pamamaraan ng OIV, na nagpapahiwatig na ng problema sa pansariling paghuhusga na tatalakayin sa ibaba.

Nakukuha ang konsentrasyon ng selula mula sa heometriya ng chamber. Kapag binilang ang buong gitnang parisukat na 1 mm, ang bilang ng selula bawat mL ay katumbas ng N na minultiplika sa salik ng pagbabanto at sa 10^4, kung saan ang N ay ang bilang sa lugar na iyon, gaya ng nakasaad sa mga pamamaraan ng ASBC para sa lebadura. Mas simple ang proporsiyon ng buhay na selula: bilang ng mga selulang walang kulay na hinati sa kabuuang bilang ng selula, at minultiplika sa 100. Magbilang ng humigit-kumulang 400 selula upang matantiya ang proporsiyon ng buhay na selula, alinsunod sa pag-aaral ng FEMS na naghahambing ng mga pamamaraan sa paggawa ng serbesa at sa gawain ng OIV. Gumamit ng iisang tuntunin sa hangganan nang pare-pareho, halimbawa, isama ang mga selulang nasa ibaba at kaliwang linya ng grid at huwag isama ang nasa itaas at kanan.

Kailangan ng tuntunin para sa mga usbong bago simulan ang pagbilang. Karaniwang binibilang ang isang usbong bilang hiwalay na selula kapag umabot na ito sa humigit-kumulang kalahati ng laki ng inang selula, at isinasama sa ina kapag mas maliit pa rito. Anumang tuntunin ang piliin, ilapat ito sa bawat parisukat at isulat sa talaan upang magamit din ito ng susunod na tao.

Talaan ng pagbilang (i-print ito)

Ang talaang ito ay orihinal na materyal para sa artikulong ito. Kopyahin ito sa kuwaderno o mag-print ng isa para sa bawat sample.

Viability (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue). Total cells per mL = N x dilution factor x 10^4, kung saan ang N ay mula sa itinakdang lugar ng chamber. Itala ang agwat ng pagkulay sa tabi ng resulta, dahil hindi maaasahang mauulit ang isang bilang ng proporsiyon ng buhay na selula kung walang nakatalang oras nito.

Bakit nagbabago ang mga bilang ng buhay na selula

Ang oras ang unang salik na nakaaapekto, at maaari itong magkamali sa dalawang direksiyon. Nagrereduse ng pangkulay ang mga selulang aktibo ang metabolismo, kaya maaaring makita sa maagang pagbasa ang mga buhay na selula bago nila matapos ang reduksiyon at maling mauri ang mga ito bilang patay. Ngunit nakalalason din mismo ang matagal na pagkakalantad at lumilikha ito ng mga asul na selulang tunay na napinsala, kaya maling ipinapahiwatig ng pagkulay na patay na ang mga ito bago ang pagsusuri. Dahil dito, itinatakda ng isang protokol sa pagtuturo sa laboratoryo na gawin ang pag-uuri sa loob ng 5 minuto, gaya ng nakadokumento sa isang protokol ng Wisconsin para sa pagtuturo tungkol sa lebadura. Ang maingat na paglalahad ay nakadepende sa oras ang pag-uuri gamit ang methylene blue, kaya magtakda ng isang maikling agwat at panatilihin itong pareho sa bawat sample sa isang serye.

May ikalawang pagkiling ang mga sample na mababa ang proporsiyon ng buhay na selula. Nagbababala ang pamantayang pamamaraan na maaaring mas mataas kaysa sa tunay na halaga ang pagtatantiya gamit ang methylene blue kapag mas mababa sa humigit-kumulang 80% ang proporsiyon ng buhay na selula, dahil ang mga selulang nakapagrereduse pa ng pangkulay ay hindi nangangahulugang kaya pa ring magparami. Inilalarawan ng literatura sa paggawa ng serbesa ang parehong kawalan ng pagiging maaasahan kapag malaki na ang ibinaba ng kakayahang mabuhay. Ituring ang methylene blue bilang isang mabilis at tinatayang sukatan, at kumpirmahin sa pamamagitan ng pagbilang sa mga plate o isang pantulong na pangkulay ang mahahalagang desisyon kapag mababa ang proporsiyon ng buhay na selula, tulad ng muling paggamit ng isang kultura bilang panimulang lebadura.

Pangatlo ang mga epekto ng matrix. Isinasagawa ang pamamaraan ng OIV sa humigit-kumulang pH 4.6 at nagbababala itong hindi nagiging tama ang kilos ng pangkulay sa mga sample na mababa ang pH at malakas ang kapasidad na mag-buffer. Ipinapayo rin nitong huwag gamitin ang pagsusuri kapag lampas 100 g/L ang asukal, dahil nagmumukhang mapusyaw na asul ang mga selula at maaaring magbigay ng maling interpretasyon. Nakakita ang isang eksperimental na paghahambing ng pH sa pagkulay ng malaking pagbabago sa sensitibidad sa sinuring saklaw, na tugma sa isang pag-aaral ng pamamaraang gumagamit ng methylene blue na nakadepende sa pH. Hiwalay na patibong ang mga labi: ang mga nakulayang partikulo sa maruruming mash ay kahawig ng patay na selula at nagpapalaki ng pagkakaiba-iba ng resulta sa pagitan ng mga tagasuri.

Nasusukat ang pagkakaiba-ibang iyon; hindi lamang ito batay sa mga salaysay. Sa isang anim na buwang pagsubok sa pagawaan ng serbesa na iniulat sa paghahambing ng FEMS sa mga pamamaraan para sa lebadura, ang mga dobleng pagsukat gamit ang methylene blue ay may karaniwang standard deviation na 6.1%, kumpara sa 0.2% para sa flow cytometry gamit ang oxonol. Nagkaiba rin nang hanggang 13 puntos ng porsiyento ang dalawang tagasuri sa parehong sample. Natuklasan ng isang kwantitatibong paghahambing ng mga pamamaraan sa pagsukat ng kakayahang mabuhay noong 2023 na higit na mas eksakto ang fluorescence microscopy at flow cytometry, habang ipinapakitang nakadepende sa species at matrix ang pagganap ng pamamaraan. Nananatiling batayang sanggunian ang klasikong paglalarawan ng pamamaraan nina Painting at Kirsop (PMID 24430080), at inilalagay ng mas malawak na pagsusuri sa mga pamamaraan para sa kakayahang mabuhay at sigla ng lebadura (PMID 25154541) ang methylene blue sa mga pantulong na pagsusuri, sa halip na sa mga nagbibigay ng tiyak na pasya. Hindi awtomatikong mas mahusay na kapalit dito ang trypan blue: ipinapakita nito ang pagkawala ng integridad ng lamad, samantalang ipinapakita ng methylene blue ang pagpasok ng pangkulay kasama ng aktibidad sa reduksiyon, kaya maaaring magkaiba ang pag-uuri sa mga selulang nasa ilalim ng stress kapag ginamit ang dalawang pangkulay.

Ang eksperimento sa respirasyon: sukatin ang oras ng pagkawala ng asul

Hindi gumagamit ng mikroskopyo ang ikalawang pagsusuri. Inilalagay sa saradong tubo ang lebadura, glucose, at malabnaw na methylene blue, at sinusukat ng orasan kung gaano katagal bago mawala ang asul. Habang nagaganap ang metabolismo ng mga selula, lumilikha ang mga ito ng mga ekwibalenteng pangreduksiyon na nagpapalit sa asul na pangkulay tungo sa anyong walang kulay, habang ibinabalik naman ito sa oksidadong anyo ng natunaw na oxygen. Kapag napababa na ng mga selula ang oxygen, nangingibabaw ang netong reduksiyon at nawawalan ng kulay ang laman ng tubo. Kaya sumasalamin ang dulong punto sa balanse ng respirasyon, konsentrasyon ng pangkulay, at pagkakaroon ng oxygen. Dapat itong iulat bilang oras ng reduksiyon o pagkawala ng kulay ng methylene blue, hindi bilang tuwirang bilis ng pagkonsumo ng molekular na oxygen.

Gumamit ng pangkulay na higit na mas malabnaw kaysa sa pagsusuri ng kakayahang mabuhay upang mapunta ang oras sa isang madaling sukatin na saklaw. Mahusay itong ipinapamantayan ng manwal ng AQA A level para sa mga kinakailangang praktikal na gawain: 1 g glucose sa bawat 100 mL tubig na pinainit sa humigit-kumulang 30 C, 5 g tuyong lebadura na idinaragdag kaagad bago gamitin, at pangkulay na gagamitin na humigit-kumulang 0.001%, na inihahanda sa pamamagitan ng pagbabanto ng 0.1 mL ng 1% stock hanggang 100 mL. Ihalo ang 2 mL ng suspensiyon ng lebadura at glucose sa 2 mL ng pangkulay na gagamitin, hayaang umabot sa temperatura ng pagsusuri, alugin nang isang beses sa loob ng 10 segundo, simulan ang timer, at huwag nang alugin muli. Muling nagpapasok ng oxygen ang pag-alog at ibinabalik ang asul sa tubo; ito ang pinakamalaking artepaktong dulot ng pamamaraan. Ayon sa AQA, karaniwang dapat mawala ang kulay ng paghahanda sa loob ng humigit-kumulang 5 minuto sa 35 C, na may mga karaniwang oras sa pagsubok na 275 s sa 20 C, 128 s sa 35 C, at 145 s sa 45 C. Mga halimbawa ang mga ito mula sa isang pagsasaayos, hindi mga pamantayang naaangkop sa lahat. Sinusuportahan ng mga pag-aaral na nakatuon sa reduksiyon ang kwantitatibong ugnayan ng bilis ng reduksiyon at lebadurang aktibo ang metabolismo sa kontroladong mga kondisyon, kabilang ang pag-aaral na nakaindeks bilang PMID 25773544 at ang pag-aaral ng mekanismo sa Yeast (2014).

Demonstrasyon sa paglipas ng oras (orihinal na materyal)

Ang talahanayan sa ibaba ay isang orihinal na demonstrasyong ginawa para sa artikulong ito gamit ang pagsasaayos na katulad ng sa AQA na inilarawan sa itaas: 2 mL halo ng lebadura at glucose kasama ang 2 mL pangkulay na gagamitin na humigit-kumulang 0.001%, isang pag-alog sa loob ng 10 segundo, at pagkatapos ay inkubasyong hindi ginagalaw. Mga halimbawang pagbasa ang mga tala sa format na dapat gamitin ng isang pangkat ng mga mag-aaral, kung saan ang indeks ng bilis ay tinutukoy bilang 1 na hinati sa oras ng pagkawala ng kulay sa segundo. Isagawa ang pagsusuri gamit ang parehong mga tubo at palitan ang mga talang ito ng mga nasukat na halaga.

Iguhit sa grap ang indeks ng bilis kaugnay ng temperatura para sa mga tubong A, B, at C. Tumataas ang kurba at pagkatapos ay pumapatag o bumababa, na siyang inaasahang padron na pinatatakbo ng mga enzyme, hindi isang tuwid na linya. Hindi mga punto ng datos sa kurbang iyon ang mga tubong D, E, at F. Sila ang mga kontrol na nagpapahintulot na mabigyang-kahulugan ang kurba.

Mga kontrol na nagbibigay ng saysay sa bawat pagsusuri

Kailangan ng bawat pagsubok sa respirasyon ang tatlong kasamang kontrol. Dapat manatiling asul ang pinakuluan o pinatay na lebadura na may glucose at pangkulay, na nagpapatunay na nakadepende sa metabolismo ng buhay na selula ang mabilis na reduksiyon. Ang buhay na lebadura na may pangkulay ngunit walang idinagdag na glucose ay kontrol para sa substrato, ngunit asahan pa rin ang mabagal na pagkawala ng kulay dahil ginagamit ng lebadura ang mga reserba nito sa loob ng selula. Ang glucose na may pangkulay ngunit walang lebadura ang kemikal na blangko, na mahalaga dahil kayang magreduse ng methylene blue ang glucose sa alkalinong kondisyon kahit walang mga selula.

Ibang uri ng kontrol ang kailangan sa pagbilang ng buhay na selula: pagkakapare-pareho ng pamamaraan. Parehong stock ng pangkulay, parehong proporsiyon ng paghahalo, parehong agwat ng pagkulay, parehong lugar ng chamber, parehong mga tuntunin sa usbong at hangganan, at pagbilang nang hindi alam ang pagkakakilanlan ng sample kung maaari. Kapag sampung puntos ang pagkakaiba ng dalawang tagasuri, karaniwang inilalantad ng talaan ang sanhi: magkaibang oras, magkaibang batayan sa pag-uuri ng asul, o magkaibang tuntunin sa usbong. May kaugnayan ang mga teknik sa paghahanda at pagmamasid sa mga nakulayang selula sa mga pamamaraan ng simpleng pagkulay ng bakterya, habang nasa atlas ng pagkulay para sa mikroskopiya ang mas malawak na pagtalakay sa kung ano ang minamarkahan ng pangkulay sa iba't ibang specimen. Para sa pisika sa likod ng kwantitatibong pagbasa ng anumang tindi ng asul, ipinapaliwanag ng sanggunian sa absorpsiyon na may nakatalang mga kondisyon kung bakit kailangang laging kasama ng bawat koepisyente ang mga kondisyon ng solvent, pH, at konsentrasyon nito.

Piliin ang pagsusuri ayon sa tanong. Ang dami ng selulang buhay sa kasalukuyan ay tanong sa pagbilang, na sinasagot sa mikroskopyo gamit ang isang talaan. Ang antas ng aktibidad ng respirasyon ng kulturang ito ay tanong sa kinetika, na sinasagot gamit ang stopwatch at mga tubong nasa kontroladong kondisyon. Nagagamit ang methylene blue sa pareho, ngunit hindi kailanman sa iisang tubo sa iisang oras.