Methylene blue para sa pagkulay ng DNA at RNA: mga gamit sa gel at lamad

Nagpapatakbo ng agarose gel ang isang estudyante, kinukulayan ito ng methylene blue, at walang nakikita sa bahaging inaasahang may matingkad na banda. Sa katabing puwesto, kinukulayan ng isang postdoc ang lamad ng Northern blot gamit ang parehong bote ng asul na pangkulay at nakakakita ng malinaw na mga ribosomal na banda sa loob ng tatlong minuto. Ipinapalagay ng estudyante na pumalya ang gel. Hindi pumalya ang gel. Magkaiba ang dalawang gawain, at tinutugunan ang mga ito ng iisang pangkulay na may magkaibang sensitibidad, kulay ng likuran, at tuntunin para sa mga kasunod na hakbang.

Magkapareho ang kimika ng pagkulay ng DNA at RNA gamit ang methylene blue, ngunit magkaiba ang layunin. Sa gel, ipinapakita ng pangkulay kung gaano karaming nucleic acid ang nasa loob ng isang matris na may mga poro. Sa lamad, ipinapakita nito kung matagumpay ang paglilipat at kung pantay ang dami ng sample na inilagay sa mga hanay. Kapag malinaw ang pagkakaibang ito, mas madaling maunawaan ang mga protokol, limitasyon ng pagtukoy, at limitasyon ng pagiging tugma.

Ang maikling sagot

Ang methylene blue ay isang patag na kationikong pangkulay na kumakabit sa mga nucleic acid nang walang kovalenteng bigkis at sa paraang nababaligtad. Nangyayari ito sa pamamagitan ng pinagsamang elektrostatikong atraksyon sa phosphate, pagsingit sa pagitan ng mga pares ng base, at pagkabit sa minor groove. Mahalaga ang pagiging nababaligtad na ito. Maaaring kulayan ang mga banda at tingnan sa nakikitang liwanag, idokumento, at pagkatapos ay alisin ang kulay o linisin para sa cloning, hybridization, o muling paggamit ng probe.

Para sa pagkulay ng double-stranded DNA sa agarose gel gamit ang methylene blue, ang karaniwang mabilis na timpla ay 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) sa tubig, na may humigit-kumulang 15 minutes na pagkulay at humigit-kumulang 15 minutes na pag-aalis ng kulay gamit ang tubig, at tinitingnan sa isang kahong may puting ilaw. Para sa mga lamad, ang klasikong timpla para sa Northern blot ay 0.02 hanggang 0.04 percent na pangkulay sa sodium acetate na malapit sa pH 5.2, ilang minuto ng pagkulay pagkatapos ng paglilipat at pagpirmi, saka pagbabanlaw sa tubig at ganap na pag-aalis ng kulay bago ang hybridization. Katamtaman lamang ang sensitibidad: sampu-sampu hanggang daan-daang nanograms bawat banda sa gel sa magagandang kondisyon, at 0.5 hanggang 1 microgram ang nakalista sa mga konserbatibong gabay. Mas mataas ito nang ilang orden ng magnitud kaysa sa ethidium bromide at mga pangkulay na SYBR. Sa mga lamad, walang kapaki-pakinabang na iisang limitasyon ng pagtukoy para sa isang transcript dahil pangunahing ipinapakita ng pangkulay ang saganang ribosomal RNA at ang kabuuang materyal na inilagay. Huwag ipalit ang solusyon ng suplementong ibinebenta sa tingi sa alinmang timpla. Ipinapalagay ng mga napatunayang pamamaraan ang paggamit ng pangkulay na analytical grade, mga buffer na may tiyak na komposisyon, at paghawak na walang RNase kapag may RNA.

Paano gumagana ang pagkabit, at saan ito maaaring makalinlang

May tatlong bahagi ang kapaki-pakinabang na modelo. Una, naaakit ang sistemang singsing na may positibong karga sa phosphate backbone na may negatibong karga. Ipinakikita ng mga pag-aaral na spektroskopiko na nangingibabaw ang elektrostatikong sangkap na ito kapag mababa ang asin, samantalang ipinakikita ng pagmomodelo at molecular dynamics na matatag na paraan ng pagkabit sa double-stranded DNA ang pagsingit sa pagitan ng mga base at pagkabit sa minor groove, gaya ng binuod sa isang pag-aaral na spektroskopiko ng pagkabit ng methylene blue sa DNA. Ikalawa, may bahagyang pagkiling sa GC: pinapaboran ng pagmomodelo ang magkakasunod na CpG at GpC, at nag-uulat ang mga eksperimento ng mas pinapaborang pagkabit sa mga duplex na mayaman sa GC sa pag-aaral tungkol sa mga pagkiling ng methylene blue sa pagsingit sa pagitan ng mga base, ngunit kumakabit din ito sa mga AT duplex. Hindi nakatukoy sa isang partikular na pagkakasunod-sunod ng mga base ang karaniwang pagkulay. Ikatlo, pangunahing kumakabit ang single-stranded DNA at RNA sa pamamagitan ng elektrostatikong atraksyon at pagpapatong sa mga naaabot na base at mga rehiyong duplex. Kaya nag-iiba ang tindi ng pagkulay ayon sa haba, pagkakasunod-sunod ng mga base, at sekundaryang estruktura.

May dalawang bunga ito. Dahil walang kovalenteng bigkis ang pagkabit, nahuhugasan ang pangkulay. Mabilis kumupas ang mga banda sa polyacrylamide maliban kung sadyang ipinirmi, at may espesyal na bersiyong may permanenteng pagpirmi dahil pansamantala lamang ang karaniwang pagkulay, gaya ng inilarawan nina Soto at Draper para sa mga PAGE gel. Dahil isang photosensitizer ang pangkulay, ang matagal na pag-iilaw nang maliwanag sa kinulayang DNA habang may oxygen ay maaaring mag-oxidize ng guanine at kalaunan ay magdulot ng mga putol sa mga hibla. Detalyado ang mekanismong ito sa pag-aaral tungkol sa oksidasyon ng guanine na pinapagana ng methylene blue sa liwanag. Naiiwasan ng maikling pagtingin sa ilalim ng puting ilaw ang kilalang pinsala mula sa UV sa mga klasikong pamamaraan ng ethidium bromide, at tunay na kapaki-pakinabang ito kapag kinukuha ang DNA para sa kasunod na paggamit. Mas banayad ang nakikitang liwanag, ngunit hindi ito walang pinsala. Panatilihing maikli ang pag-iilaw kapag gagamitin ang DNA sa cloning. Para sa mas malawak na photochemistry sa likod ng pag-iingat na ito, tingnan ang dalawang landas sa photochemistry ng methylene blue. Para sa pares na redox at mga estado ng karga na nagpapaliwanag kung bakit kumakabit ang oxidized na anyo ngunit hindi ang reduced na anyo, tingnan ang kimika ng estruktura at mga katangian ng methylene blue.

Unang gawain: pagkulay sa loob ng mga gel

Isang tanong ang sinasagot ng pagkulay ng gel: sapat ba ang nucleic acid sa bandang ito para makita ng mata? Ang double-stranded DNA sa agarose ang pinakanapag-aralang kaso. Pinatunayan ng orihinal na pamamaraan nina Flores at mga kasamahan para sa gel gamit ang methylene blue ang mabilis na protokol na 0.02 percent sa 1 percent agarose at ipinakita ang matagumpay na pagkuha at cloning pagkatapos nito. Makikita rin ang parehong protokol ng tagapagtustos sa pahina ng produktong methylene blue ng IBI Scientific, kung saan magkatabing nakalista ang 0.04 percent na timpla para sa lamad at ang mabilis na bersiyon para sa gel.

Praktikal na pamamaraan:

1. Patakbuhin ang gel gaya ng karaniwan. Kulayan pagkatapos ng electrophoresis, hindi habang isinasagawa ito, maliban kung napatunayan na ang paglilipat o kakayahang maghiwalay ng mga banda para sa isang binagong pamamaraan.
2. Ilubog sa 0.02 percent w/v methylene blue sa distilled water, na may banayad na paggalaw, nang humigit-kumulang 15 minutes.
3. Alisin ang kulay sa pamamagitan ng ilang pagpapalit ng tubig, na humigit-kumulang 15 minutes sa kabuuan, hanggang mabawasan ang kulay ng matris at malinaw na lumitaw ang mga banda.
4. Kunan agad ng larawan sa isang kagamitang nagbibigay ng puting ilaw.

Magkaiba ang kilos ng agarose at polyacrylamide. Naiiwan ang pangkulay sa matris ng agarose, kaya ang pag-aalis ng kulay ang mabagal na hakbang. Mabilis makulayan ang manipis na mga polyacrylamide gel ngunit mabilis ding mawala ang pangkulay. Nakatutulong ito sa pagputol ng banda para sa kasunod na paggamit ngunit hindi maganda para sa mga rekord na kailangang mapanatili. Maaaring matukoy ang lokasyon ng mga sintetikong oligonucleotide sa polyacrylamide gamit ang parehong 0.02 percent na timpla sa loob ng 20 hanggang 30 minutes na may paulit-ulit na paghuhugas sa tubig, ayon sa mga itinatag na pamamaraang PAGE na katulad ng nasa Current Protocols. May mga naiulat na napakalabnaw na bersiyon na malapit sa 0.0002 percent sa malabnaw na TBE para sa mga oligo na ihahanda para sa kasunod na paggamit sa loob ng ilang oras, ngunit mas mahina ang batayan ng ebidensiya.

Mahalaga kung DNA o RNA ang ginagamit. Ang double-stranded DNA ang nagbibigay ng pinakamalakas na pagkabit na nakabatay sa estruktura. Nakukulayan ang RNA at single-stranded DNA, ngunit mas mahina at hindi gaanong mahuhulaan ang resulta. Para sa mga formaldehyde agarose RNA gel, nilalaktawan ng karamihan sa mga laboratoryo ang asul na pagkulay sa loob ng gel at inililipat muna ang RNA sa isang lamad bago ito kulayan doon. Ipinagpapalit ng hakbang na ito ang mahinang signal sa gel sa mas malinaw na signal sa lamad at isang rekord ng dami ng sample na inilagay.

Ikalawang gawain: pagkulay sa mga lamad

Ibang tanong ang sinasagot ng pagkulay ng lamad: matagumpay ba ang paglilipat, at maihahambing ba ang mga hanay? Ang klasikong gamit ay ang nababaligtad na pangkulay para sa Northern blot nina Herrin at Schmidt. Orihinal itong gumagamit ng 0.04 percent na pangkulay sa 50 mM sodium acetate sa pH 5.0 sa loob ng 2 hanggang 3 minutes, na sinusundan ng pagbabanlaw sa tubig. Naalis ang kulay gamit ang malabnaw na SDS sa SSPE bago ang hybridization.

Ganito ang malawakang ginagamit na makabagong bersiyon:

1. Ilipat ang RNA o denatured DNA sa nylon o nitrocellulose, pagkatapos ay ipirmi sa pamamagitan ng UV crosslinking o pagbe-bake upang hindi mawala ang sample habang kinukulayan.
2. Opsiyonal ngunit karaniwan: basain ang lamad sa 5 percent acetic acid nang humigit-kumulang 15 minutes.
3. Kulayan nang 5 hanggang 10 minutes sa 0.02 hanggang 0.04 percent methylene blue sa 0.3 hanggang 0.5 M sodium acetate na malapit sa pH 5.2.
4. Banlawan at alisin ang kulay sa tubig nang 5 hanggang 15 minutes, idokumento, at pagkatapos ay alisin ang natitirang pangkulay bago ang hybridization.

Nangingibabaw ang nylon na may positibong karga sa mga gawaing Northern. Gumagana rin ang nitrocellulose sa parehong pamamaraang gumagamit ng acetic acid at acetate. Ginagamit ang larawan upang kumpirmahin ang paglilipat, ihambing ang mga bandang 28S at 18S (o 23S at 16S para sa RNA ng bakterya), markahan ang mga ladder at pamantayan, at magpanatili ng tinatayang rekord para sa normalisasyon batay sa kabuuang RNA. Sinusukat ng mga nailathalang pamamaraang Northern ang dami sa mga kinulayang ribosomal na banda upang suriin ang dami ng sample na inilagay, kabilang ang pananaliksik sa agham ng pagawaan ng gatas na gumamit ng mga ribosomal na bandang kinulayan ng methylene blue para sa normalisasyon. Maaaring makita ang mga lamad ng Southern sa parehong paraan, ngunit mas matagal nang ginagamit ang pangkulay bilang pagsusuri ng dami ng sample at paglilipat sa Northern. Denatured din ang DNA sa Southern bago ilipat, kaya hindi direktang naaangkop dito ang mga bilang ng sensitibidad sa gel.

Mga limitasyon ng pagtukoy at kulay ng likuran: saan nahuhuli ang asul

Sadyang pagtataya lamang ang paghahambing sa ibaba. Nakasalalay ang pagganap ng pangkulay sa porsiyento ng gel, lapad ng banda, optika, at maingat na pag-aalis ng kulay. Ituring ang bawat bilang bilang isang orden ng magnitud, hindi isang espesipikasyon.

Ang pagkontrol sa kulay ng likuran ang nagpapasiya kung magagamit ang katamtamang signal. Matindi ang kulay ng malayang pangkulay, kaya nakukuha ang kaibahan sa pamamagitan ng pag-aalis ng hindi nakakabit na pangkulay nang hindi inaalis ang nakakabit na pangkulay. Bihirang magdagdag ng sensitibidad ang mas puro na pangkulay. Pangunahin nitong pinahahaba ang oras ng pag-aalis ng kulay. Magpatakbo ng serye ng mga dilution gamit ang mismong gel, lamad, at kamera, at gamitin lamang ang saklaw kung saan nananatiling proporsiyonal sa inilagay na dami ang integrated density. Maaaring gamitin ang methylene blue para sa semikwantitatibong normalisasyon ng dami ng sample na inilagay. Hindi ito isang kwantitatibong pagsusuring may malawak na dynamic range dahil nag-iiba sa bawat hanay ang kapasidad ng lamad, kahusayan ng paglilipat, saturasyon, at pag-aalis ng kulay.

Mga limitasyon ng pagiging tugma: ano ang nananatiling magagamit pagkatapos ng pagkulay

Naipakita na ang cloning pagkatapos ng asul na pagkulay. Pinutol nina Flores at mga kasamahan ang mga kinulayang banda sa agarose, kinuha ang DNA, at isinagawa ang ligation at transformation. Iniulat nilang mas mahusay ang cloning kaysa pagkatapos gumamit ng ethidium bromide na may UV. Ang malamang na dahilan ay mas kaunting pinsala mula sa liwanag, hindi isang benepisyo mula mismo sa pangkulay. Panatilihing maikli ang pagkakalantad sa puting ilaw at linisin ang nakuhang DNA gamit ang karaniwang proseso ng gel extraction.

Mas kaunti ang ebidensiya para sa PCR at sequencing. Kumakabit sa mga nucleic acid ang natitirang pangkulay, kaya alisin ang kulay at linisin bago ang mga hakbang na gumagamit ng enzyme. Inaasahang gagana ang DNA na wastong napuripika mula sa isang asul na gel, ngunit hindi pa mahusay na nasusukat kung gaano karaming natitirang pangkulay ang kayang tiisin ng iba't ibang polymerase at kimika ng sequencing. Huwag itong ipagpalagay.

Tugma ang blot hybridization kapag mahigpit na sinusunod ang pagkakasunod-sunod: ilipat, ipirmi, kulayan, idokumento, alisin ang kulay, at isagawa ang hybridization. Iyan ang disenyo nina Herrin at Schmidt. Ibang pamamaraan ang pagkulay bago ilipat o paglaktaw sa pag-aalis ng kulay, at nangangailangan ito ng sarili nitong pagpapatunay. Pagkatapos alisin ang pangkulay, karaniwang naipagpapatuloy ang pag-aalis ng probe at muling paggamit ng probe. Para sa pagkulay sa antas ng selula gamit ang parehong pamilya ng pangkulay, at kung bakit hindi naaangkop sa mga pamamaraang gumagamit ng buhay na selula ang lohika para sa mga nakapirming preparasyon sa film, tingnan ang atlas ng pagkulay para sa mikroskopiya.

Gumagana ang pagputol ng banda para sa agarose na ihahanda para sa kasunod na paggamit at para sa mga oligo sa PAGE na natukoy gamit ang asul, basta iwasan ang bersiyong may permanenteng pagpirmi. Makatwiran sa kimika ang electroelution pagkatapos alisin ang kulay para sa isang pangkulay na nababaligtad ang pagkabit, ngunit kakaunti ang datos mula sa mga kontroladong pag-aaral tungkol sa dami ng nakukuhang sample na partikular sa methylene blue. Alisin ang asin o magsagawa ng presipitasyon pagkatapos ng elution.

Mga paulit-ulit na problema

Karaniwang nangangahulugan ang maputlang mga banda sa gel na napakaliit ng masa para sa isang pangkulay na nakabatay sa nakikitang kulay, lalo na para sa maiikling single-stranded na target o RNA. Maglagay ng mas maraming sample, gumamit ng sariwang pangkulay, pahabain muna ang pagkulay bago taasan ang konsentrasyon, at ihinto nang mas maaga ang pag-aalis ng kulay. Ang gel na lubusang asul at walang kaibahan ay karaniwang nangangahulugan ng sobrang pagkulay o kulang na pagpapalit ng tubig. Inaasahang resulta ng kimika ang pagkupas ng mga banda sa PAGE, hindi pagkabigo ng pangkulay. Kunan agad ng larawan. Maaaring tumukoy ang hindi pantay na kulay ng likuran sa lamad sa mga tupi, bula, bakas ng daliri, hindi pantay na paggalaw, o hindi pantay na paglilipat. Huwag itong ituring na hindi pantay na dami ng sample kung walang kontrol sa hybridization. Maaaring mangahulugan ng pagkasira ang mahina at pahid-pahid na ribosomal na pattern, ngunit maaari rin itong magmula sa hindi kumpletong paglilipat, napakakaunting kabuuang RNA (ang karaniwang mga hanay ay may ilang micrograms hanggang sampu-sampung micrograms), o labis na pag-aalis ng kulay. Ipinapakita ng pangkulay ang saganang ribosomal RNA. Hindi nito ipinapakita ang isang partikular na transcript. Gawain iyon ng probe.

Kaligtasan at paghawak nang walang labis na pag-aangkin

Mas simple ang paghawak sa methylene blue kaysa sa ethidium bromide, ngunit hindi ito walang panganib. Inuuri ng kasalukuyang safety data sheet ng MilliporeSigma ang pangkulay bilang acute oral toxicity Category 4, nakapipinsala kung malulunok, at kailangang itapon sa pamamagitan ng aprubadong paraan ng pagtatapon ng basura ayon sa SDS ng methylene blue ng Sigma-Aldrich. May mas matitinding babala tungkol sa genotoxicity ang ethidium bromide, kabilang ang pinaghihinalaang epekto sa mga selulang reproduktibo sa SDS ng ethidium bromide ng Sigma-Aldrich. Karaniwang inihihiwalay ang mga gel at solusyon nito bilang mapanganib na basurang kimikal, gaya ng nakasaad sa gabay ng Thermo Fisher sa mga pangkulay ng nucleic acid. Sundin ang SDS at mga tuntunin ng institusyon para sa pareho. Panatilihing tuyo at mahigpit na nakasara ang tuyong pangkulay, muling gamitin ang solusyong pangkulay ayon lamang sa pinapayagan ng protokol, itago nang tuyo ang mga kinulayang lamad sa pagitan ng mga filter sheet, at kunan ng larawan ang mga gel bago kumalat ang mga banda.

Tandaan ang pangungusap para sa laboratoryo. Sinusuri ng mga gel kung makikita ang malaking dami ng sample sa ilalim ng puting ilaw. Sinusuri ng mga lamad ang paglilipat at dami ng sample bago isagawa ng probe ang mas sensitibong pagtukoy. Iisang pangkulay ang ginagamit para sa dalawa, na may katamtamang sensitibidad, nababaligtad na pagkabit, at mahigpit na pagkakasunod-sunod ng mga hakbang.