Methylene blue laban sa mga biofilm: ano ang sinusukat ng mga pag-aaral sa laboratoryo na gumagamit ng liwanag

Ang biofilm ay hindi basta kumpol ng mga selulang nakalutang sa likido. Isa itong istruktura: mga selulang nakakabit sa isang ibabaw, nakapaloob sa sariling likhang matriks ng mga polysaccharide, protina, at DNA sa labas ng mga selula, na may unti-unting pagkakaiba sa antas ng oxygen at sustansiya mula sa labas hanggang sa loob. Ang istrukturang ito ang dahilan kung bakit ang isang tambalang pumapatay sa nakalutang na bakterya sa loob ng ilang minuto ay maaaring hindi gumana laban sa parehong mga organismong pinalaki bilang isang sapin. Kailangang suriin ang anumang pahayag tungkol sa methylene blue at mga biofilm ayon sa istrukturang iyon, dahil ang matriks ang nagtatakda kung gaano karaming pangkulay ang nakararating sa mga selula at gaano karaming liwanag ang nakararating sa pangkulay.

Eksaktong tatlong sanggunian ang saklaw ng pagsusuring ito. Ang isa ay nagbibigay ng batayang konteksto. Ang dalawa ay mga eksperimento sa laboratoryo. Ang paghihiwalay sa mga tungkuling iyon ang mismong pamamaraan, at pinipigilan nito ang pinakakaraniwang pagkakamali sa paksang ito: ang pagsipi sa resulta mula sa isang lalagyang panglaboratoryo na para bang ebidensiya iyon para sa paggamot ng impeksiyon sa isang tao.

Kimika ang batayang sanggunian, hindi pagpatay sa mikroorganismo

Ang pinakamatanda sa tatlo ay isang salaysay na pagsusuri sa pagbuo ng mga phenothiazinium photosensitizer na inilathala noong 2005. Sinusundan nito ang methylene blue mula sa pagiging pangkulay noong ika-19 na siglo hanggang sa pagiging panimulang tambalan para sa photodynamic therapy ng kanser at kalaunan para sa photodynamic antimicrobial chemotherapy. Ang ambag nito ay paglalarawan ng ugnayan ng istruktura at aktibidad: ang methylation ng chromophore ay nagpapataas ng lipophilicity, ani ng singlet oxygen, at lakas ng pagpatay sa bakterya sa tulong ng liwanag, habang pinapabagal ang reduction tungo sa hindi gaanong aktibong anyong leuco. Malinaw rin nitong inilalahad ang problema sa larangang ito. Karamihan sa mga ulat ay gumamit ng karaniwang komersiyal na pangkulay, at kakaunti lamang ang pagbuo ng mga derivative.

Gamitin ang pagsusuring iyon para sa bahagi ng mekanismo sa iyong pag-unawa: inilalagay ng liwanag ang pangkulay sa isang excited state, at nakikipag-ugnayan ang triplet state sa oxygen sa pamamagitan ng Type II na paglilipat ng enerhiya upang makabuo ng singlet oxygen o sa pamamagitan ng Type I na paglilipat ng electron upang makabuo ng mga radical. Ang pag-atakeng ito na may maraming salik ang dahilan kung bakit hindi gaanong naaangkop sa photodynamic na pagpatay ang mga karaniwang mekanismo ng resistansiya. Huwag itong sipiin bilang batayan ng pagbaba sa log. Wala itong sinukat na ganoon. Ang mas malawak na potokimika sa likod ng mekanismong iyon ay inilalahad sa koleksiyon ng ebidensiya tungkol sa photodynamic therapy, at ang mga tuntunin sa wavelength na nagtatakda kung kayang pasimulan ito ng isang partikular na lampara ay tinatalakay sa kung paano sumisipsip ng pulang liwanag ang methylene blue.

Dalawang eksperimento sa biofilm, dalawang magkaibang konsepto ng kinalabasan

Parehong sinusubok ng dalawang eksperimental na papel ang photodynamic na pagkilos ng methylene blue sa mga biofilm sa bibig sa 660 nm, ngunit halos wala na silang ibang pagkakatulad. Magkakaibang komunidad, magkakaibang edad, magkakaibang pormulasyon ng pangkulay, magkakaibang dosis ng liwanag, at higit sa lahat, magkakaibang sukatan ng kinalabasan. Ang pagkakaibang iyon ang punto ng artikulong ito, at iyon din ang ipinapakita ng orihinal na talahanayan ng paghahambing sa ibaba.

Ang una ay isang in vitro na pag-aaral sa isang hinog na biofilm na binubuo ng maraming species sa ilalim ng gilagid na inilathala noong 2024. Tatlumpu't tatlong species ang sabay-sabay na pinalaki sa mga pin na polystyrene sa isang Calgary Biofilm Device, pinakain sa kondisyong walang oxygen, pinalitan ang medium pagkatapos ng 72 hours, at ipinagpatuloy ang paglaki hanggang sa nakatakdang 7 days. Gumamit ang paggamot ng malayang methylene blue sa 0.01 percent kasama ang pulang LED na 660 nm sa humigit-kumulang 330 mW per square cm sa loob ng 5 minutes mula sa layong 2 mm, na kapag kinuwenta ay humigit-kumulang 99 J per square cm. Malinaw na factorial ang disenyo, na may apat na pangkat: kontrol na hindi ginamot, pangkulay na walang liwanag, liwanag na walang pangkulay, at pangkulay kasama ang liwanag.

Ang ikalawa ay isang in vitro na pag-aaral sa biofilm sa bibig na binubuo ng mga unang kumokolonisang mikroorganismo na inilathala noong 2021. Apat na species ng Streptococcus ang sabay-sabay na pinalaki sa loob ng 24 hours sa mga plate na may 96 na balon at 1 percent sucrose. Ang photosensitizer ay methylene blue na ikinabit sa mga nanoparticle ng beta cyclodextrin sa 4.65 micromolar, isang pormulasyon sa paghahatid na nilayong magdala ng pangkulay sa kabila ng mga hadlang ng biofilm. Parehong pula sa 660 nm ang dalawang pinagmumulan ng liwanag, na may pagkakalantad na 90 second, ngunit malaki ang pagkakaiba ng mga dosis: 320 J per square cm para sa pangkat na gumagamit ng laser at 8.1 J per square cm para sa pangkat na gumagamit ng LED. Kasama sa mga kontrol ang pangkulay na walang liwanag, laser lamang, LED lamang, saline bilang negatibong kontrol, at 0.2 percent chlorhexidine bilang pamantayang antimicrobial na paghahambingan.

Ang isang komunidad na walang oxygen, may 33 species, at 7 day ang edad at isang sapin ng mga unang kumokolonisang mikroorganismo na may 4 na species at 24 hour ang edad ay magkaibang sistema ng pagsukat. Hindi maaaring pagsamahin at kunin ang average ng mga sumusunod na bilang.

Ano talaga ang sinukat ng bawat pag-aaral

Sa pag-aaral sa hinog na biofilm, ang mga sukatan ng kinalabasan ay aktibidad ng metabolismo sa pamamagitan ng TTC reduction na binasa sa 485 nm at dami ng bakterya sa pamamagitan ng checkerboard DNA DNA hybridization gamit ang mga probe para sa 33 species, na may hangganan ng pagtukoy na malapit sa 10,000 selula. Walang pagpapalago sa plate upang bilangin ang mga nabubuhay na mikroorganismo, walang pagsukat ng biomass gamit ang crystal violet, walang pagkuha ng larawan ng mga buhay at patay na selula, at walang pagsubaybay sa muling paglaki. Binawasan ng LED lamang ang aktibidad ng metabolismo nang humigit-kumulang 50 percent kumpara sa mga pangkat na walang LED, at binawasan ito ng pangkulay kasama ang LED nang humigit-kumulang 55 percent. Ayon sa estadistika, kabilang ang pangkulay lamang sa parehong pangkat ng kontrol na hindi ginamot. Sa mga bilang na hinango sa DNA, ang pangkulay lamang, LED lamang, at pangkulay kasama ang LED ay pawang makabuluhang mas mababa kaysa sa kontrol, ngunit walang makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng tatlo. Tuwirang inilalahad ng mga may-akda ang implikasyon: hindi winasak ng mga paggamot ang naitatag nang nakakabit na biofilm na binubuo ng maraming mikroorganismo, at kailangang guluhin sa mekanikal na paraan ang istruktura ng hinog na periodontal biofilm, kung saan ang photodynamics ay maaari lamang maging pandagdag.

Sa pag-aaral sa mga unang kumokolonisang mikroorganismo, ang sukatan ng kinalabasan ay mga nabubuhay na mikroorganismong nakuha sa piling culture media, na ipinahayag sa logarithmic na sukatan. Hindi naiiba sa saline ang pangkat na may pangkulay ngunit walang liwanag. Parehong pinababa ng dalawang pangkat na pinagana ng liwanag—laser kasama ang nakapaloob na pangkulay at LED kasama ang nakapaloob na pangkulay—ang bilang ng mga nabubuhay na mikroorganismo nang hanggang humigit-kumulang 4 log kumpara sa negatibong kontrol, katumbas ng 10,000 ulit o 99.99 percent na pagbaba sa sukatang iyon, at ni isa ay hindi naiiba sa chlorhexidine ayon sa estadistika. Hindi iniulat ang mga halaga para sa liwanag lamang at pangkulay na walang liwanag bilang magkahiwalay na mapagkakatiwalaang bilang sa log, kaya ang tapat na buod ay yaong sinusuportahan ng papel: ang nakapaloob na pangkulay na pinagana ng liwanag ang nagdulot ng pagbaba, hindi ang pangkulay na walang liwanag, at ang laki ng epekto ay katumbas ng pamantayang antiseptiko sa modelong ito ng batang biofilm.

Wala sa dalawang papel ang sumukat sa muling paglaki pagkatapos ng paggamot, natitirang biomass, o istruktura ng matriks. Walang sinasabi ang pagbaba ng CFU tungkol sa natitirang matriks. Walang sinasabi ang pagbaba ng metabolismo tungkol sa mga nakaligtas. Hindi matutukoy ng bilang batay sa DNA kung alin ang buhay.

Paghahambing ng mga pamamaraang pansukat at sukatan ng kinalabasan

Ang talahanayang ito ang materyal na paghahambing para sa artikulong ito. Basahin nang pahalang ang isang hanay upang makita kung ano ang pinatutunayan ng isang pag-aaral, at basahin nang pababa ang isang kolum upang makita kung aling mga tanong ang hindi sinasagot ng alinman sa dalawang pag-aaral.

Tatlong pagkakaiba ang dapat bigyang-diin. Una, sa hinog na modelo, naipapaliwanag ng pangkat na liwanag lamang ang halos buong epekto sa metabolismo, kaya ang bilang na 55 percent ay hindi pagpatay na dulot ng pangkulay. Ikalawa, sa batang modelo, walang aktibidad ang pormulasyon na walang liwanag at lumilitaw lamang ang epekto kapag may liwanag, na siyang palatandaan ng pagpapagana sa pamamagitan ng liwanag. Ikatlo, ang 80 percent na pagbaba sa mga bilang na hinango sa DNA ay malapit sa 0.7 log sa matematika kung ang salik ay bilang ng mga nabubuhay na mikroorganismo, ngunit hindi iyon ang sinusukat, kaya hindi ito dapat kailanman sipiin bilang pagpatay na sinusukat sa log. Ang kaugnay na konteksto ng biofilm sa ngipin ay tinipon sa pananaliksik sa biofilm sa bibig at ngipin, at ang pangkalahatang paraan ng paghihiwalay sa mga modelo, paraan ng paghahatid, at sukatan ng kinalabasan sa iba't ibang pag-aaral ay detalyado sa gabay sa mga pamamaraang panglaboratoryo.

Bakit kailangan ng sariling mga tuntunin sa pagbasa ang mga pag-aaral sa biofilm

Apat na salik ang nagtatakda kung may kahulugan ang isang resulta ng methylene blue sa biofilm na lampas sa mismong plate nito.

Una ang edad at matriks ng biofilm. Mas makapal ang mas matatandang biofilm, mas maraming ugnayang nagdurugtong sa istruktura nito, at mas mahirap pasukin ng pangkulay. Tinukoy ng mga may-akda noong 2021 ang pagpasok ng pangkulay at mahinang paglaganap ng liwanag sa organisadong biofilm bilang pangunahing mga limitasyon. Ang mga estratehiya sa tagapagdala, tulad ng pagpapaloob sa cyclodextrin, ay mga pagtatangkang tugunan mismo ang limitasyong iyon, kaya isang eksperimental na salik ang pormulasyon at hindi basta detalye lamang.

Ikalawa ang pagkukuwenta ng dosis. Halos apatnapung ulit ang saklaw ng mga halaga ng fluence dito, mula 8.1 hanggang 320 J per square cm sa parehong wavelength, at ang irradiance ay mula 90 mW hanggang ilang W per square cm. Hindi nangangahulugan ng parehong pagkakalantad ang parehong wavelength, at wala sa dalawang pag-aaral ang sistematikong nagbabago ng dosis nang sapat upang matukoy ang isang kurba.

Ikatlo ang mga kontrol. Hindi maaalis ng isang pag-aaral na walang pangkat ng pangkulay na walang liwanag ang posibilidad ng likas na toxicity, at hindi maiaatang ng isang pag-aaral na walang pangkat ng liwanag lamang ang anumang epekto sa pagpapagana sa pamamagitan ng liwanag. Kasama sa dalawang papel ang parehong kontrol, na isang kalakasan nila, at ipinapakita ng papel sa hinog na biofilm kung bakit mahalaga ang pangkat na liwanag lamang: kung wala ito, mababasa ang resulta sa metabolismo bilang epekto ng pangkulay.

Ikaapat ang mga sukatan ng kinalabasan. Ang kakayahang mabuhay, metabolismo, dami batay sa DNA, biomass, istruktura, at muling paglaki ay anim na magkakaibang pahayag. Walang papel dito na sumusukat ng higit sa dalawa. Partikular na wala sa lahat ang muling paglaki, kaya hindi nasukat ang pagpapatuloy ng epekto sa halip na naipakita ito.

Ano ang hindi nito napapatunayan tungkol sa paggamot ng impeksiyon

Wala sa mga paghahandang ito ang may sirkulasyon, mga selula ng sistemang panlaban ng katawan, daloy ng laway, pagpapalitan ng likido sa pagitan ng ngipin at gilagid, o mekanikal na pag-aalis ng nakakapit na materyal. Ang konsentrasyon ng pangkulay sa isang balon ay hindi konsentrasyon sa tisyu pagkatapos ng anumang paraan ng pagbibigay sa tao. Ang isang beses na pagkakalantad sa loob ng 5 minute o 90 second ng isang bata o kahit hinog na biofilm sa laboratoryo ay hindi isang kurso ng therapy. Sinasabi ito mismo ng mga may-akda ng pag-aaral sa hinog na biofilm sa pamamagitan ng paglalatag sa photodynamics bilang posibleng pandagdag sa mekanikal na pag-aalis sa halip na isang nakapag-iisang paraan ng lubusang pagpuksa.

Limitado at matibay ang tamang buod. Maaaring sugpuin ng methylene blue na pinagana ng liwanag ang metabolismo at dami batay sa DNA sa isang hinog na komunidad sa bibig sa laboratoryo nang hindi ito winawasak, kung saan liwanag lamang ang gumagawa ng malaking bahagi ng epekto sa metabolismo sa kaayusang iyon. Maaaring pababain ng pangkulay na dala ng cyclodextrin at pinagana ng liwanag ang bilang ng mga nabubuhay na mikroorganismo nang ilang order of magnitude sa isang batang streptococcal biofilm sa laboratoryo, sa antas na maihahambing sa chlorhexidine sa parehong modelo. Kung mailalapat ang alinman sa mga obserbasyong ito sa impeksiyon sa isang tao ay nakasalalay sa paghahatid, pag-abot ng liwanag, oxygen, anatomiya, at mga klinikal na sukatan ng kinalabasan na hindi kailanman idinisenyong sukatin ng mga eksperimentong ito.