Methylene blue at progeria: mga aral mula sa isang modelo ng pagtanda ng selula

Ang pagbabago ng isang titik sa isang gene ay nagpapabilis sa pagtanda ng mga bata sa nakakatakot na antas. Pagkalagas ng buhok, paninigas ng mga kasukasuan, pagkipot ng mga arterya, at inaasahang haba ng buhay na umaabot lamang sa mga taon ng pagiging tinedyer. Ang sakit na iyon ay Hutchinson-Gilford progeria syndrome, at sa loob ng maraming taon, nakatuon ang pananaliksik dito sa nukleus, kung saan nagdudulot ng pinsala ang mutant na protina. Ibang tanong ang sinuri ng isang pag-aaral noong 2016 mula sa University of Maryland: ano ang hitsura ng mitochondria sa mga selulang ito? Iniugnay ng sagot ang dalawang kompartimento ng selula, at nakaapekto sa pareho ang isang asul na pangkulay na isang siglo nang ginagamit.

Ang pag-aaral ay isinagawa nina Xiong at mga kasamahan, at inilathala sa Aging Cell noong 2016. Gumamit lamang ito ng mga selulang pinalaki sa laboratoryo. Ang katotohanang iyon ang batayan ng lahat ng sumusunod. Totoo at tiyak ang mga natuklasan. Gayon din katiyak ang agwat ng mga ito sa anumang paggamot.

Ang modelo: isang mutasyon, isang protinang kumakapit

Nagsisimula ang progeria sa pagpapalit ng C ng T sa posisyon 1824 ng LMNA gene. Hindi binabago nito ang isang amino acid. Ina-activate nito ang isang nakatagong splice site, na nag-aalis ng 50 amino acid mula sa protinang lamin A. Ang pinaikling produkto, na tinatawag na progerin, ay nawawalan ng cleavage site na karaniwang nagpapahintulot sa selula na alisin ang farnesyl na pang-angkla nito. Kaya nananatiling permanenteng may nakakabit na farnesyl ang progerin at nakadikit sa panloob na lamad ng nukleus, kung saan ang normal na lamin A ay paulit-ulit na kumakabit at kumakalas.

Malawak na naidokumento ang mga epekto sa nukleus at nakikita ang mga ito sa ilalim ng mikroskopyo. Nagkakaroon ng mga umbok at kulubot ang mga nukleus sa halip na mapanatili ang makinis na hugis-itlog. Numinipis ang heterochromatin, ang siksik at hindi aktibong DNA na karaniwang nakahanay sa gilid ng nukleus. Nagbabago ang ekspresyon ng libu-libong gene. Isipin ang nuclear lamina bilang balangkas sa likod ng wallpaper: kapag ang isang bahagi ng balangkas ay naiwelding sa maling posisyon, umuumbok ang dingding at nababaluktot ang disenyo ng papel sa buong silid.

Gumamit ang pag-aaral ng mga fibroblast ng balat mula sa mga pasyenteng may progeria, kasabay ng mga selulang pangkontrol na dumaan sa kaparehong bilang ng paglilipat sa bagong kultura. Gumamit din ito ng pangalawang linya ng selula na binago upang direktang gumawa ng progerin ang mga normal na fibroblast. Nagkaroon ng parehong mga depekto ang mga binagong selula, na nagtuturo sa progerin bilang sanhi sa halip na sa kasaysayan ng mga pasyente o sa tagal ng pagpapalaki sa kultura. Sumunod sa dami ang tindi ng mga depekto: ang linyang may mas mataas na ekspresyon ng progerin ay nagpakita ng mas malalang mga depekto sa lahat ng sinuri.

Ano ang hitsura ng mitochondria

Ang mitochondria ng malulusog na fibroblast ay bumubuo ng isang nagsasangang network sa paligid ng nukleus, na binubuo ng mahahabang tubulong gumagalaw sa mga landas ng cytoskeleton. Sa mga linyang may progeria, nawala ang network na iyon. Mas malaking bahagi ng mitochondria ang pira-piraso, marami ang namamaga, at ipinakita ng electron microscopy na humigit-kumulang dumoble ang bilang ng mga organelong malubha ang pinsala. Ipinakita ng time-lapse imaging na mas maikli ang distansiyang nilalakbay ng mga ito at mas mabagal ang paggalaw kaysa sa mga pangkontrol.

Sumunod ang paggana sa anyo. Tumaas ang superoxide sa mitochondria at ang antas ng mga oxidant sa buong selula. Mas maraming selula ang nagpakita ng pagkagambala sa potensiyal ng lamad. Bumaba ang produksiyon ng ATP. Kung titingnan nang hiwalay, hindi nakakagulat ang alinman dito, dahil naglalabas ng reactive oxygen species ang napinsalang mitochondria at gumagawa ng mas kaunting enerhiya. Ang bago ay ang iminungkahing sanhi. Ang PGC-1alpha, ang transcriptional coactivator na nagtutulak sa pagbuo ng mitochondria sa pamamagitan ng mga salik na kasunod nito gaya ng NRF1, TFAM, at ng mga regulator ng pagsasanib at paghahati na MFN1, MFN2, OPA1, FIS1, at DRP1, ay nabawasan nang humigit-kumulang walong ulit sa antas ng mRNA sa mga selulang may progeria, kasabay ng katumbas na pagkawala ng protina. Tila pinipigil ng progerin ang pangunahing switch para sa pagbuo at pagpapanatili ng mitochondria. Ang ugnayang iyon sa pagitan ng pinsala sa nuclear lamina at metabolismo ng enerhiya ay bahagi ng mas malawak na paliwanag tungkol sa produksiyon ng enerhiya sa mitochondria, at ang panig ng mga oxidant sa parehong balanseng iyon ay tinatalakay sa oxidative stress at pagkontrol sa ROS.

Ano ang binago ng methylene blue

Patuloy na inilantad ng mga mananaliksik ang mga selula sa 100 nanomolar na methylene blue, isang mababang konsentrasyon, sa loob ng ilang linggo. Sa konteksto ng kultura ng selula, isa itong matagal at banayad na pagkakalantad, hindi isang maikling bugso ng gamot. Nagpapalipat-lipat ang methylene blue sa mga anyong oxidized at reduced at maaari itong magdala ng mga electron sa loob ng mitochondria. Kaya inilalarawan ito bilang isang redox compound na nakatuon sa mitochondria, sa halip na isang karaniwang antioxidant na nauubos kapag nine-neutralize nito ang isang oxidant.

Tumugon ang mitochondria sa parehong normal na selula at mga selulang may progeria. Tumaas ang ATP, bumaba ang antas ng mga oxidant, at lumiit ang bahagi ng mitochondria na may malulubhang depekto. Bahagyang naibalik ang ekspresyon ng PGC-1alpha, kasama ang ilan sa mga target na kasunod nito. Hanggang dito, pangkalahatang epekto ito ng pagsuporta sa mitochondria, hindi partikular sa progeria.

Ang mga resulta sa nukleus ang nakakagulat, at partikular ang mga ito sa mga selulang may sakit. Nabawasan ang pag-umbok ng nukleus ayon sa kuwantitatibong pagsusuri ng hugis. Tumaas ang kabuuang dami ng lamins A at C. Ang pinakakapansin-pansin, nagbago ang distribusyon ng progerin: sa mga selulang may progeria na hindi nilapatan ng methylene blue, mga 30 percent lamang ng progerin ang nasa natutunaw na bahagi ng nucleoplasm, habang nakaangkla sa lamad ang natitira. Pagkatapos ng paglalapat, tumaas ang natutunaw na bahagi sa humigit-kumulang 65 percent, malapit sa normal na kilos ng lamin. Kapag nakalaya mula sa lamad, mas kaunti sa mga katabi nito ang nahihila ng progerin, at naibalik din ang mga natutunaw na bahagi ng lamins A at C.

Kasunod ng pagkalayang iyon, bumuti ang dalawang phenotype ng nukleus. Kitang-kitang naibalik ang heterochromatin sa paligid ng nukleus, na sinuri gamit ang electron microscopy at paglamlam para sa heterochromatin protein HP1-alpha. At ipinakita ng RNA sequencing na bumabalik tungo sa normal ang transcriptome: ang mga selulang may progeria na hindi nilapatan ay naiiba sa mga pangkontrol sa mahigit 3,200 gene, samantalang ang mga nilapatang selulang may progeria ay naiiba sa humigit-kumulang 1,670. Sa mga normal na selula, ilang dosenang gene lamang ang binago ng parehong paglalapat. Sinusuportahan nito ang paliwanag na ang epekto sa nukleus ay kaugnay ng progerin, sa halip na isang pangkalahatang biglang pagbabago sa transkripsiyon. Ang prinsipyong mas makikitid na tanong ang nasasagot ng mga paghahandang gumagamit ng selula at hayop kaysa sa ipinahihiwatig ng kanilang mga pamagat ay ipinaliliwanag sa kung paano basahin ang pananaliksik tungkol sa methylene blue.

Bakit hindi ito isang paggamot

Apat na limitasyon ang nagpapanatili sa pag-aaral na ito sa nararapat nitong lugar: sa loob ng laboratoryo.

Una, nangyari ang lahat sa mga sisidlan ng kultura. Ang mga fibroblast na pinalaki sa kultura ay walang suplay ng dugo, konteksto ng immune system, arkitektura ng tisyu, at pharmacology ng buong katawan na nagtatakda kung makararating nga ang isang compound sa target nito. Walang hayop na binigyan ng dosis at walang pasyenteng ginamot sa pag-aaral na ito.

Ikalawa, modelo lamang ng isang uri ng selula ang mga fibroblast na may progeria. Pangunahing nagdudulot ng kamatayan ang sakit sa pamamagitan ng mga epekto nito sa mga arterya, buto, at taba, at fibroblasts kasama ng isang paghahanda ng makinis na kalamnan lamang ang sinuri ng pag-aaral. Maaaring iba ang tugon ng ibang mga tisyu.

Ikatlo, ang pagpapanumbalik ng nukleus ay nagmula sa ilang linggo ng tuloy-tuloy na pagkakalantad sa nanomolar na konsentrasyon sa culture medium. Ang mga konsentrasyon sa sisidlan ay hindi mga dosis, at walang anuman sa papel na nag-uugnay sa 100 nanomolar sa medium sa isang regimen para sa tao. May sariling ugnayan ng dosis at tugon at sariling profile ng kaligtasan ang methylene blue sa ibang gamit nito sa medisina, at walang ibinibigay na batayan ang pag-aaral na ito para sa paggamit sa bahay. Ang pangkalahatang konteksto ng kaligtasan ay nasa kaligtasan at mga side effect ng methylene blue.

Ikaapat, hindi normal na pagtanda ang progeria. Isa itong bihirang sakit na dulot ng iisang mutasyon, kung saan nasisira sa isang partikular na paraan ang balangkas ng nukleus. Kaunti lamang ang masasabi tungkol sa pagtanda ng mga taong walang mutasyong iyon mula sa isang compound na nagpapagaan sa partikular na pinsalang iyon sa mga selulang pinalaki sa laboratoryo. Nagbibigay ang phenotype ng selula ng pagtanaw sa ugnayan ng nukleus at mitochondria, hindi ito resulta tungkol sa pagpapahaba ng buhay.

Kaya may mga kondisyon ang isang patas na buod. Sa mga fibroblast na may progeria, pinipigil ng progerin ang PGC-1alpha at iniiwang pira-piraso, mabagal, sagana sa oxidant, at kapos sa enerhiya ang mitochondria. Naibalik ng methylene blue na nasa mababang konsentrasyon ang mga sukat ng paggana ng mitochondria sa lahat ng selula. Bukod dito, pinakawalan nito ang progerin mula sa lamad ng nukleus sa mga selulang may sakit, kasabay ng bahagyang pagpapanumbalik ng hugis ng nukleus, heterochromatin, at ekspresyon ng gene. Dahil sa dobleng epektong iyon, mahalagang malaman ang pag-aaral. Hindi nito ginagawang terapiya ang methylene blue para sa progeria o para sa pagtanda.