Methylene blue at pagsesenyas ng pamamaga: mga inflammasome, IL-6, at STAT3

Ipagpalagay na iniulat ng tatlong laboratoryo na ang iisang asul na tambalan ay laban sa pamamaga. Ipinakita ng isa na mas kaunti ang IL-1beta mula sa mga macrophage. Ipinakita ng isa na mas kaunti ang enzyme na iNOS sa parehong uri ng selula. Ipinakita ng isa na mas kaunti ang IL-6 sa dugo at mas mababa ang aktibidad ng STAT3 sa utak. Nakatutuksong pagsamahin ang tatlo sa iisang pahayag. Ngunit natatakpan ng pagsasamang iyon ang natuklasan.

Bawat resulta ay kaugnay ng magkakaibang konsepto ng pagsesenyas na may sariling nag-uudyok, hakbang ng pagbuo, at sinusukat na kinalabasan. Nakikialam ang methylene blue sa magkakaibang punto ng bawat konsepto. Hiwalay na tanong kung may alinman dito na nagpapabuti ng kinalabasan sa kalusugan; tinatalakay iyon sa aming pangkalahatang pagsusuri sa methylene blue at pamamaga. Nakatuon ang pahinang ito sa mga landas ng pagsesenyas.

Landas 1: pagbuo ng inflammasome at caspase-1

Ang inflammasome ay isang balangkas ng protina na binubuo kapag kailangan sa loob ng isang myeloid na selula. Ang mga bahagi nito ay isang sensor, isang adaptor na tinatawag na ASC, at isang enzyme na tagapagpatupad na tinatawag na caspase-1. Kapag nabuo na, hinahati ng caspase-1 ang pro-IL-1beta at pro-IL-18 upang maging mga anyong inilalabas ng selula, at maaari nitong simulan ang pyroptosis, isang uri ng pagkamatay ng selula na nagdudulot ng pamamaga. Ang sensor ang nagtatakda ng uri: tumutugon ang NLRP3 sa mga kristal at mga lasong bumubuo ng butas gaya ng nigericin at ATP, tumutugon ang NLRC4 sa flagellin ng bakterya, tumutugon ang AIM2 sa DNA na may dalawang hibla sa cytosol, at tumutugon ang di-kanonikal na landas sa lipopolysaccharide sa loob ng selula.

Kailangan ng dalawang senyal para sa pag-aktibo. Ang unang senyal ay paghahanda: pinasisigla ng isang ligand ng Toll-like receptor ang transkripsiyon ng NLRP3 at pro-IL-1beta na nakadepende sa NF-kB upang magkaroon ng mga bahagi. Ang ikalawang senyal ay pagbuo: isang pangalawang pampasigla ang nagiging sanhi ng pagsasama-sama ng ASC bilang mga oligomer na bumubuo ng maliliit na kumpol, pagkaputol ng caspase-1 upang maging p20 na fragment nito, at paglabas ng hinog na IL-1beta p17. Kilalang nag-aambag sa ikalawang senyal para sa NLRP3 ang mga reaktibong uri ng oksiheno mula sa mitochondria at pagpasok ng mga kristal sa selula.

Sinubok ng pag-aaral noong 2017 sa malawak na pagpigil sa inflammasome sa mga macrophage ang methylene blue sa parehong senyal. Sa mga macrophage mula sa utak ng buto ng daga na inihanda gamit ang lipopolysaccharide, bawat isa sa nigericin, ATP, at mga kristal ng monosodium urate ay nagpasimula ng paglabas ng IL-1beta at caspase-1 pati ng pagbuo ng mga kumpol ng ASC. Binawasan ng methylene blue sa 20 hanggang 200 micromolar ang lahat ng tatlo sa paraang nakadepende sa dosis, nang hindi pinapatay ang mga selula. Nagpakita ng parehong padron ang flagellin at Salmonella para sa NLRC4, DNA na may dalawang hibla at Listeria para sa AIM2, at lipopolysaccharide na ipinasok sa pamamagitan ng transfection o buhay na E. coli para sa di-kanonikal na landas. Hindi nagpasimula ng paglabas ang tambalan lamang, at walang ipinakitang epekto laban sa bakterya ang mga control plate, kaya ang resulta ay nauugnay sa tugon ng organismong pinag-aralan.

Sa mga naunang hakbang ng landas, sinukat ang tatlong epekto ng interbensiyon. Bumaba sa paggamit ng methylene blue ang superoxide sa mitochondria na pinasimula ng rotenone, at kasabay nitong bumaba ang paglabas ng IL-1beta na dulot ng rotenone. Bumaba ang pagpasok sa selula ng mga butil na fluorescent, na kaayon ng nabawasang phagocytosis bago madama ang mga kristal. Ang isang reporter na pinatatakbo ng promoter ng NLRP3 na may dalawang puwesto para sa NF-kB ay nagpakita ng mas mababang aktibidad sa paggamit ng methylene blue, samantalang hindi tumugon ang isang pinaikling promoter na walang mga puwestong iyon. Sa isang tubo na walang mga selula, direkta ring pinababa ng methylene blue ang aktibidad ng recombinant na caspase-1 ng tao. Ang pagdaragdag ng tambalan sa paghahanda lamang o sa pag-aktibo lamang ay nagpababa pa rin ng paglabas ng IL-1beta, IL-18, at caspase-1, kaya parehong hakbang ang sangkot.

Tumugma ang mga pagsusuri sa daga sa pagiging piling ito ng epekto. Isang nakamamatay na dosis ng lipopolysaccharide ang pumatay sa mga dagang nasa control group sa loob ng ilang oras, samantalang pinabuti ng methylene blue ang kanilang kaligtasan sa pagkamatay; bumaba ang IL-1beta sa peritoneum ngunit hindi ang IL-6 sa parehong likido. Sa isang modelo ng peritonitis na dulot ng Listeria, bumaba ang IL-1beta sa peritoneum habang hindi nagbago ang kabuuang bilang ng mga selula. Kumilos ang mga THP-1 monocyte ng tao tulad ng mga macrophage ng daga sa lahat ng apat na uri ng inflammasome. Ipinapaliwanag ng resulta tungkol sa inflammasome ang paghinog ng IL-1beta at IL-18, hindi ang bawat cytokine. Ito rin ang dahilan kung bakit ang hugis ng mga selulang pang-imyunidad sa utak sa mga eksperimento sa microglia at astrocyte ay sumasagot sa ibang tanong kaysa sa pagbuo ng balangkas.

Landas 2: transkripsiyon ng iNOS sa pamamagitan ng pagbibigkis ng NF-kB at STAT1

Ang inducible nitric oxide synthase, o iNOS, ay halos wala kapag walang pampasigla at ginagawa sa pamamagitan ng transkripsiyon kapag kailangan. Pangunahing pinasisigla ito ng lipopolysaccharide sa pamamagitan ng pagkasira ng IkB-alpha, na sinusundan ng posporilasyon ng NF-kB at pagpasok nito sa nukleo. Pangunahing pinasisigla ito ng interferon-gamma sa pamamagitan ng posporilasyon ng STAT1 ng Janus kinase, na sinusundan ng pagpasok ng STAT1 sa nukleo. Pagkatapos, bumibigkis ang bawat salik sa puwesto nito sa promoter ng iNOS. Magkahiwalay na punto ng pagkontrol ang aktibidad ng enzyme at pagpapasimula ng ekspresyon ng gene, at maaaring kumilos ang isang gamot sa alinman o sa pareho.

Itinukoy ng pag-aaral noong 2015 sa pagpapasimula ng iNOS sa mga macrophage at mga dagang may endotoxemia ang epekto sa antas ng mensaheng RNA. Sa mga selulang RAW 264.7 at mga pangunahing macrophage ng daga, ang 1 micromolar na methylene blue na ibinigay 30 minuto bago ang lipopolysaccharide, interferon-gamma, o pareho ay nagpababa ng protina at mRNA ng iNOS sa loob ng 8 hanggang 24 oras, kasabay ng mas mababang nitrite sa medium at walang pagbaba sa kakayahang mabuhay ng mga selula. Sa mga dagang binigyan ng 25 mg per kg na lipopolysaccharide, ang iisang dosis na 5 mg per kg isang oras bago nito ay nagpababa ng protina at mRNA ng iNOS sa baga, atay, at puso.

Ang kapansin-pansing detalye ay kung ano ang hindi nagbago. Nanatiling hindi naapektuhan ang pagkasira ng IkB-alpha, posporilasyon ng NF-kB, posporilasyon ng STAT1, at pag-ipon ng alinmang salik sa nukleo. Nangyari ang pagkagambala sa sumunod na hakbang: ipinakita ng mga katas mula sa nukleo ang mas kaunting pagbibigkis ng NF-kB sa kaukulang elemento ng DNA pagkatapos ng lipopolysaccharide at mas kaunting pagbibigkis ng STAT1 pagkatapos ng interferon-gamma. Kinumpirma ng chromatin immunoprecipitation na mas kaunti ang nakakabit na alinman sa dalawang salik sa promoter ng iNOS sa loob ng mga selula. Bumaba rin ang tumor necrosis factor alpha, na gumagamit din ng NF-kB sa promoter nito. Naaktibo ang mga salik at nakarating sa nukleo, ngunit mahina ang kanilang pagbibigkis sa target na DNA.

Pansinin ang pagkakaiba nito sa landas 1. Tungkol ito sa pagbibigkis ng salik sa DNA, gumagamit ng STAT1 sa halip na STAT3, at sumusukat ng mRNA, protina, at nitrite sa halip na mga kumpol ng ASC at mga fragment ng caspase-1. Pinananatiling hiwalay ng aming mapa ng mga target ng methylene blue sa iba't ibang modelo ng selula ang antas na ito ng transkripsiyon mula sa mga direktang pagsukat ng enzyme at mitochondria.

Landas 3: IL-6 sa serum at pag-aktibo ng STAT3 sa tisyu

Nagpapadala ng senyal ang IL-6 sa pamamagitan ng pamilya ng receptor na gp130 patungo sa sunod-sunod na pagsesenyas mula Janus kinase patungong STAT3. Nagpapares ang STAT3 na sumailalim sa posporilasyon, pumapasok sa nukleo, at nagpapagana ng mga programang kaugnay ng pamamaga. Samantala, ang IL-6 mismo ay target ng NF-kB, kaya bumubuo ang dalawa ng isang siklo ng balik-tugon na madalas tawaging axis mula IL-6 patungong STAT3. Ang mga karaniwang sinusukat ay ang IL-6 sa serum sa naunang bahagi ng landas, ang proporsiyon ng STAT3 na sumailalim sa posporilasyon sa kabuuang STAT3, at ang mga enzyme na tagapagpatupad gaya ng iNOS at COX2 sa mga kasunod na bahagi.

Sinukat ng pag-aaral noong 2023 sa IL-6 at STAT3 sa mga daga pagkatapos ng lipopolysaccharide ang axis sa iba't ibang bahagi ng katawan. Tumanggap ang mga lalaking dagang C57BL/6 ng 1 mg per kg na lipopolysaccharide araw-araw sa loob ng tatlong araw, kasabay ng 5 o 10 mg per kg na methylene blue 30 minuto pagkatapos ng bawat dosis. Sa ikatlong araw, mas mababa ang IL-6 sa serum sa parehong pangkat na tumanggap ng methylene blue kaysa sa pangkat na tumanggap ng lipopolysaccharide lamang, habang hindi nagbago sa paggamot ang karamihan sa iba pang cytokine sa pangkat ng mga sinusukat. Mas mababa ang mga proporsiyon ng STAT3 na sumailalim sa posporilasyon sa kabuuang STAT3 sa cortex, hippocampus, at balat ng tainga, kasabay ng mas mababang paglamlam ng Iba-1 sa microglia, mas mababang iNOS at COX2, at bahagyang pagbawas sa pagbaba ng timbang.

May dalawang pag-iingat na dapat banggitin dito. Ang mas mababang IL-6 sa serum kasabay ng mas mababang posporilasyon ng STAT3 sa tisyu ay kaayon ng pagbabago sa axis, ngunit hindi nito natutukoy ang pangunahing puntong naaapektuhan. Maaaring magbunga ng parehong proporsiyon ang mas kaunting cytokine sa naunang bahagi, mas mahinang pagsesenyas ng receptor, o nabagong aktibidad ng phosphatase. At ang timbang sa loob ng tatlong araw ng matinding pagpapasigla ay isang sukatan ng buong hayop, hindi marka ng sintomas o remisyon. Nagdaragdag ito ng konteksto lampas sa resulta ng blot nang hindi ginagawang pahayag tungkol sa paggamot ang resulta ng pagsesenyas. Kaagapay ng salaysay na ito tungkol sa cytokine ang hiwalay na kimika ng pagproseso ng redox sa mitochondria, at hindi dapat pagsamahin ang mga ito.

Paghahambing ng mga landas: mga punto ng interbensiyon at mga sinusukat na kinalabasan

Hinahadlangan ng talahanayan ang tatlong hindi wastong paglalapat ng mga resulta. Hindi pinatutunayan ng resulta tungkol sa mga kumpol ng ASC ang isang resulta tungkol sa STAT3. Hindi pinatutunayan ng resulta tungkol sa STAT1 at promoter ng iNOS ang isang resulta tungkol sa STAT3, kahit na parehong kabilang sa pamilya ng STAT ang dalawang protina. Hindi pinatutunayan ng resulta tungkol sa IL-6 sa serum ang nabawasang pagbuo ng inflammasome: sa eksperimento sa peritoneum, bumaba ang IL-1beta ngunit hindi ang IL-6. Kailangan ng bawat hanay ang sarili nitong pampasigla at sinusukat na kinalabasan. Ito ang dahilan kung bakit, sa pagbasa ng mga pag-aaral sa methylene blue sa mga selula, hayop, at klinikal na kalagayan, kailangang itugma ang bawat pahayag sa antas na aktuwal na sinukat.

Wala sa mga ito ang nagtatatag ng dosis, kaligtasan, o pakinabang sa mga tao. Ang mga modelo ng lipopolysaccharide ay mga kontroladong pampasigla para subukin ang isang mekanismo, hindi mga replika ng talamak na karamdaman. Sinusubok ng pagbibigay ng dosis kasabay ng pampasigla ang pag-iwas sa isang pagbabagong sadyang pinasimula, sa halip na ang pagbabalik sa dati mula sa umiiral nang sakit. Panatilihing hiwalay ang paliwanag na ito ng mekanismo mula sa mga kinalabasan sa pasyente, at suriin ang anumang pahayag tungkol sa kalusugan batay sa pag-aaral sa mga pasyenteng sumusuporta rito.