Pagbuo ng kurba ng kalibrasyon ng methylene blue: mga blank, saklaw, at linearidad

Dalawang analista ang gumagamit ng iisang bote ng stock solution ng methylene blue at bawat isa ay bumubuo ng kurba ng kalibrasyon. Ang una ay nakakakuha ng tuwid na linyang dumaraan sa origin at may kumpiyansang sinusukat ang mga sampol na hindi pa alam ang konsentrasyon. Ang ikalawa ay nakakakuha ng linyang kumukurba sa mataas na dulo, isang intercept na hindi lumalapit sa zero, at mga resulta ng sampol na nagbabago habang dinidilute. Pareho ang tina, instrumento, at haba ng alon. Hindi kasanayan ang pinagkaiba. Nasa disenyo ito: ano ang laman ng blank, aling mga konsentrasyon ang pinili, at kung nanatili ang sinuring saklaw sa rehiyong naaangkop pa ang isang simpleng modelo.

Ang kurba ng kalibrasyon ay isang kasunduan sa pagitan ng tugon ng instrumento at ng konsentrasyon, na balido lamang sa mga kondisyong ginamit sa pagbuo nito. Para sa methylene blue, may kilalang kahinaan ang kasunduang iyon. Nag-uugnayan ang mga molekula ng tina sa tubig, kaya nagbabago ang uri ng molekulang sumisipsip ng liwanag ayon sa konsentrasyon. Hindi magiging tuwid ang kurbang binuo sa saklaw na sumasaklaw sa pagbabagong iyon, at hindi ito maaayos ng anumang dami ng pagsusuring estadistikal. Ipinapakita ng artikulong ito kung paano idisenyo ang kurba upang may kabuluhan ang linya: piliin ang tamang blank, panatilihin ang saklaw sa rehiyong pinangingibabawan ng monomer, gumawa ng mga tunay na replikat, at ituring ang pagkurba bilang impormasyon sa halip na ingay.

Magsimula sa blank, hindi sa mga pamantayan

Ang blank ang nagtatakda ng zero, at para sa methylene blue, dapat nitong taglayin ang lahat maliban sa tina. Parehong grado ng tubig, parehong buffer at pH, parehong mga asin, parehong proporsyon ng cosolvent, parehong temperatura. Ihanda ang mga pamantayan sa kalibrasyon sa eksaktong parehong matrix. Kemikal ang dahilan, hindi burukratiko. Binabago ng asin at solvent ang balanse sa pagitan ng monomer, dimer, at mas malalaking aggregate, na nagpapabago sa spectrum sa haba ng along ginagamit sa pagsukat. Hindi maitatama ng blank na tubig lamang ang pagbabagong dulot ng matrix sa distribusyon ng mga kemikal na anyo. Sa pangkalahatang pagsusuri ng mga spectrum ng methylene blue sa tubig, na mababasa sa rekord nitong may bukas na akses, pinag-iba ang sodium chloride mula 0 hanggang 0.15 M dahil mismo sa inililipat ng ionic strength ang ekwilibriyo, at tumindi ang agregasyon habang nadaragdagan ang asin.

Isang praktikal na implikasyon: huwag kailanman magkalibrate sa deionized na tubig at pagkatapos ay magsukat ng mga sampol sa phosphate buffer o sinalang tubig-basura. Kapag walang matrix na walang analyte, mas mabuti ang pagdaragdag ng pamantayan sa mismong sampol kaysa sa panlabas na kurbang hindi katugma ng matrix. Nasa talakayan tungkol sa matrix at mga interferensiya ang kaugnay na gabay upang mapanatiling maaasahan ang mga pagsusuri sa tubig, at tinatalakay sa pangkalahatang gabay sa disenyo ng pagsusuri ang mga pangunahing prinsipyo ng kuwantitatibong pagsusuri ng tina.

Pumili ng saklaw kung saan nangingibabaw ang isang anyo

Ipinapalagay ng kuwantipikasyon sa banda ng mahabang alon na malapit sa 664 nm na monomer ang karamihan ng tina. Sa purong tubig, naaangkop lamang ang palagay na iyon habang nananatiling malabnaw ang mga solusyon, humigit-kumulang sa mababang saklaw na micromolar. Ipinapakita ng mga nailathalang empirikal na slope ang hangganan: ang mga kalibrasyong pinananatili sa ibaba ng humigit-kumulang 7 micromolar sa mga cell na 1 cm ay nagbibigay ng slope na malapit sa 82,000 M-1 cm-1, samantalang ang kalibrasyong pinalawak hanggang humigit-kumulang 37 micromolar ay bumababa sa humigit-kumulang 67,100 dahil may kapansin-pansing dami na ng dimer ang mga pamantayang may mas mataas na konsentrasyon. Bawat koepisyenteng binanggit dito ay may nakasaad na mga kondisyon sa sanggunian sa spectrum ng methylene blue, na siyang tamang lugar upang paghambingin ang mga bilang; ginagamit lamang ang mga ito sa artikulong ito upang itakda ang saklaw.

Tuwirang nagmumula rito ang mga tuntunin sa disenyo:

1. Panatilihing sapat na malabnaw ang pinakamataas na pamantayan upang hindi magbago ang hugis ng spectrum. Habang binubuo ang pamamaraan, i-scan ang buong nakikitang saklaw (humigit-kumulang 550 hanggang 750 nm) para sa bawat antas sa halip na magbasa sa iisang haba ng alon. Kung nagbabago ang hugis ng mga normalized na spectrum ayon sa konsentrasyon, nagbabago ang kimika at masyadong malawak ang saklaw.
2. Subaybayan ang ratio ng absorbance malapit sa 610 nm sa absorbance malapit sa 665 nm sa lahat ng antas. Ang ratio na tumataas kasabay ng konsentrasyon ay nangangahulugang lumalaki ang balikat ng spectrum na dulot ng dimer at hindi na naaangkop ang modelo ng monomer. Mas detalyadong ipinapaliwanag ang palatandaang ito sa gabay sa mga epekto ng agregasyon at konsentrasyon.
3. Gumamit ng cell na 1 cm para sa mga pagsusuri sa mababang konsentrasyong micromolar. Sa slope na malapit sa 82,000, ang 5 micromolar ay nagbibigay ng absorbance na malapit sa 0.41 at ang 10 micromolar ay nagbibigay ng humigit-kumulang 0.82, na parehong angkop para sa karamihan ng mga instrumento.
4. Para sa mga stock solution na mataas ang konsentrasyon, paikliin ang landas ng liwanag sa halip na tanggapin ang absorbance na higit na mataas sa 1, ngunit tandaan na ang maikling landas ay nag-aayos ng photometry, hindi ng kimika. Nakasalalay ang agregasyon sa konsentrasyon, hindi sa haba ng landas, kaya nangangailangan pa rin ang stock solution na mataas ang konsentrasyon ng sariling pamamaraang isinasaalang-alang ang distribusyon ng mga kemikal na anyo sa halip na gumamit ng kurba para sa malabnaw na monomer.

Ang pangkalahatang pag-aangkop ng modelo na pinagbabatayan ng malaking bahagi ng paliwanag na ito ay sumaklaw sa 224 spectrum mula 1.1 micromolar hanggang 3.4 millimolar at nakakita ng signal ng tetramer kahit sa ibaba ng 34 micromolar. Itinatakda ng natuklasang iyon ang nararapat na pag-iingat: mas makitid ang linear na saklaw kaysa sa ipinahihiwatig ng intuwisyon, kaya tiyakin ito sa halip na ipagpalagay lamang.

Mga antas, replikat, at pagkakasunod-sunod

Walang napapatunayan ang kurbang may tatlong punto. Hinihingi ng gabay sa balidasyon sa ICH Q2(R2) ang hindi bababa sa limang konsentrasyon upang suriin ang linearidad, at nagbibigay ang anim hanggang walong antas na hindi zero ng mas kapani-paniwalang kurba para sa aktuwal na paggamit, lalo na malapit sa pinakamataas na antas kung saan nagsisimula ang agregasyon. Ipamahagi ang mga antas upang masaklaw ang nilalayong saklaw ng mga sampol, na may mas maraming antas sa bahaging pinakamalamang kumurba, sa halip na gumamit ng seryeng heometriko na pinili dahil madali itong ihanda.

Sukatin ang bawat antas nang may dalawa o tatlong replikat, na magkakahiwalay na inihanda sa halip na basahin nang tatlong beses mula sa iisang prasko. Nailalantad ng mga independiyenteng replikat ang pagkakamali sa paghahanda; ang paulit-ulit na pagbasa sa iisang prasko ay naglalantad lamang ng ingay ng instrumento. Sinukat ng pangkalahatang pag-aaral noong 2020 ang bawat solusyon nang tatlong beses, na nananatiling isang mahusay na karaniwang pamamaraan. Gawing random ang pagkakasunod-sunod ng pagbasa upang hindi mapagkamalang pagkurba ang unti-unting paglihis, adsorption sa salamin, o pagbabago ng temperatura. Natuklasan sa isang pag-aaral sa quartz cuvette na humigit-kumulang 3 porsiyento ng tina mula sa isang solusyong 34 micromolar ang dumidikit sa ibabaw sa loob ng 10 minuto, kaya panatilihing pare-pareho ang oras ng pagkakadikit, cuvette, paglilinis, at pagkakasunod-sunod sa buong serye ng pagsukat.

Halimbawang may ipinakitang pagkalkula (hindi nasukat na datos)

Gawa-gawa ang mga bilang sa ibaba upang ipakita ang pagkalkula. Hindi ito mga pagsukat sa laboratoryo at hindi dapat banggitin bilang datos ng methylene blue. Ang mahalaga ay ang paraan ng mga pagsusuring inilalapat sa mga ito.

Ipagpalagay na may anim na pamantayan sa katugmang buffer, may landas na 1 cm, at binabasa sa 665 nm laban sa katugmang blank:

Ang pag-aangkop ng isang tuwid na linya sa karaniwang absorbance laban sa konsentrasyon ay nagbibigay ng slope na malapit sa 0.0805 yunit ng absorbance bawat micromolar at intercept na ilang yunit lamang ng milliabsorbance ang layo sa zero. Ang paghahati ng slope sa haba ng landas ay nagko-convert dito sa isang apparent absorptivity: ang 0.0805 bawat micromolar ay katumbas ng humigit-kumulang 80,500 M-1 cm-1, na kaayon ng isang agwat na pinangingibabawan ng monomer sa tubig. Hindi ang R squared ang mahalagang suriin, sapagkat magiging napakaganda nito sa alinmang kaso. Ang mahalaga ay ang intercept na malapit sa zero, ang hindi nagbabagong ratio na A610/A665 mula S2 hanggang S5, at ang mga residual na nakakalat nang walang trend. Ang pagtaas ng ratio sa S6 ang malinaw na palatandaang dapat alisin ang antas na iyon o markahan ang 7 micromolar bilang pansamantalang pinakamataas na antas para sa kombinasyong ito ng matrix at instrumento.

Ang sampol na hindi pa alam ang konsentrasyon at may pagbasa na 0.245 sa eksaktong parehong mga kondisyon ay tuwirang mako-convert: ang 0.245 na hinati sa 0.0805 bawat micromolar ay nagbibigay ng humigit-kumulang 3.0 micromolar, bago ilapat ang anumang dilution factor ng sampol. Iulat ang resulta kasama ang mga kondisyon nito: haba ng alon, landas, matrix ng blank, agwat ng kalibrasyon, at petsa.

Talaang maaaring punan para sa kalibrasyon

Kopyahin ang template na ito sa rekord ng laboratoryo para sa bawat bagong matrix. Isang matrix, isang talaan, isang kurba.

Mahalagang isama ang hanay para sa anyo ng reagent. Ang komersiyal na methylene blue ay maaaring anhydrous na asin o hydrate gaya ng trihydrate, at ang maling molar mass ay nagdudulot ng hindi agad napapansing sistematikong paglihis sa bawat nominal na konsentrasyon. Tinatalakay sa gabay sa kalidad at grado ang mga pagsusuri sa kadalisayan at espesipikasyon ng panimulang materyal.

Tiyakin gamit ang isang independiyenteng pamantayang pansuri

Hindi dapat ang kurba ng kalibrasyon mismo ang maging batayan ng pagpapatunay sa sarili nito. Pagkatapos iangkop ang linya, maghanda ng isang pamantayang pansuri mula sa stock solution na hiwalay na tinimbang, sa konsentrasyong malapit sa gitna ng tinanggap na agwat, at basahin ito na parang sampol na hindi pa alam ang konsentrasyon. Ang pagkakatugmang may pagkakaibang ilang porsiyento lamang ay nagpapatunay sa mga hakbang ng paghahanda; ang hindi pagtugma ay nagpapahiwatig ng problema sa stock solution o mga dilution sa halip na sa instrumento. Ulitin ang pamantayang pansuri sa bawat pangkat ng mga sampol. Kung unti-unting lumilihis ito habang hindi nagbabago ang kurba, paghinalaan muna ang mga solusyong ginagamit sa pagsusuri o ang cuvette bago ang mga sampol. Nahuhuli ng iisang gawaing ito ang karamihan ng mga hindi agad napapansing pagkakamali: molar mass ng hydrate na inilapat sa boteng anhydrous ang laman, micropipette na wala sa tamang kalibrasyon, o buffer na inihanda sa maling ionic strength. Itala ang porsiyentong recovery ng pamantayang pansuri sa talaan sa tabi ng slope, upang makita ng susunod na mambabasa na sinubok ang linya, hindi lamang iginuhit.

Pag-unawa sa di-linearidad bilang pagtukoy sa sanhi

Kapag kumukurba ang linya, ipinahihiwatig ng hugis ng paglihis ang sanhi. Ang pababang pagkurba sa mataas na absorbance habang hindi nagbabago ang hugis ng spectrum ay tumuturo sa instrumento, kadalasan ay ligaw na liwanag na nagpapababa sa mga pagbasa ng mataas na absorbance. Ang pagkurba na may kasabay na pagtaas ng balikat sa 610 nm ay tumuturo sa kimika: ang dimer at mas malalaking aggregate ay sumisipsip ng liwanag nang iba kaysa sa monomer. Ang blank na hindi nagiging zero, o mga pamantayang bumababa ang pagbasa sa paglipas ng oras, ay tumuturo sa lalagyan: adsorption sa salamin o mga cuvette, lalo na kung nag-iba ang mga oras ng pagkakadikit sa buong serye ng pagsukat. At ang isang maayos na linyang umaangkop sa mga punto ngunit nagbibigay pa rin ng maling resulta ng sampol ay tumuturo sa matrix: naiiba ang mga sampol sa mga pamantayan sa kalibrasyon, kaya muling buuin ang kurba sa matrix ng sampol o lumipat sa pagdaragdag ng pamantayan. Sa bawat kaso, i-plot ang mga residual laban sa konsentrasyon. Sinusuportahan ng random na pagkakakalat ang modelo ng tuwid na linya; mas maaasahang pinabubulaanan ito ng hugis-ngiti o hugis-simangot kaysa sa anumang hangganan ng R squared, isang puntong tahasang sinasang-ayunan ng gabay sa balidasyon.

Nagbibigay ng maaasahang resulta ang methylene blue kapag sinusunod ang disiplinang ito. Malakas ang banda ng monomer nito, mahusay na nailarawan ang kimika nito, at nagpapakita ang mga sanhi ng pagkabigo sa spectrum bago pa masira ang mga bilang. Buuin ang kurba sa makitid na saklaw, gumamit ng tunay na katugmang blank, gumawa ng magkakahiwalay na replikat, at hayaang ang hugis ng mga spectrum ang maging batayan ng saklaw. Maikli ang mabubuong linya, ngunit maaasahan ang bawat punto rito.

Gumagamit ang mga halimbawang pagkalkula sa artikulong ito ng mga gawa-gawang bilang upang ipakita ang pamamaraan. Ang mga nasukat na koepisyenteng sanggunian kasama ang kumpletong mga kondisyon ay nasa naka-link na sanggunian sa spectrum, at ang pinagbabatayang pag-aaral sa agregasyon ay nakaindeks sa PMID 33251415.