DNA we RNA boýamak üçin metilen gök: gellerde we membranalarda ulanylyşy

Bir talyp agaroza gelinde elektroforez geçirýär, ony metilen gök bilen boýaýar, ýöne aýdyň zolak garaşylýan ýerde hiç zat görmeýär. Gapdaldaky iş ýerinde doktorlykdan soňky gözlegçi şol bir gök boýagly çüýşeden peýdalanyp Northern membranasyny boýaýar we üç minutda anyk ribosomal zolaklary alýar. Talyp gel synagynyň şowsuz bolandygyny pikir edýär. Gel synagy şowsuz bolmady. Bu iki işiň maksady tapawutlydy we şol bir boýag olarda dürli duýgurlyk, dürli fon hem-de indiki amallar üçin dürli düzgünler bilen işleýär.

Metilen gök bilen DNA we RNA boýamak şol bir himiki esaslara daýanýar, ýöne maksatlary birmeňzeş däl. Gelde boýag öýjükli matrisanyň içinde näçe nuklein kislotasynyň bardygyny görkezýär. Membranada bolsa geçirilmegiň üstünlikli bolandygyny we ýodajyklara deň mukdarda nusga ýüklenendigini görkezýär. Bu tapawut aýdyň bolansoň, protokollara, ýüze çykaryş çäklerine we utgaşyklylyk çäklerine düşünmek aňsatlaşýar.

Gysga jogap

Metilen gök tekiz gurluşly kation boýag bolup, fosfata elektrostatik çekilmäniň, esas jübütleriniň arasyna girmegiň we kiçi joýajyk bilen baglanyşmagyň utgaşmasy arkaly nuklein kislotalaryna kowalent däl hem-de gaýdymly baglanýar. Hut şol gaýdymlylyk möhümdir. Zolaklary boýap, görünýän ýagtylykda synlap, suratyny alyp, soňra klonlamak, gibridleşdirmek ýa-da täzeden zondlamak üçin boýagyny aýryp ýa-da arassalap bolýar.

Iki zynjyrly DNA-ny agaroza gelinde metilen gök bilen boýamak üçin standart çalt usul suwda 0.02 göterim w/v (her mL üçin 200 mikrogram) ergini ulanmakdan, takmynan 15 minut boýamakdan we soňra takmynan 15 minut suw bilen boýagy aýyrmakdan ybaratdyr; gel ak ýagtylyk gutusynda synlanýar. Membranalar üçin nusgawy Northern blot usuly pH 5.2 töweregindäki natriý asetatda 0.02–0.04 göterim boýagy ulanýar: geçirilenden we berkidilenden soň birnäçe minut boýalýar, soňra suw bilen çaýkalýar we gibridleşdirmezden öň boýag doly aýrylýar. Duýgurlygy ýokary däl: gowy şertlerde her gel zolagy üçin onlarça ýa-da ýüzlerçe nanogram, seresaply gollanmalarda bolsa 0.5–1 mikrogram görkezilýär. Bu mukdarlar etidiý bromid we SYBR boýaglarynyň ýüze çykaryş çäklerinden birnäçe ululyk derejesi ýokarydyr. Membranalarda aýratyn transkript üçin peýdaly ýeke-täk ýüze çykaryş çägi ýok, sebäbi boýag esasan köp mukdardaky ribosomal RNA-ny we ýüklenen materialyň umumy mukdaryny görkezýär. Bu usullaryň hiç birinde bölek satuwda satylýan goşundynyň erginini ulanmaň. Barlanyp tassyklanan usullar analitiki arassalyk derejesindäki boýagy, düzümi kesgitlenen buferleri we RNA bilen işlenende RNase-den azat şertleri göz öňünde tutýar.

Baglanyşyk nähili işleýär we nirede ýalňyş düşünje döredýär

Peýdaly model üç bölekden ybaratdyr. Birinjiden, položitel zarýadly halka ulgamy otrisatel zarýadly fosfat esas zynjyryna çekilýär. Spektroskopik işler pes duz konsentrasiýasynda bu elektrostatik täsiriň agdyklyk edýändigini görkezýär; modellemek we molekulýar dinamika bolsa iki zynjyrly DNA üçin esas jübütleriniň arasyna girmegi we kiçi joýajyk bilen baglanyşmagy durnukly görnüşler hökmünde görkezýär. Bu metilen göküň DNA bilen baglanyşygyny öwrenýän spektroskopik barlagda jemlenýär. Ikinjiden, GC-ä belli bir meýillilik bar: modellemek CpG we GpC ädimlerine artykmaçlyk berýär, metilen göküň esas jübütleriniň arasyna girme meýillilikleri baradaky işdäki synaglar bolsa GC-e baý dupleksler bilen has köp baglanyşýandygyny görkezýär. Emma AT dupleksleri hem baglanyşýar. Adaty boýamak yzygiderlilige mahsus däldir. Üçünjiden, bir zynjyrly DNA we RNA esasan elektrostatik täsir arkaly hem-de elýeterli esaslar we dupleks sebitler bilen üstme-üst ýerleşmek arkaly baglanyşýar. Şonuň üçin boýagyň güýji uzynlyga, yzygiderlilige we ikinji derejeli gurluşa görä üýtgeýär.

Mundan iki netije çykýar. Baglanyşyk kowalent bolmansoň, boýag ýuwlup aýrylýar. Poliakrilamid zolaklary ýörite berkidilmese çalt solýar; adaty boýamak wagtlaýyn bolany üçin ýörite hemişelik berkitme usuly hem bar. Bu Soto we Draperiň PAGE gelleri baradaky işinde beýan edilýär. Boýag fotosensibilizator bolany sebäpli, boýalan DNA-ny kislorodyň barlygynda güýçli ýagtylykda uzak saklamak guanini okislendirip, soňunda zynjyrlarda kesilmeleri döredip biler. Bu mehanizm metilen göküň duýgurlaşdyrýan guanin okislenmesi baradaky işde jikme-jik beýan edilýär. Ak ýagtylykda gysga wagt synlamak etidiý bromid bilen işlemegiň nusgawy usullaryndaky belli UV zeperlenmesiniň öňüni alýar; bu preparatiw bölüp almak üçin hakyky artykmaçlykdyr. Görünýän ýagtylyk has ýumşak täsir edýär, ýöne zyýansyz däldir. DNA klonlanjak bolsa, ýagtylandyryş wagtyny gysga saklaň. Bu ätiýaçlygyň aňyrsyndaky has giň fotohimiýa barada metilen göküň fotohimiýasyndaky iki ýola serediň. Okislenen görnüşiň näme üçin baglanyşýandygyny, gaýtarylan görnüşiň bolsa baglanyşmaýandygyny düşündirýän redoks jübüti we zarýad ýagdaýlary barada metilen göküň gurluşynyň we häsiýetleriniň himiýasyna serediň.

Birinji wezipe: gelleriň içinde boýamak

Geli boýamak bir soraga jogap berýär: bu zolakda göz bilen görmek üçin ýeterlik nuklein kislotasy barmy? Agaroza gelindäki iki zynjyrly DNA iň gowy öwrenilen ýagdaýdyr. Floresiň we kärdeşleriniň metilen gök bilen geli boýamak boýunça ilkinji usuly 1 göterim agarozada 0.02 göterimlik çalt protokoly tassyklady we ondan soň DNA-ny üstünlikli bölüp almagyň hem-de klonlamagyň mümkindigini görkezdi. Şol üpjün edijiniň protokoly IBI Scientific-iň metilen gök önüm sahypasynda hem berilýär; ol ýerde 0.04 göterimlik membrana usuly bilen çalt gel usuly ýanaşyk görkezilýär.

Amaly iş tertibi:

1. Gelde elektroforezi adaty tertipde geçiriň. Üýtgedilen usul üçin geçirilme ýa-da bölüniş aýdyňlygy barlanyp tassyklanmadyk bolsa, boýamagy elektroforez wagtynda däl-de, ondan soň geçiriň.
2. Distillirlenen suwdaky 0.02 göterim w/v metilen gök erginine batyryň we ýuwaş çaýkap, takmynan 15 minut saklaň.
3. Matrisanyň fon reňki peselip, zolaklar aýdyň görünýänçä, suwy birnäçe gezek çalşyp, jemi takmynan 15 minut boýagy aýryň.
4. Ak ýagtylykly ýagtylandyryjyda dessine surata alyň.

Agaroza bilen poliakrilamidiň häsiýetleri tapawutlanýar. Agaroza matrisada boýagy saklaýar, şonuň üçin boýagy aýyrmak haýal tapgyrdyr. Ýuka poliakrilamid gelleri çalt boýalýar, ýöne boýagy hem çalt ýitirýär; bu preparatiw kesip almak üçin peýdaly, arhiw ýazgylary üçin bolsa amatsyzdyr. Poliakrilamiddäki sintetiki oligonukleotidleriň ýerleşýän ýerini şol bir 0.02 göterimlik usul we gaýtalanýan suw ýuwmalary bilen 20–30 minutda kesgitläp bolýar; munuň üçin Current Protocols görnüşindäki oturymly PAGE usullaryna eýerilýär. Preparatiw oligonukleotidler üçin gowşadylan TBE-de 0.0002 göterim töweregindäki örän gowşak erginleriň birnäçe sagadyň dowamynda ulanylýandygy barada habarlar bar, ýöne subutnama binýady has gowşakdyr.

DNA bilen RNA-nyň arasyndaky tapawut möhümdir. Iki zynjyrly DNA iň güýçli gurluşly baglanyşygy berýär. RNA we bir zynjyrly DNA hem boýalýar, ýöne has gowşak we öňünden çaklamak kynrak bolýar. Formaldegidli agaroza RNA gellerinde laboratoriýalaryň köpüsi geliň içinde gök boýag bilen boýamakdan ýüz öwrüp, ilki RNA-ny membrana geçirýär, soňra şol ýerde boýaýar. Bu ädim gowşak gel signalynyň ýerine has aýdyň membrana signalyny we ýükleniş ýazgysyny berýär.

Ikinji wezipe: membranalarda boýamak

Membranany boýamak başga soraga jogap berýär: geçirilme üstünlikli boldumy we ýodajyklary deňeşdirip bolýarmy? Nusgawy ulanylyş Herrin we Schmidtiň gaýdymly Northern blot boýagydyr. Onuň başlangyç görnüşi pH 5.0 bolan 50 mM natriý asetatda 0.04 göterim boýag bilen 2–3 minut boýamagy we suw bilen çaýkamagy öz içine alýardy; gibridleşdirmezden öň boýagy SSPE-de gowşadylan SDS bilen aýryp bolýardy.

Giňden ulanylýan häzirki görnüşiniň tertibi şeýle:

1. RNA-ny ýa-da denaturirlenen DNA-ny neýlona ýa-da nitrosellýuloza geçiriň, soňra boýamak wagtynda nusga ýitmez ýaly UV bilen baglanyşdyryp ýa-da gyzdyryp berkidiň.
2. Hökmany däl, ýöne giňden ulanylýan ädim: membranany 5 göterim sirke kislotasynda takmynan 15 minut ölläň.
3. pH 5.2 töweregindäki 0.3–0.5 M natriý asetatda 0.02–0.04 göterim metilen gök bilen 5–10 minut boýaň.
4. Suwda çaýkaň we 5–15 minut boýagy aýryň, netijäni resmileşdiriň, soňra gibridleşdirmezden öň galan boýagy aýryň.

Northern işlerinde esasan položitel zarýadly neýlon ulanylýar. Nitrosellýuloza hem şol bir sirke kislotasy we asetat iş tertibi bilen ulanylyp bilner. Surat geçirilmäni tassyklamak, 28S we 18S zolaklaryny (ýa-da bakterial RNA üçin 23S we 16S zolaklaryny) deňeşdirmek, merdiwan markerlerini we standartlary bellemek hem-de umumy RNA boýunça takmynan kadalaşdyrma ýazgysyny saklamak üçin ulanylýar. Çap edilen Northern usullarynda ýüklenişi barlamak üçin boýalan ribosomal zolaklar mukdar taýdan bahalandyrylýar; muňa kadalaşdyrmak üçin metilen gök bilen boýalan ribosomal zolaklary ulanan süýt ylmy boýunça iş hem degişlidir. Southern membranalaryny hem şol bir usul bilen görünýän etmek bolýar, ýöne bu boýag Northern-de ýüklenişi we geçirilmäni barlamak üçin has giňden ornaşandyr. Southern DNA-sy geçirilmezden öň denaturirlenýär, şonuň üçin gel üçin duýgurlyk sanlary oňa degişli däldir.

Ýüze çykaryş çäkleri we fon: gök boýagyň gowşak tarapy

Aşakdaky deňeşdirme bilkastlaýyn takmynan berilýär. Boýagyň netijeliligi geliň göterimine, zolagyň inine, optika we boýagy aýyrmagyň düzgünli ýerine ýetirilmegine baglydyr. Her sany takyk tehniki görkeziji däl-de, ululyk derejesi hökmünde kabul ediň.

Fona gözegçilik gowşak signalyň ulanyp boljakdygyny kesgitleýär. Erkin boýag güýçli reňklidir, şonuň üçin kontrast baglanan boýagy aýyrmazdan, baglanmadyk boýagy aýyrmak arkaly alynýar. Has konsentrirlenen boýag duýgurlygy seýrek ýagdaýda ýokarlandyrýar. Ol esasan boýagy aýyrmak wagtyny uzaldýar. Ulanylýan geliň, membrananyň we kameranyň hut özünde yzygiderli gowşadylan nusgalary barlaň we diňe integral dykyzlygyň girizilen mukdara proporsional bolýan aralygyny ulanyň. Metilen gök ýüklenişi ýarym mukdar taýdan kadalaşdyrmaga mümkinçilik berýär. Ol giň dinamiki aralygy bolan mukdarlaýyn seljerme däldir, sebäbi membrananyň sygymy, geçirme netijeliligi, doýgunlyk we boýagy aýyrmagyň derejesi ýodajykdan ýodajyga üýtgeýär.

Utgaşyklylyk çäkleri: boýamakdan soň näme saklanýar

Gök boýag bilen boýamakdan soň klonlamagyň mümkindigi görkezildi. Flores we kärdeşleri boýalan agaroza zolaklaryny kesip aldylar, DNA-ny bölüp aldylar, ony ligirlediler we transformasiýa geçirdiler. Olar etidiý bromid we UV ulanylandan soňky ýagdaý bilen deňeşdirilende klonlamagyň has gowy bolandygyny habar berdiler. Munuň ähtimal sebäbi boýagyň özünden gelýän peýda däl-de, fot zeperlenmäniň azlygydyr. Ak ýagtylykda saklama wagtyny gysga ediň we bölüp alnan DNA-ny adaty gel ekstraksiýasy bilen arassalaň.

PCR we sekvenirleme üçin subutnamalar has azdyr. Galyndy boýag nuklein kislotalaryna baglanýar, şonuň üçin fermentli ädimlerden öň boýagy aýryň we arassalaň. Gök boýalan gelden degişli derejede arassalanan DNA-nyň işlemegine garaşylýar, ýöne boýagyň göni indiki ädime geçmegine dürli polimerazalaryň we sekvenirleme himiýalarynyň çydamlylygy gowy mukdar taýdan kesgitlenmedikdir. Muny öz-özünden dogry diýip kabul etmäň.

Blot gibridleşdirmesi amallaryň tertibi berk saklananda utgaşyklydyr: geçirmegi, berkitmegi, boýamagy, netijäni resmileşdirmegi, boýagy aýyrmagy, gibridleşdirmegi. Bu yzygiderlilik Herrin we Schmidtiň usulydyr. Geçirmezden öň boýamak ýa-da boýagy aýyrmak ädimini taşlamak başga usuldyr we aýratyn tassyklanmagy talap edýär. Boýag aýrylandan soň, zondy aýyrmagyň we täzeden zondlamagyň standart amallary adaty tertipde dowam edýär. Şol bir boýag maşgalasy bilen öýjük derejesinde boýamak hem-de berkidilen ýuka gatlak bilen işlemek ýörelgesiniň näme üçin diri öýjük usullaryna geçirilip bolmaýandygy barada mikroskopiýa üçin boýag atlasyna serediň.

Hemişelik berkitme usuly ulanylmasa, zolaklary kesip almak preparatiw agaroza üçin hem, gök boýag bilen ýerleşýän ýeri kesgitlenen PAGE oligonukleotidleri üçin hem işleýär. Boýag aýrylandan soň elektroelýusiýa gaýdymly baglanyşýan madda üçin himiki taýdan mümkin, ýöne hut metilen gök bilen bagly gözegçilikli çykym maglumatlary azdyr. Elýusiýadan soň duzlary aýryň ýa-da çökdürme geçiriň.

Gaýtalanýan şowsuzlyklar

Solgun gel zolaklary adatça kolorimetrik boýag üçin massanyň juda azdygyny aňladýar, esasan hem gysga bir zynjyrly ýa-da RNA nyşanalary üçin. Has köp nusga ýükläň, täze boýag ulanyň, konsentrasiýany ýokarlandyrmazdan öň boýamak wagtyny uzaldyň we boýagy aýyrmagy has ir bes ediň. Kontrastsız, tutuşlygyna gök gel adatça aşa boýalandygyny ýa-da suwuň ýeterlik gezek çalşylmandygyny görkezýär. PAGE zolaklarynyň solmagy boýamagyň şowsuzlygy däl-de, garaşylýan himiki häsiýetdir. Çalt surata alyň. Membrananyň fonunyň deň bolmazlygy eplenmelere, köpürjiklere, barmak yzlaryna, deň bolmadyk çaýkamaga ýa-da bölekleýin geçirilmä yşarat edýär. Gibridleşdirme gözegçiligi bolmasa, muny deň bolmadyk ýükleniş diýip düşündirmäň. Ýaýraň we gowşak ribosomal şekil dargamany aňladyp biler, ýöne doly geçirilmezligi, umumy RNA-nyň juda azlygyny (adaty ýodajyklara birnäçe mikrogramdan onlarça mikrograma çenli ýüklenýär) ýa-da boýagyň aşa aýrylmagyny hem aňladyp biler. Boýag köp mukdardaky ribosomal RNA-ny görkezýär. Ol belli bir transkripti görkezmeýär. Bu işi zond ýerine ýetirýär.

Artykmaç tassyklamalarsyz howpsuzlyk we işlemek

Metilen gök bilen işlemek etidiý bromide garanyňda has ýönekeý, ýöne ol zyýansyz däldir. MilliporeSigma-nyň häzirki howpsuzlyk maglumatnamasy boýagy agyz arkaly ýiti zäherlilik boýunça 4-nji kategoriýa, ýagny ýuwdulanda zyýanly diýip toparlandyrýar; Sigma-Aldrich metilen gök SDS boýunça ony tassyklanan galyndy ýok ediş ýoly bilen aýyrmak gerek. Etidiý bromidiň Sigma-Aldrich etidiý bromid SDS maglumatnamasynda genotoksiklik, şol sanda jyns öýjüklerine güman edilýän täsirler barada has güýçli duýduryşlar bar. Thermo Fisher nuklein kislotalaryny boýamak boýunça gollanmada bellenilişi ýaly, onuň gelleri we erginleri adatça howply himiki galyndy hökmünde aýratyn ýygnalýar. Iki madda üçin hem SDS-e we edaranyň düzgünlerine eýeriň. Gury boýagy berk ýapyk we gury saklaň, iş erginini diňe protokolyň rugsat berşi ýaly gaýtadan ulanyň, boýalan membranalary süzgüç kagyzlarynyň arasynda gury saklaň we zolaklar diffuziýa arkaly ýaýramazdan öň gelleri surata alyň.

Iş stolundaky esasy düzgüni ýatda saklaň. Geller ak ýagtylykda ýokary mukdar ýüklenende görünýänligi barlaýar. Membranalar bolsa zond duýgur işi ýerine ýetirmezden öň geçirilmäni we ýüklenişi barlaýar. Bir boýag iki wezipäni hem ýerine ýetirýär, ýöne onuň duýgurlygy çäklidir, baglanyşygy gaýdymlydyr we amallaryň tertibi berk saklanmalydyr.