Metilen gögüniň kalibrleme egrisini gurmak: boş nusgalar, aralyk we çyzyklylyk

Iki analitik metilen gögüniň bir esasy ergin çüýşesini bilelikde ulanýar we hersi kalibrleme egrisini gurýar. Birinjisi koordinatalaryň başlangyjyndan geçýän göni çyzyk alýar we näbelli nusgalary ynam bilen ölçýär. Ikinjisi bolsa ýokarky böleginde egrelýän çyzyk, nola golaýlamaýan ordinata oky bilen kesişme we suwuklandyrylanda üýtgeýän nusga netijelerini alýar. Şol bir boýag, şol bir enjam, şol bir tolkun uzynlygy. Tapawut başarnykda däl. Ol meýilleşdirişde: boş nusga näme goşuldy, haýsy konsentrasiýalar saýlandy we barlanan aralyk bir ýönekeý modeliň henizem dogry bolýan çäginde galdymy.

Kalibrleme egrisi enjamyň jogaby bilen konsentrasiýanyň arasyndaky ylalaşykdyr; ol diňe gurlan şertlerinde güýje eýedir. Metilen gögi üçin bu ylalaşygyň belli bir gowşak ýeri bar. Boýag suwda özara birleşýär, şonuň üçin ýagtylygy siňdirýän görnüş konsentrasiýa bilen üýtgeýär. Şol üýtgeşmäni öz içine alýan aralykda gurlan egri göni bolmaz we hiç hili statistika muny düzedip bilmez. Bu makala çyzygyň manyly bolmagy üçin egrini nähili meýilleşdirmelidigini görkezýär: dogry boş nusgany saýlaň, aralygy monomeriň agdyklyk edýän çäginde saklaň, garaşsyz gaýtalamalary ulanyň we egriligi tötänleýin gykylyk däl-de, maglumat hökmünde düşündiriň.

Standartlardan däl-de, boş nusgadan başlaň

Boş nusga noly kesgitleýär we metilen gögi üçin onuň düzüminde boýagdan başga ähli zat bolmalydyr. Suwuň arassalyk derejesi, bufer we pH, duzlar, goşmaça eredijiniň paýy hem-de temperatura birmeňzeş bolmalydyr. Kalibrleme standartlaryny hut şol matrisada taýýarlaň. Munuň sebäbi resmi talap däl-de, himiýadyr. Duz we erediji monomeriň, dimeriň we has uly agregatlaryň arasyndaky deňagramlylygy üýtgedýär, bu bolsa ölçeg tolkun uzynlygyndaky spektri üýtgedýär. Diňe suwdan ybarat boş nusga matrisanyň täsiri bilen himiki görnüşleriň paýlanyşynda ýüze çykýan üýtgeşmäni düzedip bilmez. Suwdaky metilen gögi spektrleriniň global seljermesinde, onuň açyk elýeterli ýazgysy arkaly hem okap bolýar, natriý hloridiniň konsentrasiýasy 0-dan 0.15 M-e çenli üýtgedildi. Sebäbi ion güýji deňagramlylygy süýşürýär we duz artdygyça agregasiýa hem artýar.

Munuň bir amaly netijesi bar: hiç haçan deionizirlenen suwda kalibrläp, soňra nusgalary fosfat buferinde ýa-da hapa suwuň filtratynda ölçemäň. Analitsiz matrisa ýok bolsa, nusganyň özüne standart goşmak matrisasy gabat gelmeýän daşarky egriden has gowudyr. Suwly erginlerdäki seljermeleriň ygtybarlylygyny saklamak baradaky degişli maslahatlar matrisa we päsgelçilikler baradaky bölümde, boýaglaryň mukdar seljermesiniň umumy ýörelgeleri bolsa seljermäni meýilleşdirmegiň umumy synynda beýan edilýär.

Bir görnüşiň agdyklyk edýän aralygyny saýlaň

664 nm töweregindäki uzyn tolkunly zolakda mukdary kesgitlemek boýagyň köp böleginiň monomer görnüşinde bolýandygyny göz öňünde tutýar. Arassa suwda bu çaklama diňe erginler gowşak konsentrasiýaly bolanda, takmynan pes mikromolýar aralykda dogry bolýar. Neşir edilen tejribe ýapgytlyklary bu araçägi görkezýär: 1 cm kýuwetalarda takmynan 7 mikromolýardan pes saklanan kalibrlemeler 82,000 M-1 cm-1 töwereginde ýapgytlyk berýär, emma takmynan 37 mikromolýara çenli giňeldilen kalibrlemäniň ýapgytlygy 67,100 töweregine düşýär, sebäbi ýokary konsentrasiýaly standartlarda eýýäm ep-esli dimer bolýar. Bu ýerde getirilen her bir koeffisiýentiň degişli şertleri metilen gögüniň spektral maglumatnamasynda görkezilýär; sanlary deňeşdirmek üçin dogry çeşme şol maglumatnamadyr. Bu makalada olar diňe aralygy kesgitlemek üçin ulanylýar.

Meýilleşdiriş düzgünleri şundan gönüden-göni gelip çykýar:

1. Iň ýokary konsentrasiýaly standarty spektriň şekili durnukly galar ýaly ýeterlik derejede suwuk saklaň. Usuly işläp düzýän wagtyňyz her dereje üçin diňe bir tolkun uzynlygyny ölçemegiň ýerine, görünýän ýagtylygyň tutuş aralygyny (takmynan 550-den 750 nm-e çenli) skanirläň. Kadalaşdyrylan spektrleriň şekili konsentrasiýa bilen üýtgeýän bolsa, himiki ýagdaý üýtgeýär we aralyk aşa giňdir.
2. Derejeler boýunça 610 nm töweregindäki absorbansiýanyň 665 nm töweregindäki absorbansiýa bolan gatnaşygyny yzarlaň. Konsentrasiýa bilen ýokarlanýan gatnaşyk dimeriň egin zolagynyň ulalýandygyny we monomer modeliniň dogry bolman başlaýandygyny aňladýar. Bu anyklaýyş usuly agregasiýa we konsentrasiýanyň täsirleri baradaky gollanmada has giňişleýin düşündirilýär.
3. Pes mikromolýar konsentrasiýalar bilen işlemek üçin 1 cm kýuwetany ulanyň. Ýapgytlyk 82,000 töwereginde bolanda, 5 mikromolýar takmynan 0.41 absorbansiýa, 10 mikromolýar bolsa takmynan 0.82 absorbansiýa berýär; bularyň ikisi-de enjamlaryň köpüsi üçin amatlydyr.
4. Konsentrirlenen esasy erginler üçin 1-den ep-esli ýokary absorbansiýa bilen ylalaşmagyň ýerine optiki ýoly gysgaldyň. Ýöne gysga ýoluň himiýany däl-de, fotometriýany düzedýändigini ýadyňyzda saklaň. Agregasiýa optiki ýol uzynlygyna däl-de, konsentrasiýa baglydyr, şonuň üçin konsentrirlenen esasy ergin üçin gowşak konsentrasiýaly monomer egrisiniň ýerine himiki görnüşleriň paýlanyşyny göz öňünde tutýan aýratyn çemeleşme gerek.

Bu düşünjäniň köp böleginiň esasyny düzýän global model laýyklaşdyrmasy 1.1 mikromolýardan 3.4 millimolýara çenli bolan 224 spektri öz içine aldy we tetrameriň signalynyň 34 mikromolýardan aşakda hem eýýäm ýüze çykarylýandygyny görkezdi. Bu netije seresap bolmalydygyny ýatladýar: çyzykly aralyk ilkinji çaklamadan has dardyr, şonuň üçin ony çaklamak däl-de, barlamak gerek.

Derejeler, gaýtalamalar we ölçeg tertibi

Üç nokatly egri hiç zady subut etmeýär. ICH Q2(R2) tassyklama gollanmasy çyzyklylygy bahalandyrmak üçin azyndan bäş konsentrasiýany talap edýär. Noldan tapawutly alty-sekiz dereje bolsa, aýratyn-da agregasiýanyň başlanýan ýokarky böleginde, has ynandyryjy iş egrisini berýär. Derejeleri amatlylyk üçin saýlanan geometrik hatar boýunça däl-de, göz öňünde tutulýan nusga aralygyny gurşap alar ýaly we egriligiň ýüze çykmagy iň ähtimal ýerlerde has dykyz ýerleşdiriň.

Her derejäni bir kolbadan üç gezek ölçemegiň ýerine, garaşsyz taýýarlanan iki ýa-da üç nusgada ölçäň. Garaşsyz gaýtalamalar taýýarlamakdaky ýalňyşlygy ýüze çykarýar; bir kolbanyň gaýtadan ölçegleri bolsa diňe enjamyň tötänleýin üýtgemelerini görkezýär. 2020-nji ýyldaky global barlagda her ergin üç gezek ölçeldi; bu henizem esasly başlangyç saýlawdyr. Ölçeg tertibini tötänleýinleşdiriň, şonda signalyň wagtyň geçmegi bilen süýşmegi, aýna adsorbsiýa ýa-da temperaturanyň üýtgemegi egrilik ýaly görünmez. Kwars kýuwetalar boýunça bir barlagda 34 mikromolýar ergindäki boýagyň takmynan 3 göteriminiň 10 minutyň içinde adsorbirlenýändigi ýüze çykaryldy. Şonuň üçin tutuş ölçeg tapgyrynda galtaşma wagtyny, kýuwetany, arassalaýyş usulyny we yzygiderliligi birmeňzeş saklaň.

Düşündirişli hasaplama mysaly (ölçenen maglumatlar däl)

Aşakdaky sanlar hasaplamany görkezmek üçin oýlanyp tapyldy. Olar laboratoriýa ölçegleri däl we metilen gögüniň maglumatlary hökmünde görkezilmeli däldir. Esasy zat, bu sanlar bilen bilelikde geçirilýän barlaglaryň yzygiderliligidir.

Matrisasy gabat gelýän buferde alty standart bar diýip göz öňüne getireliň; optiki ýol 1 cm, ölçeg bolsa 665 nm-de şol matrisa laýyk boş nusga garşy geçirilýär:

Ortaça absorbansiýany konsentrasiýa baglylykda göni çyzyk bilen laýyklaşdyrmak her mikromolýara takmynan 0.0805 absorbansiýa birligi bolan ýapgytlygy we noldan bary-ýogy birnäçe milliabsorbansiýa birligi tapawutlanýan ordinata oky bilen kesişmäni berýär. Ýapgytlygy optiki ýol uzynlygyna bölmek ony görünýän molýar siňdirijilik koeffisiýentine öwürýär: her mikromolýara 0.0805 takmynan 80,500 M-1 cm-1-e deňdir we bu suwda monomeriň agdyklyk edýän aralygyna laýyk gelýär. Möhüm barlag R kwadraty däl, sebäbi ol her ýagdaýda-da örän gowy görner. Möhüm zatlar — nola ýakyn kesişme, S2-den S5-e çenli durnukly A610/A665 gatnaşygy we belli bir ugur görkezmän dargan galyndylar. S6-da gatnaşygyň ýokarlanmagy şol derejäni aýyrmalydygyny ýa-da 7 mikromolýary bu matrisa bilen enjamyň utgaşmasy üçin wagtlaýyn ýokarky çäk hökmünde bellemelidigini görkezýän anyk signaldyr.

Şol bir şertlerde absorbansiýasy 0.245 bolan näbelli nusganyň netijesi gönüden-göni öwrülýär: 0.245-i her mikromolýara 0.0805-e bölmek, nusganyň suwuklandyrma koeffisiýenti ulanylmazdan öň, takmynan 3.0 mikromolýar berýär. Netijäni şertleri bilen bilelikde habar beriň: tolkun uzynlygy, optiki ýol, boş nusganyň matrisasy, kalibrleme aralygy we senesi.

Doldurylýan kalibrleme iş sahypasy

Her täze matrisa üçin bu şablony laboratoriýa ýazgysyna göçüriň. Bir matrisa, bir sahypa, bir egri.

Reagentiň görnüşi baradaky setir ýerliklidir. Söwdada satylýan metilen gögi suwsuz duz ýa-da trigidrat ýaly gidrat bolup biler; nädogry molýar massa bolsa her nominal konsentrasiýada duýdurmazdan ulgamlaýyn ýalňyşlyk döredýär. Başlangyç materialyň arassalygyny we spesifikasiýa laýyklygyny barlamak hil we arassalyk derejeleri baradaky gollanmada beýan edilýär.

Garaşsyz barlag standarty bilen barlaň

Kalibrleme egrisi hiç haçan öz işine özi baha bermeli däldir. Modeli laýyklaşdyranyňyzdan soň, aýratyn çekilip taýýarlanan esasy erginden kabul edilen aralygyň ortasyna ýakyn konsentrasiýada bir barlag standartyny taýýarlaň we ony näbelli nusga hökmünde ölçäň. Birnäçe göterimiň çägindäki gabat gelme taýýarlama zynjyrynyň dogrudygyny tassyklaýar; gabat gelmezlik bolsa enjamdan däl-de, esasy erginden ýa-da suwuklandyrmalardan şübhelenmäge esas berýär. Her nusga tapgyry bilen barlag standartyny gaýtalaň. Egri üýtgemän, barlag standartynyň netijesi süýşýän bolsa, nusgalardan şübhelenmezden öň iş erginlerini ýa-da kýuwetany barlaň. Şu ýeke endik göze ilmeýän ýalňyşlyklaryň köpüsini ýüze çykarýar: suwsuz reagente gidratyň molýar massasynyň ulanylmagy, kalibrlemesi bozulan mikropipetka, nädogry ion güýjünde taýýarlanan bufer. Soňra ýazgyny okaýan adam çyzygyň diňe çyzylman, eýsem barlanandygyny görer ýaly, barlag standartynyň tapylan konsentrasiýasynyň garaşylýan konsentrasiýa gatnaşygyny iş sahypasynda ýapgytlygyň ýanynda belläň.

Çyzykly däl häsiýeti sebäbi anyklamak üçin düşündirmek

Egri egrelende, gyşarmanyň şekili onuň sebäbini görkezýär. Ýokary absorbansiýada spektriň şekili üýtgemän aşak egrelmek enjam bilen bagly meseläni görkezýär; köplenç parazit ýagtylyk güýçli absorbansiýalary hakykatdakydan pes görkezýär. 610 nm-däki egin zolagynyň ýokarlanmagy bilen bilelikde ýüze çykýan egrilik bolsa himiýany görkezýär: dimer we has uly agregatlar ýagtylygy monomerden başgaça siňdirýär. Nola sazlap bolmaýan boş nusga ýa-da wagtyň geçmegi bilen görkezijileri peselýän standartlar gap bilen bagly meseläni görkezýär: aýna ýa-da kýuweta adsorbsiýa, aýratyn-da ölçegleriň dowamynda galtaşma wagtlary tapawutlanan bolsa. Nokatlardan geçýän arassa göni çyzyk nusgalar üçin henizem nädogry netijeleri berýän bolsa, mesele matrisadadyr: nusgalar kalibrleme standartlaryndan tapawutlanýar. Şonuň üçin egrini nusganyň matrisasynda täzeden guruň ýa-da standart goşmak usulyna geçiň. Her ýagdaýda galyndylaryň konsentrasiýa baglylyk grafigini çyzyň. Tötänleýin dargama göni çyzyk modelini goldaýar; ýylgyryş ýa-da gaş çytyp duran şekile meňzeş paýlanyş bolsa ony islendik R kwadraty çäginden has ygtybarly inkär edýär. Tassyklama gollanmalary hem bu pikiri açyk goldaýar.

Metilen gögi şeýle tertipli çemeleşmede ygtybarly netije berýär. Onuň monomer zolagy güýçlüdir, himiýasy gowy öwrenilendir we sanlar ýoýulmazdan öň näsazlyklary spektrde görünýär. Egrini dar aralykda guruň, matrisa laýyk boş nusgany ulanyň, garaşsyz gaýtalamalary geçiriň we aralygy saýlamakda spektrleriň şekiline daýanyň. Alnan çyzyk gysga bolar, ýöne onuň her nokady dogry bolar.

Bu makaladaky düşündirişli hasaplamalarda usuly görkezmek üçin oýlanyp tapylan sanlar ulanylýar. Doly şertleri bilen ölçenen maglumatnama koeffisiýentleri baglanyşyk berlen spektral maglumatnamada görkezilýär; esas bolup hyzmat edýän agregasiýa barlagy bolsa PMID 33251415 belgisi bilen indekslenendir.