Metilen gögi bilen geçirilen synaglarda kislorodyň reaktiw görnüşlerini ölçemek

Iki barlaghana özleriniň metilen gögi bilen antioksidant synagy diýip atlandyrýan barlagyny geçirýär. Olaryň biri boýagyň kislorodyň reaktiw görnüşlerini basyp ýatyrýandygyny habar berýär. Beýlekisi bolsa onuň olary döredýändigini habar berýär. Ikisi hem aýdyň doza–jogap egrilerini görkezýär. Ikisi hem ak ýürekden işleýär. Tapawut galplykda ýa-da başarnyksyzlykda däl. Sebäp, bu iki toparyň dürli ýagtylyk şertlerinde, dürli soraglara jogap berýän zondlar bilen dürli zatlary ölçäp, soňra iki jogaby hem şol bir söz bilen — ROS — beýan etmegindedir.

Metilen gögüni takyk ölçemek kyn, sebäbi bu molekula gözegçilik etmeli himiki hadysalaryna özi hem gatnaşýar. Garaňkylykda ol donorlar bilen akseptorlaryň arasynda elektronlary geçirýär we ýene bir aýlaw üçin taýýar bolup, başlangyç görnüşine dolanýar. Ýagtylygyň täsirinde bolsa fotosensibilizatora öwrülýär we oýandyrylan triplet ýagdaýa geçýär. Şol ýagdaýdan kisloroda energiýa geçirip singlet kislorodyny döredip ýa-da elektron geçirip radikallary we wodorod peroksidini emele getirip bilýär. Şeýle ulgama ýerleşdirilen islendik zond boýagyň özi tarapyndan okislenip, gaýtarylyp, reňksizlendirilip ýa-da optiki taýdan örtülip bilner. Şonuň üçin islendik ROS görkezijisi barada ilkinji sorag hiç haçan sanyň nämedigi däl. Ilkinji sorag seljerme synagynyň aslynda nämäni ýüze çykarýandygy we boýagyň şol synaga nähili täsir edýändigidir.

Amplex Red: kalibrlenen wodorod peroksidi synagy

Metilen gögi bilen Amplex Red-iň utgaşmasy dogry guralanda bu ugurdaky ylmy işlerde iň ygtybarly jübütleşme hasaplanýar. Himiki reaksiýa belli bir madda mahsusdyr: hren peroksidazasy wodorod peroksidini ulanyp, Amplex substratyny takmynan bir-bire stehiometrik gatnaşykda fluoressent önüm bolan rezorufine okisleýär. Nusgadaky peroksid detektorda fluoressensiýa öwrülýär. Adaty ROS toparyndaky başga hiç bir görnüş bu reaksiýany gönüden-göni amala aşyrmaýar.

Esasy artykmaçlyk kalibrlemedir. Ünsli barlagçy peroksidiň belli mukdarly standartlaryny şol bir buferde, peroksidazanyň we substratyň şol bir konsentrasiýalarynda, şol bir inkubasiýa wagtynda hem-de şol bir optiki sazlamalarda barlaýar, soňra nusgalaryň netijelerini şol egri bilen deňeşdirýär. Bu usulyň esasyny düzýän, bölünip alnan beýni mitohondriýalary baradaky barlagda awtorlar hut şeýle etdiler: her synagyň ahyrynda peroksidiň belli mukdarlaryny goşdular. Netijeler şertli fluoressensiýa birlikleri däl-de, bir milligram belok üçin minutda pikomol bilen aňladylýan tizlikler hökmünde berildi. Ýagty saçmagy ölçeg netijesine öwürýän zat hut şudur.

Şol barlagyň üç aýratynlygyny görelde almak ýerliklidir. Birinjiden, awtorlar peroksidi dargadýan katalaza bilen signaly barladylar. Katalaza goşulanda metilen gögüniň döreden fluoressensiýa ýokarlanmasy saklandy. Bu, signalyň optiki artefakt däl-de, peroksid bilen baglydygyny tassyklady. Ikinjiden, olar oýandyryjy şöhläniň öňüni ýapyp, nusgalara adaty ýagtylyk dozasynyň diňe sekizden birini berdiler we şeýlelikde yşyklandyryşyň täsirini gönüden-göni barladylar. Signal diňe dokuz göterim azaldy. Olaryň habar beren peroksidiniň togsan göteriminden gowragy ölçeg üçin ulanylýan ýagtylyga bagly däldi. Üçünjiden, olar peroksidiň aýrylmagyny elektrod bilen aýratyn ölçediler we boýagyň hem onuň öndürilişini ýokarlandyrýandygyny, hem-de aýrylmagyny haýalladýandygyny anykladylar. Diňe jemleýji fluoressensiýany görkezýän zond bu iki täsiri biri-birinden tapawutlandyryp bilmezdi.

Bu seljerme synagynyň hem ýalňyş netije berip bilýän ýagdaýlary bar we metilen gögi olaryň ençemesini ýüze çykarýar. Boýag rezorufiniň ýagtylyk çykarýan şol bir gyzyl spektr böleginde giň gerimde ýagtylygy siňdirýär. Şonuň üçin boýagyň ýokary konsentrasiýalarynda nusga içki süzgüç täsirleri arkaly öz signalyny örtüp biler. Şoňa görä standartlarda boýagyň konsentrasiýasy nusgalardaky bilen birmeňzeş bolmalydyr. Amplex Red özbaşdak hem fotookislenip bilýär, onuň önümi rezorufin bolsa superoksid we peroksid döredýän fotoredoks aýlawyna gatnaşyp bilýär. Synagda fotosensibilizator hem yşyklandyrylýan bolsa, bu aýratyn möhümdir. Amaly çözgüt — boýagy we zondy bilelikde yşyklandyrmagyň ýerine, ilki metilen gögi bolan nusgalary şöhlelendirip, soňra olaryň alikwotalaryny garaňkylykda Amplex reagentleri bilen seljermekdir. Ahyrynda, superoksid dismutazasy Amplex signalyny diňe basyp ýatyrmaýar: superoksidi perokside öwürmek signaly ýokarlandyryp biler. Fluoressensiýany ýokarlandyrýan SOD gözegçilik synagy şowsuz bolmandyr. Ol reaksiýa zynjyrynyň öňki basgançagynda superoksidiň bardygyny ýüze çykarypdyr.

DCFDA: mahsus däl okislenme görkezijisi

Metilen gögi bilen DCFDA-nyň utgaşmasy bulaşyklygyň köp böleginiň çeşmesidir. DCFH-DA öýjüge girizmek üçin ulanylýan başlangyç birleşmedir. Öýjügiň içindäki esterazalar onuň asetat toparlaryny aýryp, fluoressensiýa bermeýän DCFH-ni galdyrýar. DCFH okislenende bolsa fluoressent DCF emele gelýär. Ony okisleýän maddalaryň sanawy uzyn: gidroksil radikallary, peroksidazanyň we gemiň aralyk önümleri, azot dioksidi, gipohlorly kislota we peroksinitritden emele gelýän radikallar. Wodorod peroksidiniň özi ony ölçemäge ýaramly tizlikde gönüden-göni okislemeýär; perokside bagly fluoressensiýa üçin adatça demir, gem beloklary ýa-da peroksidaza bilen bagly himiki reaksiýalar hem zerurdyr.

Her usullar bölüminde salgylanylmagy zerur bolan tankydy seljerme Kalyanaraman we kärdeşleriniň DCFH-ni zond hökmünde öwrenen işinden gelip çykýar. Bu seljerme şu sebäpden DCFDA-ny ret eden beýni mitohondriýalary baradaky barlagda jemlenýär. Olar bu boýagyň haýal reaksiýa girýändigini, stehiometriýasynyň häsiýetlendirilmedigini, ygtybarly kalibrlemesiniň ýokdugyny we ROS däl birleşmeler bilen hem reaksiýa girýändigini görkezdiler. Zond ölçenýän hadysany hem güýçlendirýär: DCFH-niň bir elektron arkaly okislenmegi DCF radikalyny döredýär. Bu radikal kislorod bilen reaksiýa girip superoksid emele getirýär, ol bolsa dismutasiýa arkaly goşmaça perokside öwrülýär. Şeýlelikde, ölçeg usuly habar berýän himiki hadysasynyň bir bölegini özi döredýär.

Bularyň hiç biri DCFDA-ny peýdasyz etmeýär. Ýöne ol maddany anyklamak üçin däl-de, başlangyç barlag üçin ýaramlydyr. DCF fluoressensiýasynyň ýokarlanmagy oksidantlara bagly zond okislenmesiniň artandygyny aňladýar. Bu peroksidiň artandygyny aňlatmaýar we elbetde umumy ROS mukdarynyň artandygyny hem aňlatmaýar, sebäbi hiç bir zond bu umumy mukdary ýeke özi ölçemeýär. Metilen gögüniň bir mikromolýardan ýokary konsentrasiýalarynda DCF okislenmesine daýanan irki işler prooksidant täsirleri habar berdiler, şol döwürdäki beýleki ulgamlarda bolsa peroksidiň döredýän öýjük ölüminden gorag bellenildi. Dürli redoks şertlerinde şol bir boýag barada iki syn hem dogry bolup biler. Diňe DCF netijesi signaly haýsy oksidantyň döredendigini aýdyp bilmez. Beýni mitohondriýalary baradaky öňki işiň ähmiýeti, onuň bu başlangyç barlagy kalibrlenen peroksid ölçegi bilen çalşyp, ýüki gönüden-göni ýüze çykarandygyndadyr: hatda ýüz nanomolýar boýag hem barlanan ähli substratlarda we dem alyş ýagdaýlarynda peroksidiň bölünip çykmagyny birnäçe esse ýokarlandyrdy.

DCFDA-da metilen gögüne mahsus ýene bir bökdençlik bar. Boýagyň reňki güýçli we ol redoks taýdan işjeňdir. Şonuň üçin ol öýjük ROS-yndan garaşsyz ýagdaýda fluoressensiýany reňksizlendirip, ýagtylyk çykarylyşyny söndürip ýa-da zondy himiki taýdan okisläp biler. Boýag we zond bar bolan, emma öýjükler bolmadyk gözegçilik synagy islege görä goşulýan bezeg däldir. Boýagyň zond bilen özara täsirleşýändigini görkezýän synag hut şudur.

Spin tutmak we kislorodyň sarp edilişi: görnüşi anyklamak we akym

Fluoressent zondlar okislenip bilýän bir zadyň ýüze çykandygyny görkezýän bolsa, spin tutujylar bilen elektron spin rezonansy onuň nämedigini anyklamaga has ýakyn maglumat berýär. Metilen gögüniň fotohimiýasy baradaky nusgalyk barlagda boýagdan, askorbatdan we ýagtylykdan emele gelen askorbat radikalyny ýüze çykarmak üçin ESR ulanyldy. Soňra kislorodyň sarp edilişini ölçän synaglarda peroksidiň emele gelşi, spin tutmak synaglarynda bolsa demriň katalizleýän gidroksil radikalynyň emele gelşi görkezildi. Her usul beýlekileriň jogap berip bilmedik soragyna jogap berdi: ESR radikalyň görnüşini anyklady, kislorodyň sarp edilişi islendik fluoressent zonddan garaşsyz reaksiýa akymyny görkezdi, olaryň utgaşmasy bolsa şol bir yşyklandyrylan ulgamda hem singlet kislorodynyň, hem-de radikal ýollarynyň işleýändigini ýüze çykardy.

1984-nji ýyldaky bu netije häzirem duýduryş hökmünde kabul edilýär. Yşyklandyryş we gaýtaryjy serişde bar wagty boýag peroksid döretdi, demir bar wagty bolsa ulgam bu topardaky iň reaktiw görnüş bolan gidroksil radikalyny emele getirdi. Awtorlar muny gözdäki askorbat bilen baglanyşdyrdylar we boýagyň oftalmologiýada seresapsyz ulanylmagyny sorag astyna aldylar. Häzirki okyjylar şertlere üns bermelidir: ýagtylyk, gaýtaryjy we demir. Bularyň islendik biri aýrylsa, reaksiýa ýoly gowşaýar ýa-da ýitýär.

Kislorod elektrodlarynyň peýdasy başgaça ýüze çykýar. Klark görnüşli elektrod kislorodyň arassa sarp edilişini ölçäp, boýagyň döredýän redoks reaksiýalarynyň molekulýar kislorody sarp edýändigini tassyklaýar we hiç bir fluoressensiýa artefaktynyň galplaşdyryp bilmeýän kinetiki maglumatlaryny berýär. Ýöne ol önümi anyklamaýar. Peroksidiň, superoksidiň we suwuň emele gelmegi, şeýle hem singlet kislorodynyň dargamagy kislorody sarp edýär. Önümi anyklamazdan akymy ölçemek, akymy ölçemän önümi anyklamak ýaly doly däl. Şonuň üçin ygtybarly işler elektrody kalibrlenen peroksid synagy ýa-da tutujy bilen utgaşdyrýar.

Antioksidant netijeleri näme üçin gapma-garşy bolýar

Bu üç ölçeg usulyny ýanaşyk goýsaňyz, metilen gögi baradaky ylmy işlerde görünýän gapma-garşylyklar usullaryň tapawutlaryna we üç biologik hakykata gelip direýär.

Birinjiden, boýag hem elektron geçirijidir, hem-de peroksidiň çeşmesidir. Ol elektronlary kislorodyň başga ýagdaýda superokside öwrüljek dem alyş nokatlaryndan sowup, ROS-yň bir görnüşini azaldyp biler. Şol bir wagtda onuň gaýtarylan görnüşi kislorody gönüden-göni perokside gaýtaryp, beýleki görnüşiň mukdaryny ýokarlandyrýar. Şonuň üçin mitohondrial redoks himiýasyny we metilen gögüniň aýlaw ýolundaky ornuny öwrenýän barlaghana zonda bagly jogaplara garaşmalydyr: şol bir kýuwetada superokside duýgur görkeziji peselýär, peroksid görkezijisi bolsa ýokarlanýar.

Ikinjiden, pes dozalarda peroksid diňe zeper ýetiriji däl, eýsem signaldyr. Öňki işiň dowamyndaky syçan beýnisiniň mitohondriýalary baradaky barlag hatda elli nanomolýar boýagdan hem peroksidiň emele gelýändigini, bejeriş derejelerinde bolsa mitohondrial DNK-da zeperlenmeleriň ýokdugyny ýüze çykardy. Öňünden täsir etdirilenden soň rotenonyň döredýän zeperlenmelerinden gorag hem syn edildi. Diňe bejeriş aralygyndan örän ýokary bolan ýüz mikromolýar konsentrasiýada boýag saýlanan DNK böleklerine zeper ýetirdi. Gyzyl ýagtylyk bilen ýigrimi mikromolýar boýag bilelikde bolsa barlanan ähli böleklere zeper ýetiren singlet kislorodyny döretdi. Teklip edilen mehanizm gormezis bilen baglydyr: peroksidiň az mukdarda öndürilmegi Nrf2 bilen bagly antioksidant gorag mehanizmlerini we mitohondrial biogenezi işjeňleşdirýär. Şeýlelikde, gysga möhletli prooksidant görkeziji uzak möhletli antioksidant netijeden öň ýüze çykýar. Bir sagatdan soň okalan synag bilen bir günden soň okalan synagyň netijeleri gabat gelmezligi mümkin, sebäbi olaryň arasynda biologik ýagdaý üýtgäpdir.

Üçünjiden, ýagtylyk hatda haýsy molekulanyň bardygyny hem kesgitleýär. Yşyklandyryş boýagyň metil toparlaryny aýryp, ony Azure B we oňa meňzeş önümlere öwürýär. Gapjagazyň üstündäki mikroskop çyrasy hem ony fotosensibilizasiýa etmek üçin ýeterlikdir. Garaňkylykda we ýagtylykda geçirilen synaglar dürli synaglardyr. Islendik teswirnamanyň yşyklandyryşa we boýag bilen işlemäge gözegçilik çäreleri bölümi hem olara şeýle garamalydyr.

Iň az zerur gözegçilik toplumy we islendik tassyklamany nähili okamalydygy

Aşakdaky deňeşdirme bu makala üçin taýýarlanan özboluşly salgylanma materialydyr. Metilen gögi bilen bagly islendik ROS netijesini kabul etmezden öň, awtorlaryň haýsy setirdäki gözegçiligi ýerine ýetirendigini we haýsyny geçip gidendigini barlaň.

Mundan amaly okamak düzgüni gelip çykýar. Peroksidaza bilen ulanylýan, kalibrlenen we katalaza arkaly barlanan Amplex peroksid barada subutnamadyr. DCFDA diňe zondyň mahsus däl okislenmesi barada subutnamadyr, başga zat däl. Radikallary tutup zyýansyzlandyrýan serişdeler bilen gözegçilik edilýän spin tutmak radikalyň görnüşi barada subutnamadyr. Kislorodyň sarp edilişi akym barada subutnamadyr. Seljerme synagynyň tassyklap biljek çäginden has köp zady öňe sürýän sözlem, näçe ynamly ýazylan hem bolsa, boýag barada däl-de, zond barada aýdylan sözlemdir. Doza baglylyk we gormezis aralygy, mitohondrial elektron akymy, boýalan nusgalarda seljerme synagyna päsgelçilikler hem-de mikroskopiýadaky yşyklandyryş artefaktlary baradaky baglanyşykly pikir alyşmalar bu meseleleriň hersini giňeldýär. Wagtlaýyn salgylanmalary hakyky salgylanmalar bilen çalşylandan soň hem olaryň her biri dogrulygyny saklaýar.