Metilen gögüniň mitohondrial täsirlerini ölçemek: kislorod, ATP we membrana potensialy

Bir barlaghana dem alyş işjeňligi bozulan mitohondriýalara metilen gögüni goşýar we kislorod sarp edilişiniň ýokarlanýandygyny görýär diýip göz öňüne getiriň. Şeýle ýagdaýda boýag mitohondrial funksiýany dikeltdi diýip ýazmak tebigy görünýär. Emma bu sözlem nädogry bolup biler. Kislorod akymy, ATP sintezi we membrana potensialy üç aýry düşünjedir. Olar şol bir organella bilen baglanyşykly, edil ätiýaçlyk nusgalamak, sinhronlamak we paýlaşmak şol bir bulut bukjasy bilen baglanyşykly bolşy ýaly: özara bagly, ýöne dürli düzgünlere tabyn. Birini beýlekisi bilen garyşdyrsaňyz, her ölçeg tehniki taýdan dogry bolsa-da, düşündiriş nädogry bolar.

Metilen gögi bu bulaşyklygyň döremegini ähtimal edýär, sebäbi ol ölçenýän ulgamyň işine gatnaşýar. Ol zynjyryň öňki böleklerinde elektronlary kabul edip, soňky böleklerinde berýän redoks aýlanyşyna gatnaşýan maddadyr, energiýaly mitohondriýalarda toplanýan lipofil kationdyr we giňden ulanylýan zondlar bilen şol bir spektral zolaklarda ýagtylygy siňdirýän hem-de şöhlelendirýän goýy gök birleşmedir. Ýeke-täk görkeziji bu wezipeleriň ählisini düşündirip bilmez. Budapeştde geçirilen mitohondrial barlaglaryň dowamynda görkezilen ygtybarly çemeleşme kislorod akymyny, ATP sinteziniň tizligini, membrana potensialyny we wodorod peroksidiniň bölünip çykmagyny bilelikde ölçemekden, her ädimde bolsa boýaga mahsus gözegçilik synaglaryny geçirmekden ybaratdyr.

Respirometriýa energiýa öndürilişini däl-de, kislorod akymyny ölçeýär

Oroboros Oxygraph ýa-da Seahorse öýjükden daşarky akym analizatory bilen geçirilýän ýokary çözgütli respirometriýa bir zady görkezýär: kislorodyň näçe çalt gaýtarylýandygyny. Ol her elektrona näçe protonyň geçirilendigini, gradiýentiň näçesiniň saklanandygyny ýa-da ATP sintazasynyň ony ulanandygyny görkezmeýär.

Adalgalar möhümdir. Bölünip alnan mitohondriýalarda ADP bolmazdan substratyň bolmagy proton syzmasy bilen bagly dem alşy, doýgunlaşdyryjy möçberdäki ADP bilen substratyň bolmagy oksidleýji fosforlaşma kuwwatyny, baglanyşygy üzýän maddanyň titrlenmegi bolsa iň ýokary elektron geçiriş kuwwatyny görkezýär. Bitewi öýjüklerde Seahorse bilen ölçenýän degişli görkezijiler bazal dem alyş, oligomisine duýgur ATP bilen baglanyşykly dem alyş, proton syzmasy, FCCP arkaly kesgitlenen iň ýokary dem alyş we rotenona hem-de antimisiniň täsirine durnukly mitohondrial däl kislorod sarp edilişidir. Seahorse netijelerini State 3 we State 4 diýip atlandyrmak, preparatyň üpjün edip bilmeýän takyklygyny oňa degişli etmekdir; muny Agilent Mito Stress Test çemeleşmesi aýdyň görkezýär.

Metilen gögi kislorodyň köpelmegi bilen energiýanyň köpelmeginiň arasyndaky adaty baglanyşygy bozýar. Bölünip alnan beýni mitohondriýalary baradaky barlaga görä, deňiz doňuzynyň beýnisinden bölünip alnan mitohondriýalarda 100 nM-den 1 uM-e çenli boýag glutamat bilen malat, suksinat we alfa-gliserofosfat substratlary bilen dynçlyk ýagdaýyndaky kislorod sarp edilişini ýokarlandyrdy; alfa-gliserofosfat bilen ýokarlanyş takmynan 64 göterim boldy. Muňa garamazdan, sagdyn mitohondriýalarda ADP bilen höweslendirilen dem alyş düýpli üýtgemedi. Syzma bilen bagly dem alyş ýokarlanyp, ADP bilen höweslendirilen akym üýtgemän galandygy sebäpli, hasaplanan dem alyş gözegçiligi gatnaşygy peselýär. Bu peseliş boýagyň mitohondriýalara zeper ýetirendigini aňlatmaýar. Ol boýagyň adaty dem alşyň üstüne kislorod sarp edýän redoks aýlawyny goşandygyny aňladýar. Diňe ýokarlanyşy habar berýän metilen gögüniň kislorod sarp ediş synagy hakyky himiki hadysany ölçäpdir, ýöne energiýanyň saklanyşy barada hiç zat aýtmandyr.

Dikeldiş tejribeleri şol bir tapawudy has uly möçberde görkezýär. Kompleks I böwetlenende, kislorod akymy takmynan üç esse dikeldi, ATP sintezi bolsa diňe takmynan 1.5 esse dikeldi. Elektroda has köp kislorod ýetdi. Emma onuň has az bölegi ATP öndürmäge hyzmat etdi. Oksidleýji fosforlaşmanyň gowulanandygy baradaky islendik tassyklama ATP tarapynyň maglumatlaryny hem talap edýär; iň gowusy, bu maglumatlar maýdalawjyda ulanylan kesgitleme görkezilip, ATP-niň kisloroda gatnaşygy hökmünde aňladylmalydyr.

ATP synaglary sinteziň tizligini ölçeýär; ATP mukdary onuň ornuny tutup bilmez

ATP synagy başga soraga jogap berýär: wagt birliginde näçe ATP öndürilýär. Birnäçe minutyň dowamynda yzarlanylýan ýagtylyk tomzagynyň lýusiferazasynyň lýuminessensiýasy ýa-da 340 nm-de okalýan geksokinaza bilen glýukoza-6-fosfat degidrogenazanyň utgaşdyrylan synagy ýaly kinetiki ölçeg tizligi berýär. Jemi ATP-niň ýeke-täk ahyrky nokatda ölçenmegi bolsa mukdary berýär; bu mukdar sintezden sarp edilişiň aýrylmagyny görkezýär we özbaşyna oksidleýji fosforlaşma barada az maglumat berýär.

Budapeşt topary adenilat kinazanyň işjeňligini basyp, utgaşdyrylan ferment usulyny ulandy we 1-den 2 uM-e çenli metilen gögüniň rotenon we antimisin bilen işlenen mitohondriýalarda ATP öndürilişini az möçberde, ýöne statistik taýdan ähmiýetli derejede ýokarlandyrandygyny ýüze çykardy. Bu hakyky dikeldişdir, ýöne bölekleýin dikeldişdir. TEGDMA-nyň zäherliligi baradaky barlag başga modelde hem şol häsiýetli netijä geldi: 5 mM dişçilik monomeri TEGDMA Kompleks I bilen baglanyşykly dem alşy takmynan 286 akym birliginden 28-e çenli peseltdi, 2 uM boýag bolsa ony takmynan 86-a çenli dikeltdi.

Reňkli redoks birleşmesi bilen işlenende iki gözegçilik synagy hökmanydyr. Birinjisi, ölçenen ATP sinteziniň näçesiniň ATP sintazasyna baglydygyny kesgitlemek üçin oligomisin ulanyň. Ikinjisi, belli mukdardaky ATP-ni, doly reagent toplumyny we ulanylan boýag konsentrasiýalarynyň takyk özüni goşup, öýjüksiz şertlerde goşulan ATP-niň ölçegde näderejede gaýtadan tapylýandygyny barlaň; iň bolmanda 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM we 2 uM konsentrasiýalary ulanyň. Boýag çykýan ýagtylygy siňdirip, signal beriji fermenti bökdäp ýa-da reagentleriň redoks himiýasyny üýtgedip biler. Umumy lýusiferaza synaglary boýunça gollanma hut şu görnüşli päsgelçiligi ýüze çykarmak üçin biohimiki garşy barlaglary maslahat berýär. Ýagtylygyň öçürilmegi adatça has ýokary konsentrasiýalarda güýçli bolýar diýip, 1 uM-de ölçeg ýoýulmasynyň ýokdugyny çaklamaň.

Membrana potensialynyň zondlary akymy däl-de, boýagyň paýlanyşyny ölçeýär

Safranin O, TMRM we TMRE, rodamin 123 hem-de JC-1 membranadan geçip bilýän kationlardyr. Olar elektrohimiki deňagramlyga laýyklykda otrisatel zarýadly matriksde toplanýarlar; şonuň üçin umumy fluoressensiýa zondyň nirede ýerleşýändiginiň üsti bilen potensialy gytaklaýyn görkezýär. Olaryň hiç biri ATP-ni ýa-da elektron akymyny ölçemeýär.

Her zondyň has laýyk gelýän preparat görnüşi bar. Safranin O bölünip alnan mitohondriýalar we membranasy geçirijilikli edilen öýjükler üçin laýykdyr. Adatça takmynan 2 uM konsentrasiýada, takmynan 495 nm oýandyryş we takmynan 585 nm şöhlelenme tolkun uzynlyklary bilen ulanylýar; ol toplanmagyň umumy fluoressensiýany üýtgedýän öçürilme re režiminde işleýär. TMRM we TMRE bitewi öýjükler üçin pes nanomolýar ýüklenişde, öçürilme bolmaýan režimde laýykdyr; bu ýagdaýda depolýarlaşma boýagy boşadýar we mitohondrial fluoressensiýa peselýär. Ýokary ýüklenişde bolsa signalyň ugry öz-özünden öçürilme sebäpli tersine öwrülip biler. JC-1 amatly ýaşyl-gyzyl gatnaşygy berýär, ýöne ol ýüklenişe we mitohondrial massa baglydyr; şonuň üçin mukdar taýdan ölçemekde ol gowy gözegçilik edilýän TMRM-den gowşakdyr. Bu artykmaçlyklar we çäklendirmeler giňden ulanylýan mitohondrial membrana potensialynyň zondlaryna syn makalasynda jemlenýär.

Metilen gögi hut iş konsentrasiýalarynda optiki päsgelçilik döredýär. Onuň takmynan 600-den 665 nm-e çenli siňdiriş zolaklary gyzyl zondlaryň şöhlelenmesi bilen gabat gelýär; şonuň üçin içki süzgüç täsirleri, ýagtylygyň öçürilmegi we oýandyryjy ýagtylygyň siňdirilmegi mümkin hadysalardyr. Boýagyň özi hem paýlanyşy ölçenýän potensiala görä üýtgeýän ikinji lipofil kationdyr. Munuň öňüni almak üçin goşmaça garaşsyz ölçegler we boş nusgalar gerek: diňe zond, diňe boýag, zond bilen boýagyň her konsentrasiýasy, nol salgylanmasy hökmünde FCCP bilen doly depolýarlaşma we, mümkin bolsa, optiki taýdan tapawutly ikinji zond. Kompleks III-den aýlanyp geçiş baradaky barlag antimisin we miksotiazol bilen böwetlenmeden soň membrana potensialynyň dikelişini safranin O hem-de TMRM bilen gaýtalap, hil taýdan şol bir dikelişi almak arkaly şeýle görelde döretdi. Bir optiki signal beriji diňe alamatdyr. Iki garaşsyz signal beriji bolsa subutnamadyr.

Üç preparat, üç dürli sorag

Bölünip alnan mitohondriýalar, membranasy geçirijilikli edilen öýjükler we bitewi öýjükler bir synagyň biri-biriniň ýerine ulanylyp bilinýän duýgurlyk sazlamalary däldir. Olar dürli iş ýörelgelerine eýe bolan aýry düşünjelerdir.

Bölünip alnan mitohondriýalar elektron transport zynjyryny, içki membranany we matriksiň iş ulgamyny saklaýar, emma plazma membranasyny, sitozoly we tor gurluşyny aýyrýar. Şol aýyrmak esasy maksatdyr: substratlar, ADP, inhibitorlar we boýag konsentrasiýalary takyk kesgitlenýär, şonuň üçin degişli ýoly anyklap bolýar. Munuň bahasy tebigy substrat üpjünçiliginiň, signal geçirişiniň we energiýa talabynyň ýitirilmegidir.

Membranasy geçirijilikli edilen öýjükler mitohondriýalary öýjük gurluşynyň köp böleginiň içinde saklaýar, şol bir wagtda daşardan berlen substratlaryň we ADP-niň açylan plazma membranasyndan geçmegine mümkinçilik berýär. Olar öýjük gurşawynda substrat ýoly bilen bagly kemçiligi anyklamak üçin dogry guraldyr. Artykmaç geçirijilik daşky membrana zeper ýetirýär, sitozoldaky sazlaýjy komponentler bolsa ýuwlup aýrylýar.

Bitewi öýjükler ähli zady saklaýar: plazma membranasynyň päsgelçiligini, sitozoldaky gaýtaryjy maddalary, endogen substrat transportyny, mitohondrial tory we ATP-e bolan talaby. Olar fiziologiýa iň ýakyn, mehanizmi aýratyn seljermekden bolsa iň uzak şertdir, sebäbi boýagyň öýjüge girmegi, gaýtarylmagy we aýratyn bölümlerde saklanmagy onuň mitohondriýalara täsir edýän hakyky möçberini kesgitleýär.

TEGDMA barlagy üç derejäni hem maksatly ulandy: oksidlenmäniň we potensialyň boýag bilen dikeldilmegini barlamak üçin beýniden bölünip alnan mitohondriýalar, bozulmanyň esasan Kompleks I bilen baglanyşykly substrat oksidlenmesindedigini anyklamak üçin membranasy geçirijilikli edilen diş pulpasynyň sütün öýjükleri we peseldilen kislorod sarp edilişine 2 uM boýagyň fiziologik jemleýji täsirini barlamak üçin bitewi sütün öýjükleri. Dürli preparatlaryň mitohondrial görkezijilerini deňeşdirýän okyjylar üçin metilen gögüniň elektronlary dem alyş zynjyryndan nähili geçirýändigi baradaky ýoldaş düşündiriş makalasy degişli ýollar barada maglumat berýär, metilen gögüniň dem alyş barlaglaryny okamak boýunça gollanma bolsa konsentrasiýa we inhibitor saýlawynyň mantygyny düşündirýär.

Redoks taýdan işjeň boýagyň talap edýän gözegçilik synaglary

Redoks aýlanyşyna gatnaşýan madda adaty inhibitordan has giň gözegçilik sanawyny talap edýär, sebäbi diňe boýagyň himiki täsirleri biologik hadysa meňzäp biler.

Respirometriýa üçin ölçeg süýşmesini barlamak maksady bilen diňe buferli kamera, biologik materialsyz bufer bilen boýagly kamera, synagda bar bolan islendik öýjükden daşarky gaýtaryjy madda bilen boýag we bitewi öýjüklerde mitohondrial däl kislorod sarp edilişini kesgitlemek üçin synagyň ahyrynda rotenon bilen antimisin ulanyň. Gaýtarylan boýagyň elektronlary kisloroda geçirip, wodorod peroksidini emele getirmek arkaly täzeden oksidlenýändigini ýatda saklaň. Şonuň üçin elektron donory bolmadyk diňe boýagly boş nusga NADH ýa-da NADPH elýeterli bolanda ýüze çykýan öýjüksiz kislorod sarp edilişini pes görkezýär.

Wodorod peroksidi üçin saýlaýjy däl DCFDA boýaglarynyň ýerine kalibrlenen Amplex UltraRed bilen hren peroksidazasyny ileri tutuň, katalaza bilen tassyklaň we ýagtylyga baglylygy barlaň, sebäbi boýag fotosensibilizatordyr. Beýni mitohondriýalarynyň barlagynda bary-ýogy 100 nM boýagda peroksid ýüküniň dört esseden hem köp ýokarlanandygy, onuň aýrylmagynyň bolsa haýallandygy ýüze çykaryldy; peroksid superoksid aralyk önümi bolmazdan, göni gaýtarylan boýag arkaly emele geldi. Zond saýlawynyň we ýagtylyk gözegçiliginiň jikme-jiklikleri boýag tejribelerinde kislorodyň reaktiw görnüşlerini ölçemek baradaky ýoldaş makalada berilýär. Peroksidiň haçan signal, haçan bolsa ýük hökmünde çykyş edýändigi baradaky has giň sorag öýjük redoks deňagramlylygy we antioksidant baradaky tassyklamalar bilen bilelikde ara alnyp maslahatlaşylýar.

Ýol baradaky tassyklamalar üçin Kompleks III-niň iki inhibitor ýerini hem barlaň: Qi ýerinde antimisin A, Qo ýerinde miksotiazol, şeýle hem sianid bilen Kompleks IV derejesindäki ahyrky böwetlenmäni. Syçanyň beýnisi bilen geçirilen öňki barlag boýagyň rotenon bilen böwetlenen dem alşy dikeldendigini, ýöne antimisin bilen böwetlenen dem alşy dikeltmändigini habar berdi. Soňky üç görnüşli barlag bolsa iki inhibitor bilen hem bölekleýin dikelişi we sitohrom c-niň göni gaýtarylýandygyny görkezýän subutnamalary tapdy. Aýlanyp geçişi gutarnykly kesgitlenen ýol hökmünde däl-de, täze maglumatlara laýyk gelýän mümkinçilik hökmünde kabul ediň, sebäbi boýagyň konsentrasiýasy, inhibitoryň täsir edýän ýeri, substratyň ýagdaýy we boýagyň paýlanyşy syn edilýän ýoly üýtgedýär.

Synag saýlaw matrisasy

Bu tablisany soraga görä ölçeg saýlamak üçin ulanyň, ölçegden ugur alyp sorag saýlamak üçin däl.

Iň az derejede ynandyryjy tassyklama üçin şol bir boýag konsentrasiýalaryny — 100 nM, 300 nM, 1 uM we 2 uM — syzma, ADP, oligomisin we baglanyşygy üzýän madda şertlerinde kislorod akymynyň, ATP sinteziniň tizliginiň, mümkin bolsa iki zond bilen membrana potensialynyň, şeýle hem katalaza we öýjüksiz gözegçilik synaglary bilen kalibrlenen peroksid bölünip çykmasynyň ölçeglerinde ulanmaly. Özara bagly toplumy habar beriň: kislorod akymy, ATP tizligi, ATP-niň kisloroda gatnaşygy, potensial we peroksid. Şol sanlaryň islendik biri ýekelikde diňe manysy entek kesgitlenmeli ölçegdir.