Metilen gögi bilen hamyrmaýa synaglary: janly öýjükleri sanamak we dem alyş wagtyny ölçemek

Iş stolunda iki probirka dur. Ikisi-de gök. Birinde mikroskop astyndaky gök öýjükler hamyrmaýanyň ölendigini aňladýar. Beýlekisinde bolsa probirkanyň gökden reňksize öwrülmegi hamyrmaýanyň janlydygyny we dem alýandygyny aňladýar. Boýag şol bir, netijeleriň manysy bolsa ters. Bu iki synagy garyşdyrsaňyz, ähli netijeleriň manysy tersine öwrüler.

Makalanyň esasy maksady şu tapawudy düşündirmekdir. Metilen gögi oksidlenme-gaýtarylma boýagydyr: oksidlenen ýagdaýynda gök, gaýtarylan ýagdaýynda bolsa reňksiz leýkometilen gögi bolýar. Ýaşaýşa ukyply öýjükleri sanamak bu himiki häsiýeti gysga wagtlyk mikroskopik synlamada ulanýar. Dem alyş tejribesi bolsa ony tutuş garyndyda wagty ölçenýän reaksiýada ulanýar. Her birine aýratyn protokol, aýratyn gözegçilik nusgalary we netijelerine aýratyn tankydy çemeleşme gerek.

Ýaşaýşa ukyply öýjükleri sanamak: gysga wagtlyk reňkläň, haýal etmän baha beriň

Piwo önümçiliginde ulanylýan protokol iň standartlaşdyrylan görnüşdir. 2% natriý sitratynda 0.01% w/v metilen gögi taýýarlaň, ony hamyrmaýa suspenziýasy bilen 1:1 gatnaşykda garyşdyryň we gysga, öňünden kesgitlenen wagt aralygyndan soň garyndyny gözden geçiriň. Neşir edilen wagt aralyklary Brewing Science Institute gollanmasynda 1-den 2 minuda çenli, ylmy barlag protokollarynda bolsa takmynan 5 minut bolup, OIV-niň çakyr mikrobiologiýasy usuly gözden geçirmegiň 10 minudyň içinde geçirilmegini talap edýär. Sanalýan garyndydaky boýagyň konsentrasiýasy takmynan 0.005% bolýar. Kämilleşdirilen Neubauer kamerasyny dolduryň we takmynan 400x ulaltmada goýy gök öýjükleri ýaşaýşa ukypsyz, reňklenmedik öýjükleri bolsa ýaşaýşa ukyply diýip toparlara bölüň. OIV usulynda açyk gök öýjükler janly hasaplanýar; bu aşakda ara alnyp maslahatlaşylýan subýektiwlik meselesine eýýäm yşarat edýär.

Öýjükleriň konsentrasiýasy kameranyň geometriýasyndan hasaplanýar. Merkezi 1 mm inedördül meýdan dolulygyna sanalanda, ASBC-niň hamyrmaýa usullarynda görkezilişi ýaly, her mL-däki öýjük sany N-i suwuklandyrma koeffisiýentine we 10^4-e köpeltmek bilen tapylýar; bu ýerde N şol meýdanda sanalan öýjükleriň sanydyr. Ýaşaýşa ukyplylyk has ýönekeý hasaplanýar: reňklenmedik öýjükleriň sanyny ähli öýjükleriň sanyna bölüp, 100-e köpeldiň. FEMS-niň piwo önümçiligindäki deňeşdirme barlagyna we OIV tejribesine eýerip, ýaşaýşa ukyplylygy bahalandyrmak üçin takmynan 400 öýjük sanaň. Bir araçäk düzgünini yzygiderli ulanyň, mysal üçin, toruň aşaky we çep çyzyklaryndaky öýjükleri goşup, ýokarky we sag çyzyklaryndakylary hasaba almaň.

Sanamaga başlamazdan öň pyntyklar üçin düzgün gerek. Giňden ulanylýan düzgüne görä, pyntyk ene öýjügiň ululygynyň takmynan ýarysyna ýetende aýratyn öýjük hökmünde, ondan kiçi bolsa ene öýjük bilen bile sanalýar. Haýsy düzgün saýlansa-da, ony her inedördül meýdanda ulanyň we indiki adam hem şol düzgüni gaýtalap biler ýaly, iş sahypasyna ýazyň.

Sanaw iş sahypasy (muny çap ediň)

Bu iş sahypasy şu makala üçin ýörite taýýarlanyldy. Ony depdere göçüriň ýa-da her nusga üçin birini çap ediň.

Viability (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue). Total cells per mL = N x dilution factor x 10^4, bu ýerde N kameranyň kesgitlenen meýdanyndan alynýar. Reňkleme wagtyny netijäniň ýanynda ýazyň, sebäbi wagt görkezilmedik ýaşaýşa ukyplylyk sanyny gaýtadan almak mümkin däl.

Ýaşaýşa ukyplylyk görkezijileri näme üçin üýtgeýär

Ilkinji päsgelçilik wagt bolup, ol iki tarapa-da täsir edýär. Metabolik taýdan işjeň öýjükler boýagy gaýtarýar, şonuň üçin ir baha berlende janly öýjükler boýagy doly gaýtaryp ýetişmän biler we ýalňyşlyk bilen öli diýlip hasaplanar. Emma uzak wagtlap täsir etmek hem öz-özünden zäherli bolup, hakykatdan zeper ýeten gök öýjükleri döredýär we ölüm barada ýalňyş reňkleme netijesini berýär. Şonuň üçin laboratoriýa okuw protokoly, Wisconsin hamyrmaýa okuw protokolynda görkezilişi ýaly, 5 minudyň içinde baha bermegi talap edýär. Ygtybarly çemeleşme şudur: metilen gögi bilen baha bermek wagta baglydyr, şonuň üçin bir gysga wagt aralygyny kesgitläň we tapgyrdaky her nusga üçin ony üýtgetmän saklaň.

Ýaşaýşa ukyplylygy pes nusgalarda ikinji ýoýulma ýüze çykýar. Standartlaşdyrylan usul ýaşaýşa ukyplylyk takmynan 80%-den pes bolanda, metilen gögi onuň hakyky derejesini artyk görkezip bilýändigini duýdurýar, sebäbi boýagy henizem gaýtarýan öýjükleriň köpelmek ukyby saklanan bolmagy hökman däldir. Piwo önümçiligi baradaky edebiýatda ýaşaýşa ukyplylyk ep-esli peselende şol bir ygtybarsyzlyk beýan edilýär. Metilen gögüne çalt we takmynan baha berýän serişde hökmünde garaň; ösdürimi täzeden hamyrmaýa hökmünde ulanmak ýaly ýaşaýşa ukyplylygyň pes derejesine degişli möhüm kararlary bolsa iýmit gurşawly tabaklarda sanamak ýa-da goşmaça boýag arkaly tassyklaň.

Üçünji ýerde nusga gurşawynyň täsirleri durýar. OIV usuly takmynan pH 4.6-da geçirilýär we güýçli buferlenen, pes pH-ly nusgalaryň boýagyň dogry hereketine päsgel berýändigini duýdurýar. Şeýle hem şeker 100 g/L-den ýokary bolanda bu synagy ulanmazlygy maslahat berýär, sebäbi şeýle şertlerde öýjükler ýalňyş netijä getirýän açyk gök reňkde görünýär. Reňkleme pH-synyň tejribe arkaly deňeşdirilmegi barlanan aralykda duýgurlygyň ep-esli üýtgeýändigini görkezdi; bu metilen gögi usulynyň pH-a baglylygy baradaky barlag bilen gabat gelýär. Galyndy bölejikleri aýratyn duzakdyr: arassa däl şire garyndylaryndaky reňklenen bölejikler öli öýjüklere meňzeýär we dürli işgärleriň netijeleriniň arasyndaky üýtgeýjiligi artdyrýar.

Bu üýtgeýjilik diňe aýry-aýry synlamalar bilen däl, san taýdan hem ölçenendir. FEMS-niň hamyrmaýa deňeşdirmesinde beýan edilen alty aýlyk piwo önümçiligi synagynda metilen gögi bilen gaýtalanyp geçirilen ölçegleriň ortaça standart gyşarmasy 6.1% bolupdyr; oksonol bilen akym sitometriýasynda bolsa bu görkeziji 0.2% bolupdyr. Iki işgäriň şol bir nusga üçin beren netijeleri 13 göterim punkta çenli tapawutlanypdyr. Ýaşaýşa ukyplylygy kesgitleýän usullaryň 2023-nji ýyldaky mukdar taýdan deňeşdirmesi flýuoressensiýa mikroskopiýasynyň we akym sitometriýasynyň ep-esli has takykdygyny ýüze çykardy, şol bir wagtda usulyň netijeliliginiň görnüşe we nusga gurşawyna baglydygyny görkezdi. Painting we Kirsop (PMID 24430080) tarapyndan berlen nusgawy usul beýany esasy salgylanma bolup galýar. Has giňişleýin hamyrmaýanyň ýaşaýşa ukyplylygyny we fiziologik işjeňligini barlaýan synaglaryň syny (PMID 25154541) bolsa metilen gögüni gutarnykly däl-de, biri-birini doldurýan synaglaryň hataryna goşýar. Tripan gögi bu ýerde öz-özünden has gowy çalyşma däldir: ol membrananyň bitewüliginiň ýitendigini görkezýär, metilen gögi bolsa öýjüge siňmegi we gaýtaryjy işjeňligi görkezýär. Şonuň üçin stresdäki öýjükler bu iki boýag bilen dürli toparlara degişli edilip bilner.

Dem alyş tejribesi: gök reňkiň ýitmegine çenli wagty ölçäň

Ikinji synagda mikroskop asla ulanylmaýar. Hamyrmaýa, glýukoza we suwuklandyrylan metilen gögi ýapyk probirka salynýar; gök reňkiň ýitmegine näçe wagt gerekdigini sagat ölçeýär. Öýjükler metabolizmi amala aşyranda gök boýagy reňksiz görnüşine öwürýän gaýtaryjy ekwiwalentleri öndürýär, erän kislorod bolsa ony gaýtadan oksidleýär. Öýjükler kislorodyň mukdaryny peseldeninden soň gaýtarylma agdyklyk edýär we probirka reňksizlenýär. Şonuň üçin ahyrky nokat dem alşyň, boýagyň konsentrasiýasynyň we kislorodyň elýeterliliginiň arasyndaky deňagramlylygy görkezýär. Netije molekulýar kislorodyň sarp edilişiniň göni tizligi hökmünde däl-de, metilen gögüniň gaýtarylma ýa-da reňksizlenme wagty hökmünde berilmelidir.

Wagt amatly aralyga düşer ýaly, ýaşaýşa ukyplylyk synagyndakydan has suwuk boýag ulanyň. AQA A derejesiniň hökmany amaly iş gollanmasy muny gowy standartlaşdyrýar: takmynan 30 C-e çenli gyzdyrylan 100 mL suwa 1 g glýukoza goşulýar, ulanmagyň edil öň ýanynda 5 g guradylan hamyrmaýa goşulýar we 1% başlangyç erginiň 0.1 mL-sini 100 mL-e çenli suwuklandyrmak arkaly takmynan 0.001% işçi boýag ergini taýýarlanýar. Hamyrmaýa-glýukoza suspenziýasynyň 2 mL-sini işçi boýagyň 2 mL-si bilen garyşdyryň, synag temperaturasyna ýetýänçä garaşyň, bir gezek 10 sekund çaýkaň, wagt ölçeýjini işlediň we gaýtadan çaýkamaň. Çaýkamak kislorody täzeden girizýär we probirkany ýene gögerdýär; bu amal bilen bagly iň uly emeli täsirdir. AQA taýýarlanan garyndynyň adatça 35 C-de takmynan 5 minudyň içinde reňksizlenmelidigini belleýär; synaglarda ortaça wagt 20 C-de 275 s, 35 C-de 128 s we 45 C-de 145 s bolupdyr. Bular bir synag düzüminden alnan mysallar bolup, ähli şertler üçin umumy ölçegler däldir. Gözegçilik edilýän şertlerde gaýtarylma tizligi bilen metabolik taýdan işjeň hamyrmaýanyň arasyndaky mukdar baglanyşygy ýörite gaýtarylma barlaglary bilen tassyklanýar; olaryň arasynda PMID 25773544 belgisi bilen indekslenen iş we Yeast (2014) žurnalyndaky mehanizmi öwrenýän barlag bar.

Wagt boýunça üýtgeýşiň görkezmesi (ýörite taýýarlanan material)

Aşakdaky tablisa şu makala üçin ýokarda beýan edilen AQA görnüşli synag düzümine esaslanyp taýýarlanan görkezmedir: 2 mL hamyrmaýa-glýukoza garyndysy we takmynan 0.001% işçi boýagyň 2 mL-si, bir gezek 10 sekund çaýkamak, soňra bolsa gymyldatman inkubasiýa etmek. Ýazgylar talyplar toparynyň ýazga almaly görnüşindäki mysal netijelerdir; tizlik görkezijisi 1-i sekuntlarda ölçenen reňksizlenme wagtyna bölmek hökmünde kesgitlenýär. Şol bir probirkalar bilen synagy geçiriň we bu ýazgylary ölçenen bahalar bilen çalşyryň.

A, B we C probirkalar üçin tizlik görkezijisiniň temperatura baglylygynyň grafigini çyzyň. Egri çyzyk ilki ýokarlanýar, soňra tekizleşýär ýa-da aşak düşýär; bu göni çyzyk däl-de, fermentleriň täsirine mahsus garaşylýan görnüşdir. D, E we F probirkalar şol egri çyzykdaky maglumat nokatlary däldir. Olar egri çyzygy düşündirmäge mümkinçilik berýän gözegçilik nusgalarydyr.

Her synagy manyly edýän gözegçilik nusgalary

Her dem alyş synagyna üç goşmaça nusga gerek. Gaýnadylan ýa-da öldürilen hamyrmaýa, glýukoza we boýag garyndysy gök bolmagynda galmalydyr; bu çalt gaýtarylmanyň janly metabolizme baglydygyny subut edýär. Goşmaça glýukozasyz janly hamyrmaýa bilen boýag substrat gözegçilik nusgasydyr, ýöne hamyrmaýa içki ätiýaçlyklaryny sarp edýändigi üçin onda hem haýal reňksizlenmä garaşyň. Hamyrmaýasyz glýukoza bilen boýag himiki boş nusgadyr; ol zerurdyr, sebäbi aşgar şertindäki glýukoza hiç hili öýjük bolmasa-da metilen gögüni gaýtaryp bilýär.

Ýaşaýşa ukyply öýjükleri sanamak başga görnüşli gözegçiligi talap edýär: amallaryň üýtgewsizligi. Boýagyň şol bir başlangyç ergini, şol bir garyşdyrma gatnaşygy, şol bir reňkleme wagty, kameranyň şol bir meýdany, şol bir pyntyk we araçäk düzgünleri ulanylmalydyr; mümkin boldugyça nusganyň maglumatlaryny bilmezden sanalmalydyr. Iki işgäriň netijeleri on punkt tapawutlananda, iş sahypasy adatça sebäbini açyp görkezýär: dürli wagt, gök reňki kesgitlemegiň dürli çägi ýa-da dürli pyntyk düzgünleri. Reňklenen öýjükleri taýýarlamagyň we synlamagyň usullary bakteriýalary ýönekeý reňklemegiň usullary bilen baglanyşyklydyr. Boýagyň dürli nusgalarda nämäni görkezýändigine has giňişleýin syn bolsa mikroskopik reňkleme atlasynda berilýär. Gök reňkiň islendik intensiwligini mukdar taýdan okamagyň fiziki esaslary barada bolsa şertleri görkezilen siňdiriş salgylanmasy her bir koeffisiýentiň näme üçin öz eredijisi, pH-y we konsentrasiýa şertleri bilen bile berilmelidigini düşündirýär.

Synagy soraga görä saýlaň. Häzirki wagtda näçe öýjügiň janlydygy sanamak bilen baglanyşykly soragdyr; oňa mikroskop we iş sahypasy bilen jogap berilýär. Bu ösdürimiň näderejede işjeň dem alýandygy bolsa kinetiki soragdyr; oňa sekundomer we şertleri gözegçilikde saklanýan probirkalar bilen jogap berilýär. Metilen gögi ikisine-de hyzmat edýär, ýöne hiç haçan şol bir probirkada şol bir wagtda däl.