Makala
G6PD laboratoriýa synaglarynda metilen gögi: boýag aslynda näme edýär
Bir talyp inkubasiýadan soň iki probirka syn edýär. Olaryň biri garaşylýan reňke öwrülipdir. Beýlekisi bolsa öwrülmändir. Talyp ikinji näsagda glýukoza-6-fosfat dehidrogenaza ýetmezçiliginiň bardygy barada netijä gelýär. Bu netije dogry bolup biler, ýöne şeýle pikir ýöretmek synagyň işlemegini üpjün edýän düşünjäni gözden salýar. Probirkadaky hiç zat fermenti gönüden-göni ölçemeýär. Probirka metilen gögüni araçy hökmünde ulanyp, fermentiň öndürýän zadyny ölçeýär.
Bu gytaklaýyn baglanyşyk aýdyň bolansoň, amal, gözegçilik nusgalary we ýalňyş netijeleriň uzyn sanawy indi esassyz görünmeýär.
Gysga jogap
G6PD synagynda metilen gögi redoks indikatorydyr. G6PD fermenti NADPH öndürýär, NADPH-e bagly ulgamlar bolsa gök metilen gögüni onuň reňksiz leýko görnüşine gaýtarýar ýa-da ony elektronlary geçirmek üçin ulanýar. Fermentiň kadaly işjeňligi netijeli gaýtarylmagy üpjün edýär. Ýetmezçilikli işjeňlik bolsa haýal ýa-da doly däl gaýtarylma getirýär. Synagyň berýän alamaty şundan ybaratdyr.
Iki taryhy usul şol bir boýagy ulanýar, ýöne ahyrky görkezijileri tapawutlanýar. Olary biri-birinden aýry tutsaňyz, düşünişmezlikleriň köpüsi aradan aýrylýar.
Iki synag, bir boýag, dürli ahyrky görkezijiler
Birinjisi Sass we kärdeşleri tarapyndan beýan edilen, soňra Gibbs tarapyndan bahalandyrylan metilen gögüniň gönüden-göni gaýtarylma synagydyr. Bu ýerde ahyrky görkeziji boýagyň özüdür: okislenen gök metilen gögi reňksiz leýkometilen gögüne gaýtarylýar we bu üýtgeşmäniň tizligi NADPH öndürmek ukybyny görkezýär. Skrining baradaky ilkinji makala PubMed-de Sass we başg. (1966) ady bilen indekslenendir.
Ikinjisi Brewer-iň metgemoglobini gaýtarmak synagydyr. Natriý nitriti ilki gemoglobini goňur metgemoglobine okisleýär. Soňra metilen gögi elektron geçiriş araçysy bolup hyzmat edýär: gaýtarylan metilen gögi gaýtaryjy ekwiwalentleri metgemoglobine geçirip, ony ýene gyzyl gemoglobine öwürýär. Şonuň üçin görünýän ahyrky görkeziji gök bilen reňksiziň däl-de, goňur bilen gyzylyň arasyndaky tapawutdyr. Asyl usul Bütindünýä Saglygy Goraýyş Guramasynyň býulleteninde (Brewer we başg., 1960) çap edildi.
Brewer synagyny boýagy reňksizlendirmek synagy diýip atlandyrmak himiki taýdan takyk däldir. Boýag aýlawly üýtgeýär; reňkini üýtgedýän bolsa gemoglobindir. Aşakdaky çyzgy iki ýoly hem görkezýär.
Esasy reaksiýa
G6PD pentozofosfat ýolunyň ilkinji okislenme tapgyryny katalizleýär:
Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+
Luzzatto we kärdeşleriniň Blood žurnalyndaky syn makalasynda (2020) beýan edilişi ýaly, ýetişen eritrositler NADPH almak üçin bu ýola güýçli baglydyr. NADPH glutationy gaýtarylan ýagdaýda saklaýar we öýjügi okislenme zeperinden goraýar. Metilen gögi bu ulgama elektron kabul ediji hökmünde goşulýar. G6PD ýeterlik bolsa, NADPH hem ýeterlik bolýar, bu bolsa netijeli gaýtarylmagy üpjün edýär. G6PD pes bolanda, zynjyr ilkinji halkasynda üzülýär.
Boýagy hereketlendiriji däl-de, ýangyç derejesini görkeziji hökmünde göz öňüne getiriň. Ol NADPH üpjünçiligi barada maglumat berýär. Bu üpjünçiligi ýa-da ölçeg netijesini üýtgedýän başga islendik zat gende hiç hili üýtgeşme bolmazdan hem görkezijini üýtgedip biler.
Brewer görnüşli amal nähili geçirilýär
Reagentleriň düzümleri onýyllyklaryň dowamynda üýtgäpdir, şonuň üçin okuw maksatly beýany kliniki protokol hökmünde kabul etmeli däl. Her laboratoriýa özüniň barlanyp tassyklanan standart iş amalyna eýerýär. Şu duýduryşy göz öňünde tutup, nusgawy probirka usuly şu çap edilen ulanylyş beýanynda üç probirka we 3 sagatlyk inkubasiýa bilen görkezilişi ýaly, aşakdaky görnüşde işleýär:
- Näsagyň probirkasy: tutuş gan, glýukoza, natriý nitriti we metilen gögi. Nitrit metgemoglobin emele getirýär, glýukoza eritrositleriň madda çalşygyny üpjün edýär, boýag bolsa NADPH-e bagly elektron geçirişini üpjün edýär.
- Okislenen gözegçilik nusgasy: gan, nitrit we glýukoza, ýöne metilen gögi ýok. Ol ýetmezçilige mahsus bolan goňur metgemoglobin ahyrky görkezijisini görkezýär.
- Gemoglobin gözegçilik nusgasy: gan we suw. Ol kadaly ýagdaýa mahsus bolan gyzyl gemoglobin ahyrky görkezijisini görkezýär.
- Ähli probirkalary ýuwaş garyşdyryp, 37 C töwereginde, adatça 3 sagat inkubirläň.
- Öýjükleri dargatmak we reňkleri deňeşdirmegi aňsatlaşdyrmak üçin her probirkadan alnan kiçi alikwot bölegini distillirlenen suwda suwuklandyryň.
- Näsagyň probirkasyny iki gözegçilik nusgasy bilen deňeşdiriň. Reňkiň gyzyla gaýdyp gelmegi ep-esli gaýtaryjylyk ukybynyň bardygyny görkezýär. Goňurlygyna galmagy bolsa aýdyň ýetmezçiligi çak etdirýär.
Taryhy düzümleriň birinde takmynan 1 mL gan we konsentrasiýalary 180 mM natriý nitritine, 280 mM dekstroza hem-de 0.4 mM metilen gögüne golaý bolan reagentler ulanylypdyr. Bu sanlary ähli ýagdaý üçin hökmany talap däl-de, edebiýatdan alnan mysal hökmünde kabul ediň.
Netijäni düşündirmek
| Görnüş | Brewer synagyndaky görnüş | Manysy |
|---|---|---|
| Kadaly | Näsagyň probirkasynyň reňki gyzyl gemoglobin gözegçilik nusgasyna golaýlaşýar | Gaýtaryjylyk ukyby skriningiň çäginden ýokary |
| Ýetmezçilikli | Näsagyň probirkasy metgemoglobin gözegçilik nusgasyna golaý goňurlygyna galýar | Skrining aýdyň G6PD ýetmezçiligini çak etdirýär |
| Aralyk | Reňk iki gözegçilik nusgasynyň arasynda bolýar | Fenotipi kesgitlemäň; işjeňligi mukdar taýdan ölçäň |
G6PD-ni ýüze çykarmakdaky boşluklar barada Malaria Journal žurnalynyň şu syn makalasynda ara alnyp maslahatlaşylyşy ýaly, hil taýdan skrining kadaly işjeňligiň 30 bilen 40 göteriminiň töwereginde iň gowy tapawutlandyrýar. Şonuň üçin kadaly skrining netijesi synagyň agyr ýetmezçiligi ýüze çykarmandygyny aňladýar. Ol işjeňligiň doly kadalydygyny tassyklamaýar.
Skrining näme üçin ýalňyş düşünje döredýär
Gemolizden soňky retikulositoz ýalňyş kadaly netijäniň nusgawy sebäbidir. Ýaş eritrositlerde we retikulositlerde G6PD köne öýjüklerdäkiden köpdür. Ýiti gemolitik hadysanyň dowamynda iň köne, iň köp ýetmezçilikli öýjükler eýýäm dargan bolup biler. Şonda işjeňligi synagda kadaly görünýän ýaş öýjükler galýar. Şol bir biologik ýagdaý diňe boýagly skriningleri däl, mukdar taýdan synaglary hem ýalňyş netije bermäge getirýär.
Ýakynda geçirilen gan goýberme ýetmezçiligi gizleýär, sebäbi donoryň eritrositleri nusga öz fermentini goşýar. Mayo Clinic Laboratories gan goýbermäni retikulositoz we leýkositleriň päsgel bermegi bilen bir hatarda ferment boýunça ygtybarsyz netijeleriň sebäpleriniň arasynda görkezýär.
Geterozigot aýallar iň kyn ýagdaýdyr. X hromosomanyň tötänleýin işjeňsizleşmegi kadaly we ýetmezçilikli eritrositleriň garyndysyny döredýär, umumy işjeňlik bolsa agyr ýetmezçilikden daşyndan kadaly görünýän derejä çenli islendik aralykda bolup biler. Hil taýdan skriningler aralyk fenotipleri köplenç ýüze çykarmaýar. BSGG-niň G6PD synagy baradaky resminamasy bu çäklendirmäni jikme-jik ara alyp maslahatlaşýar.
Nusganyň alnanyndan bäri geçen wagt, saklanyş temperaturasy, görünýän ahyrky görkezijä baha bermegiň subýektiwligi, gematokrit we reagentleriň hili bu biologik täsirleriň üstüne analitiki näbellilik goşýar.
Skrining diagnoz däldir
Ýetmezçilikli, aralyk ýa-da kliniki ýagdaý bilen gabat gelmeýän skrining netijesi G6PD fermentiniň mukdar taýdan synagyny talap edýär. BSGG temperatura gözegçilik edilýän mukdar spektrofotometriýasyny salgylanma usuly hökmünde kabul edýär. Bu synagda eritrosit gemolizatyna glýukoza-6-fosfat we NADP+ goşulýar, emele gelen NADPH bolsa 340 nm tolkun uzynlygynda absorbansiýanyň ýokarlanmagy arkaly yzarlanýar. Üýtgeşmäniň tizligi ferment işjeňligine proporsionaldyr we adatça gemoglobine görä, her gram üçin birliklerde aňladylýar. Häzirki kliniki-laboratoriýa tejribesi Mayo synag katalogynyň G6PD işjeňligi baradaky ýazgysynda jemlenýär.
Netijäni düşündirmekde laboratoriýanyň barlap tassyklan salgylanma aralygy ulanylýar. Ol köplenç ilatyň kadaly işjeňligine görä kesgitlenýär; ýetmezçilik adatça 30 göterim çäginiň golaýynda, aralyk işjeňlik bolsa ondan ýokarda ara alnyp maslahatlaşylýar. BSGG-niň G6PD synaglary üçin maksatly önüm profilleri (2022) şol anyklaýyş çarçuwasyny beýan edýär. Ýakynda bolan gemoliz ýa-da gan goýberme fenotipi kesgitlemegi ygtybarsyz etse, eritrositleriň düzümi gaýtadan deňagramlylaşandan soň synagy gaýtalaň. Molekulýar synag bolsa ferment ölçeginiň ornuny tutmazdan goşmaça maglumat berip biler.
Saklamaga mynasyp tapawut
Bu synaglarda metilen gögi ex vivo laboratoriýa reagentidir. Bu ýagdaý metilen gögüni näsaga bermegiň howpsuzlygy baradaky mesele bilen bir zat däldir; şol mesele metilen gögüniň garşy görkezmeleri baradaky gollanmada beýan edilýär. Biohimiýa olary baglanyşdyrýar, sebäbi derman hem NADPH-e bagly gaýtarylma mätäçdir. Emma probirkadaky boýag gan akymyndaky doza däldir. Boýagyň başga şertlerde reňkleýji hökmünde özüni nähili alyp barýandygy barada düşünje almak üçin metilen gögi bilen reňklemegiň ýörelgelerine, onuň degişli himiki topary barada bolsa laboratoriýadaky redoks boýaglaryna serediň.
Skrining gaýtaryjylyk ukybynyň saklanan ýaly görünýändigini soraýar. Tassyklaýjy synag bolsa fermentiň hakykatda näçeräk bardygyny soraýar. Hiç kim boýagdan ikinji soraga jogap bermegini talap etmese, ol birinji soraga gowy hyzmat edýär.