ዓንቀጽ
ኣማራጺታት methylene blue ንማይክሮስኮፒ፦ ብዕማም ምረጽ
ንቐሊል ስሚር ባክቴርያ፣ ዕላማኻ ቅርጺ ዋህዮ ምርኣይ እንተኾይኑ ክሪስታል ቫዮለት ንmethylene blue ክትክኦ ይኽእል። ንህያዋን ዋህዮታት ግን ዝሓሸ ኣማራጺ ፈጺሙ ቀለም ዘይብሉ phase contrast ክኸውን ይኽእል። ምርጫኻ ኣብቲ ክትገብሮ እትደሊ ትዕዝብቲ ይምርኮስ።
ክልተ ሰባት ነቲ ሓደ ባህሊ ባክቴርያ ይምርምሩ ኣለዉ ንበል። ሓደ ካብኦም ቅርጺ በትሪ ዘለዎም ዋህዮታት ካብ ክቡባት ዋህዮታት ክፈሊ ይደሊ። እቲ ካልኣይ ድማ ሓደ ሕክምናዊ ኣተሓሕዛ ነቶም ባክቴርያ ቀቲልዎም ድዩ ክፈልጥ ይደሊ። ንቐዳማይ ሰብ ንጹር ምስሊ ዝህብ ቀለም፣ ንኻልኣይ ሰብ ዝጥቀመሉ መልሲ ከይህቦ ይኽእል።
ተካኢ ቅድሚ ምምራጽካ፣ ነዚ ሓረግ ዛዝሞ፦ “ኣብ ___ ውሽጢ ___ ክዕዘብ ኣለኒ፣ እቶም ዋህዮታት ድማ ብህይወት ክቕጽሉ / ክቕጽሉ ኣየድልዮምን።” እዚ ሓረግ እቲ ቀለም ክፍጽሞ ዘለዎ ዕማም ይውስን።
ካብ ናሙናን ሕቶን ጀምር
ቀዳማይ ዋህዮታት ብህይወት ክቕጽሉ ከም ዘለዎም ወይ ከም ዘየድል ወስን፣ ድሕሪኡ ክትዕዘቦ እትደሊ ባህሪ ፍለጥ፦
- ዋህዮታት ብህይወት ክቕጽሉ ኣለዎም፦ ንምንቅስቓስ ወይ ቅርጺ፣ ቀለም ዘይብሉ phase contrast ወይ DIC ኣስተውዕል፤ ንኒውክሌሳዊ DNA፣ Hoechst 33342 ምስ fluorescence ኣስተውዕል፤ ንምሉእነት ሽፋን ዋህዮ፣ ከም SYTO 9 ምስ propidium iodide ዝኣመሰለ ዝተረጋገጸ ፈተና ምረጽ።
- ዋህዮታት ብህይወት ክቕጽሉ ኣየድልዮምን፦ ንቅርጻዊ ባህሪ ባክቴርያ፣ ቀሊል ቀለም ክሪስታል ቫዮለት ወይ ኒግሮሲን negative stain ኣስተውዕል፤ ንGram reaction፣ ምሉእ ዘዴ Gram-stain ተጠቐም፤ ንኒውክሌሳዊ DNA ኣብ ዝተወሰኑ ዋህዮታት፣ DAPI fluorescence ኣስተውዕል።
ድሩትነት ነፍሲ ወከፍ ጨንፈር ንምውድዳር ነዚ ሰንጠረዥ ተጠቐም። እዚኣቶም ምርጫታት ዘዴ እዮም፣ ኣብ ውሽጢ ድሮ ዘሎ ፕሮቶኮል ጥርሙዝ ብጥርሙዝ ንምትካእ ዝወሃብ መምርሒ ኣይኮኑን።
| ክትዕዘቦ እትደሊ ነገር | ናሙናን መሳርሕን | ክኸውን ዝኽእል ኣማራጺ | ቀንዲ ድሩትነት |
|---|---|---|---|
| ቅርጽን ኣደላልዋን ባክቴርያ | ዝተዳለወ ስሚር ባክቴርያ፤ brightfield | ቀሊል ቀለም ክሪስታል ቫዮለት | ቅርጻዊ ባህሪ የርኢ፤ Gram reaction ወይ ህያውነት ኣየረጋግጽን። |
| ወሰናት ዋህዮ ኣብ ጸሊም ድሕረ ባይታ | ባክቴርዮሎጂካዊ ምድላው፤ brightfield | ኒግሮሲን negative stain | ምድላውን ፎርሙሌሽንን ኣገደስቲ እዮም፤ ዘይተቐብአ ዋህዮ ብግድን ህያው ማለት ኣይኮነን። |
| Gram reaction | ዝተዳለወ ስሚር ባክቴርያ፤ brightfield | ምሉእ ዘዴ Gram-stain | ምሉእ ተኸታታሊ ሬጀንትን መቆጻጸሪታትን የድሊ። |
| ምንቅስቓስ ወይ ለውጥታት ኣብ ህያዋን ዋህዮታት | ተሰማማዒ እርጥብ ምድላው፤ phase contrast ወይ DIC | ቀለም የለን | ተስማሚ ኦፕቲክስ የድሊ፤ contrast ንሓደ ሞለኪዩል ኣይፈልጥን። |
| ኒውክሌሳዊ DNA | ዝተወሰኑ ዋህዮታት፤ fluorescence | DAPI | ተሰማማዕቲ excitation እና emission filters የድልዩ። |
| ኒውክሌሳዊ DNA ኣብ ህያዋን ዋህዮታት | ህያዋን ዋህዮታት፤ fluorescence | Hoechst 33342 | ናብ ዋህዮ ምእታዉ ጥራይ፣ ኩነታት ምስሊ ምውሳድ ጉድኣት ከም ዘይብሉ ኣየረጋግጽን። |
| ምሉእነት ሽፋን ባክቴርያ | ዘይተወሰኑ ባክቴርያ፤ fluorescence | SYTO 9 ምስ propidium iodide | ምቕባእ ሽፋን ቀጥታዊ ዘይኮነ መለክዒ ህያውነት እዩ። |
ንቐሊል ስሚር፣ ነቲ ዘዴ ብጥንቃቐ ተክኦ
እቲ ዕማም ብሓደ ሕብሪ ቅርጻዊ ባህሪ ባክቴርያ ምርኣይ እንተኾይኑ፣ ክሪስታል ቫዮለት ተግባራዊ ኣማራጺ እዩ። Bacteriological Analytical Manual ናይ FDA ንቐሊል ምቕባእ ዝሰማምዑ ክልተ ፎርሙሌሽናት ክሪስታል ቫዮለት ይዝርዝር። ብሰነድ ዝተመዝገበ ፎርሙሌሽንን ናይ ምድላው ዘዴኡን ተጠቐም፤ ስም እቲ ቀለም ጥራይ ንስራሕ ዝተዳለወ ሬጀንት እንታይ ምዃኑ ኣይገልጽን።
ክሪስታል ቫዮለት ኣብ Gram staining እውን ይርከብ፣ እዚ ግን ቀሊል ቀለም ክሪስታል ቫዮለት Gram stain ይገብሮ ማለት ኣይኮነን። ኣብ ASM Gram-stain protocol፣ እቲ ፈላላዪ ውጽኢት ኣብ ክሪስታል ቫዮለት፣ ኣዮዲን፣ ምእላይ ቀለምን counterstainingን ብተኸታታሊ ምስርሖም ይምርኮስ። ነዞም ደረጃታት ምግዳፍ፣ እቲ ምስሊ እንታይ ከረጋግጽ ከም ዝኽእል ይቕይር። ነዚ ፍልልይ ንምርኣይ ቀሊል ምቕባእ ምስ Gram staining ርአ።
ኒግሮሲን ወሰናት ንምግላጽ ዝተፈልየ መገዲ ይህብ፦ እቲ ድሕረ ባይታ የጸልምት፣ ዋህዮታት ባክቴርያ ግን ብንጽጽር ቀለልቲ ይተርፉ። ኣብ መምርሒ ኒግሮሲን ናይ Merck ሓፈሻዊ ዝርዝር ተካእቲ ከይጠቐሶ ዝኽእል ጠቓሚ ዝርዝር ኣሎ። እቲ ዝተወሰነ ናይ ስራሕ ፎርሙሌሽኑ formaldehyde የካትት። ስለዚ፣ ዋላ እቶም ዋህዮታት ባዕሎም ዘይተቐብኡ እንተመሰሉ፣ ካብ ቃላት “negative stain” ጥራይ ምስ ህያዋን ዋህዮታት ከም ዝሰማማዕ ክትድምድም ኣይትኽእልን። ምሉእ ፎርሙሌሽንን ምድላው ናሙናን መርምር።
ንህያዋን ናሙናታት፣ ኦፕቲክስ ምቕያር ኣስተውዕል
ዋህዮታት ክንቀሳቐሱ ወይ ክከፋፈሉ ክትዕዘብ እንተደሊኻ፣ ካልእ ቀለም ምእታው ነቲ ትዕዝብቲ ከወሳስቦ ይኽእል። Nikon ኣብ መምርሒኡ ብዛዕባ contrast ኣብ ግሉጻት ናሙናታት ከም ዝገልጾ፣ phase contrastን differential interference contrast ወይ DICን ብፍልልያት ናይ ኦፕቲካዊ ባህርያቶም ንናሙናታት ክረኣዩ ይገብሩ። ማይክሮስኮፕ እቶም ዘድልዩ ኣካላት እንተሃልዮም፣ ህያዋን ዘይተቐብኡ ዋህዮታት ከርእዩ ይኽእሉ።
እዚ ምርጫ ዘይተቐብአ ምድላው ይዕቅብ፣ ግን ነቲ ዝርከብ ሓበሬታ ይቕይሮ። ነቲ contrast ኣየናይ ሞለኪዩል ከም ዘፍረዮ ከይፈለጥካ፣ ወሰን ወይ ምንቅስቓስ ክትከታተል ትኽእል። እቲ ሕቶ ቦታ ሞለኪዩል ምፍላጥ እንተኾይኑ፣ ኣብ ክንድኡ ተስማሚ ዘዴ labeling ምረጽ።
ንኒውክሌሳዊ DNA፣ Invitrogen ዘውጽኦ ምውድዳር DAPIን Hoechst stainsን፣ DAPI ምስ ዝተወሰኑ ዋህዮታት ብብዝሒ ከም ዝጥቀም ካብቲ ናብ ዋህዮ ብዝቐለለ ዝኣቱ Hoechst 33342 ይፈልዮ፤ Hoechst 33342 ንምልክት ህያዋን ዋህዮታት ዝያዳ ይመረጽ። ክልቲኦም fluorescence መሳርሒ የድልዮም። ዋላ ሓደ ካብኦም ንብሕብሪ ዝረአ brightfield stain ቀጥታዊ ተካኢ ኣይኮነን።
ምቅላዕ ንቀለምን ብርሃንን ከም ኩነታት ፈተነ ቁጸሮ። ባህሪ ዋህዮታት እትለክዖ እንተኾይኑ፣ ዝተቐብኡን ዘይተቐብኡን ምድላዋት ኣወዳድር።
ቀይሕ ዋህዮ ብኣውቶማቲክ ምዉት ዋህዮ ኣይኮነን
SYTO 9ን propidium iodideን ምሉእነት ሽፋን ባክቴርያ ንምግምጋም ብዙሕ ግዜ ብሓባር ይጥቀሙሎም። BacLight manual ምሉእ ሽፋን ምስ ቀጠልያ ምቕባእ፣ ዝተጎድአ ሽፋን ድማ ምስ ቀይሕ ምቕባእ የተኣሳስር። እዚ ትርጉም ንናሙና ምርግጋጽ የድልዮ።
ብRosenbergን ብመሳርሕቱን ኣብ 2019 ዝተኻየደ መጽናዕቲ ነቲ ጸገም የብርሆ። ኣብ 24-hour E. coli biofilms ኣብ ብርጭቆ ውሽጢ phosphate-buffered saline፣ ኣስታት 96% ናይ ዋህዮታት ኣብ ቦትኦም propidium-iodide-positive ኮይኖም ተራእዮም። እንተኾነ፣ ደረስቲ ድሕሪ ምእካቦም 82% ክዕብዩ ዝኽእሉ ምዃኖም ገሚቶም። Confocal images ኣብ ትሕቲ ቀይሕ ዝተቐብአ ንጥረ ነገር ቀጠልያ ውሽጣዊ ክፋል ዘለዎም ዋህዮታት ኣርእዮም፣ እዚ ድማ extracellular nucleic acids ኣብቲ ዘደናግር ምልክት ተራ ከም ዘለዎም ይሕብር።
እዞም ሚእታዊታት ኣብ ምድላዋት እቲ መጽናዕቲ ዝተገብሩ ዝተፈላለዩ መለክዒታት እዮም ዝገልጹ፣ ንኹሉ ዝሰርሕ ናይ መአረሚ መጠን ኣይኮኑን። ጠቓሚ ትምህርቲ፣ ነቲ ምልክት እንታይ ከም ዘፍረዮ ምርግጋጽ እዩ። ኣብ biofilm፣ ናይ nucleic-acid dye ኣብ ውሽጢ ዝተጎድኡ ዋህዮታት ጥራይ ዘይኮነ ኣብ ወጻኢ ዋህዮታት ዘሎ ንጥረ ነገር እውን ክፈልጥ ይኽእል። ንመደምደምታ ህያውነት፣ ተመራመርቲ ከም cultivation ወይ metabolic activity ዝኣመሰሉ ተወሰኽቲ መለክዒታት ይመኽሩ፣ ነፍሲ ወከፎም ድሩትነት ከም ዘለዎም ድማ ይገልጹ።
እቲ ኣማራጺ ብሓቂ እንታይ ከም ዝሓዘ ኣረጋግጽ
ኣማራጺ ዘዴ ምቕባእ ገና methylene blue ክሕዝ ይኽእል። Giemsa ኣብነት እዩ፦ Merck ፍርያቱ ከም azure-eosin-methylene-blue solution ይገልጾ፣ ንመዓላታት ከም ስሚር ደምን ዓጽሚ ሓንጎልን ዝተወሰነ እዩ። ንዝተፈልየ ናሙና ዝተፈልየ ዘዴ ክኸውን ይኽእል፣ ግን methylene blue ክወግድ ዝጠልብ ቅድመ ኩነት ኣየማልእን።
ሓደ ውህድ ምውጋድ ክፋል ናይቲ ፈተነ እንተኾይኑ፣ ምስልታት ቅድሚ ምውድዳርካ መንነት ሬጀንትን ፎርሙሌሽንን ኣረጋግጽ። እቲ methyl blue፣ methylene blue፣ ከምኡውን ተመሳሰልቲ ስም ዘለዎም ቀለማት ዝገልጽ መምርሒ ንፍልልያት ስያመ ይገልጽ።
ውጽኢቱ ቅድሚ ምጥቃምካ ነቲ ተካኢ ኣረጋግጽ
ንሓድሽ ዘዴ፣ ወከልቲ ናሙናታትን ተስማሚ መቆጻጸሪን ተጠቒምካ ንእሽቶ ምውድዳር ግበር። ኣብ ዝከኣለሉ መጠን ቅንብራት ማይክሮስኮፕ ክወዳደሩ ከም ዝኽእሉ ግበር። ፎርሙሌሽን ሬጀንት፣ ምድላው ናሙና፣ ምቅላዕን ኩነታት ምስሊ ምውሳድን መዝግብ፣ በዚ ድማ ዝሓሸ ዝመስል ምስሊ ብምርመራ ክግለጽ እምበር ጥራይ ክምረጽ ኣይኮነን።
ዓወት ምስቲ መበቆላዊ ሕቶ ኣወዳድሮ። ንቅርጻዊ ባህሪ፣ ወሰናትን ኣደላልዋን ዋህዮ ገና ብግቡእ ክትርጎሙ ይኽእሉ ድዮም ገምግም። ንኒውክሌሳዊ labeling፣ ቦታ ምልክትን ድሕረ ባይታን ገምግም። ንህያውነት፣ ካብ ዝማርኽ ፍልልይ ሕብሪ ንላዕሊ መርትዖ ጠልብ። እቲ ሰፊሕ መምርሒ methylene blue stainingን ናይ ላቦራቶሪ ኣጠቓቕማታትን ትዕዝብትን ምድላውን ከመይ ከም ዝተኣሳሰሩ ይገልጽ።
ነቲ ዘድልየካ መለክዒ ዝዕቅብ ኣማራጺ ምረጽ። ሕብሪ ካብ ባህርያት እቲ ዝውጽእ ምስሊ ሓደ ጥራይ እዩ።