นิวเมทิลีนบลูและการย้อมเรติคูโลไซต์: สีย้อมคนละชนิดกับวิธีที่ใช้เซลล์มีชีวิต

นักศึกษาคนหนึ่งเตรียมนับเรติคูโลไซต์ สั่งซื้อเมทิลีนบลู ผสมกับเลือด แล้วแทบไม่เห็นอะไรเลย เพื่อนร่วมชั้นใช้ขวดที่ติดฉลากว่านิวเมทิลีนบลู และเห็นเส้นใยสีน้ำเงินชัดเจนภายในเม็ดเลือดแดงบางส่วน นักศึกษาคนแรกจึงคิดว่าสีย้อมในขวดที่สองใหม่กว่าหรือเข้มข้นกว่า แต่ไม่ใช่ทั้งสองอย่าง ขวดนั้นมีโมเลกุลคนละชนิด

ความเข้าใจผิดเชิงแนวคิดนี้เป็นต้นเหตุของความสับสนส่วนใหญ่ในเรื่องนี้ ชื่อชวนให้คิดว่านิวเมทิลีนบลูเป็นเมทิลีนบลูรุ่นที่ปรับปรุงให้ดีขึ้น แต่ข้อเท็จจริงทางเคมีไม่ใช่เช่นนั้น นิวเมทิลีนบลู N เป็นสีย้อมฟีโนไทอะซีนอีกชนิดหนึ่ง ซึ่งมีหมายเลข Colour Index รูปแบบการแทนที่หมู่เคมี และบทบาทมาตรฐานทางโลหิตวิทยาของตนเอง เมื่อแยกความแตกต่างนี้ได้ชัดเจน รายละเอียดส่วนที่เหลือของวิธีนี้ก็เข้าใจได้ง่าย ไม่ว่าจะเป็นเหตุผลที่เซลล์ต้องยังมีชีวิตขณะย้อม เกณฑ์ที่ใช้ระบุว่าเซลล์ใดเป็นเรติคูโลไซต์ บทบาทของไฮนซ์บอดี และกรณีที่นำบริลเลียนต์ครีซิลบลูมาใช้

คำตอบโดยสรุป

นิวเมทิลีนบลู N ซึ่งเป็นน้ำยาที่ใช้ในงานโลหิตวิทยา โดยทั่วไปมีการระบุว่าเป็น Basic Blue 24 ในระเบียนนิวเมทิลีนบลูของ PubChem, C.I. 52030, CAS 1934-16-3 และมีสูตร C18H22ClN3S ส่วนเมทิลีนบลูทั่วไปคือ เมทิลไทโอนิเนียมคลอไรด์ หรือ Basic Blue 9 ตามระเบียนของ PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4 และมีสูตร C16H18ClN3S ในเชิงโครงสร้าง นิวเมทิลีนบลูมีหมู่เมทิลสองหมู่บนวงแหวนและหมู่เอทิลอะมิโนเป็นหมู่ข้าง ขณะที่เมทิลีนบลูมีหมู่ไดเมทิลอะมิโน ความแตกต่างนี้ทำให้พฤติกรรมการย้อมเปลี่ยนไป ตำราโลหิตวิทยาอธิบายว่าเมทิลีนบลูทั่วไปย้อมเรติคูโลไซต์ได้ค่อนข้างไม่ดี ส่วนนิวเมทิลีนบลูให้สีที่เข้มและสม่ำเสมอกว่า โดยมีสรุปการเปรียบเทียบนี้ไว้ใน หัวข้อนิวเมทิลีนบลูของ ScienceDirect

ใช่ นิวเมทิลีนบลูเป็นสีย้อมซูปราไวทัล การย้อมแบบซูปราไวทัลหมายถึงการย้อมเซลล์ที่ยังมีชีวิตหลังนำออกจากร่างกายและก่อนตรึงเซลล์ ตามนิยามใน บททบทวนหลักการย้อมแบบซูปราไวทัลของ NCBI ทั้งนิวเมทิลีนบลูและบริลเลียนต์ครีซิลบลูอยู่ในกลุ่มนี้ และมาตรฐานการตรวจเรติคูโลไซต์ของ CLSI ระบุนิวเมทิลีนบลูไว้อย่างชัดเจนว่าเป็นสีย้อมซูปราไวทัล บางครั้งนักศึกษาจัดวิธีนี้ไว้ในกลุ่มเดียวกับการย้อมแบบโรมานอฟสกีบนฟิล์มเลือดที่ตรึงแล้ว แต่กรอบความเข้าใจนั้นใช้กับวิธีนี้ไม่ได้ หากตรึงเซลล์ก่อน วิธีนี้จะไม่ทำงาน

สำหรับผู้อ่านที่กำลังทำความเข้าใจชื่อสีย้อมที่คล้ายกัน บทความ เมทิลบลูกับเมทิลีนบลู อธิบายความสับสนอีกเรื่องหนึ่งที่มีความแตกต่างมากกว่า นั่นคือระหว่างสีย้อมไตรแอริลมีเทนที่มีประจุลบกับกลุ่มฟีโนไทอะซีนที่มีประจุบวก บทความ ภาพรวมการย้อมในห้องปฏิบัติการ อธิบายตำแหน่งของงานย้อมแบบซูปราไวทัลเมื่อเทียบกับวิธีที่ใช้ฟิล์มตรึงแล้ว ส่วนคู่มือสัณฐานวิทยาของเซลล์เม็ดเลือดแสดงให้เห็นว่าการประเมินเรติคูโลไซต์อยู่ตรงไหนในภาพรวมของการจำแนกเซลล์เม็ดเลือด

ข้อควรระวังในการอ่านแค็ตตาล็อก: นิวเมทิลีนบลูยังมีรูปเกลือคู่กับซิงก์คลอไรด์อีกชนิดหนึ่ง ซึ่งใช้ CAS 6586-05-6 ดังนั้นส่วนวิธีการควรระบุรูปเกลือและผู้จำหน่าย ไม่ใช่เพียงชื่อสามัญ

การย้อมแบบซูปราไวทัลทำอะไรจริง ๆ

เรติคูโลไซต์คือเม็ดเลือดแดงระยะอ่อนที่สูญเสียนิวเคลียสไปแล้ว แต่ยังมี RNA ของไรโบโซมหลงเหลืออยู่ ในตัวอย่างเตรียมแบบเปียกที่ไม่ได้ย้อมสี จะมองไม่เห็น RNA นี้ สีย้อมซูปราไวทัลเข้าสู่เซลล์ที่ยังมีชีวิตและทำให้ RNA ตกตะกอนหรือรวมตัวเป็นเม็ดและเส้นใยสีน้ำเงิน ซึ่งเป็นวัสดุลักษณะร่างแหและเส้นใยที่เห็นเมื่อใช้เลนส์อิมเมอร์ชันน้ำมัน ดังนั้นร่างแหดังกล่าวจึงเป็นผลจากการย้อม ไม่ใช่โครงร่างที่มีอยู่เดิมและรอให้ติดสี นี่คือเหตุผลที่ตัวแปรของขั้นตอน ได้แก่ ความเข้มข้นของสีย้อม บัฟเฟอร์ อัตราส่วนเลือดต่อสีย้อม อุณหภูมิ และเวลา มีความสำคัญพอ ๆ กับชนิดของสีย้อม

ในทางปฏิบัติ จึงต้องทำตามลำดับอย่างเคร่งครัด: ผสมเลือดที่เติมสารกันเลือดแข็งกับสีย้อมก่อน บ่ม จากนั้นจึงทำฟิล์มเลือดและตรวจโดยไม่ตรึงเซลล์และไม่ย้อมสีตัดกัน การตรึงเซลล์ก่อนย้อม หรือการย้อมสีตัดกันที่บดบังเส้นใยจาง ๆ จะทำลายข้อมูลที่จำเป็นต่อการนับ

ขั้นตอนการตรวจเรติคูโลไซต์ด้วยนิวเมทิลีนบลูที่นำไปใช้ได้

ไม่มีสูตรเดียวที่ใช้เป็นสากล จึงต้องรายงานสูตรที่ใช้จริง วิธีสามรูปแบบที่มีเอกสารอ้างอิงต่อไปนี้แสดงให้เห็นช่วงของเงื่อนไขที่ใช้

วิธีแบบ Brecher ดั้งเดิมใช้นิวเมทิลีนบลูประมาณ 0.5 เปอร์เซ็นต์ร่วมกับโพแทสเซียมออกซาเลต ผสมในปริมาตรเท่ากันกับเลือดที่ใส่ EDTA และผสมจนเข้ากันดีแล้ว บ่มประมาณ 10 ถึง 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังผสมซ้ำอย่างเบามือ ให้ทำฟิล์มเลือดบางแบบลิ่ม ปล่อยให้แห้งในอากาศ แล้วตรวจโดยไม่ตรึงเซลล์ด้วยเลนส์วัตถุอิมเมอร์ชันน้ำมัน 100x ขั้นตอนการนับเรติคูโลไซต์ของ NCBI อธิบายลำดับงานนี้และกรอบนับที่ใช้ร่วมกัน

วิธีแบบ Dacie และ Lewis ใช้นิวเมทิลีนบลู 1.0 เปอร์เซ็นต์ในสารละลายน้ำเกลือซิเตรต ผสมกับเลือด 2 ถึง 4 ส่วนโดยปริมาตร และบ่มที่ 37 C เป็นเวลา 15 ถึง 20 นาทีก่อนทำฟิล์มเลือด การนำขั้นตอน CLSI H44 มาใช้ในการปรับมาตรฐานให้สอดคล้องกันครั้งล่าสุด ใช้สารละลายที่เจือจางกว่า คือ 0.1 เปอร์เซ็นต์ในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตที่ pH 7.4 บ่มที่ 20 C เป็นเวลา 10 นาที และไม่ตรึงเซลล์ ตามรายงานใน การศึกษาปรับมาตรฐาน NMB ให้สอดคล้องกันปี 2026

เกณฑ์การนับเหมือนกันในทุกวิธี ให้นับเซลล์เป็นเรติคูโลไซต์เมื่อมีเม็ดที่ติดสีน้ำเงินหรือส่วนของเส้นใยที่แยกจากกันอย่างน้อยสองส่วน เกณฑ์นี้ช่วยตัดตะกอนสีย้อมที่พบเพียงจุดเดียวออก ในงานประจำ ให้นับเม็ดเลือดแดงอย่างน้อย 1,000 เซลล์และรายงานเรติคูโลไซต์เป็นเปอร์เซ็นต์ เมื่อเปอร์เซ็นต์ต่ำ หลักสถิติกำหนดให้ต้องนับเซลล์มากขึ้น บททบทวนวิธี CLSI H44 ระบุว่า เมื่อเรติคูโลไซต์อยู่ใกล้ 1 เปอร์เซ็นต์ ต้องนับประมาณ 4,400 เซลล์เพื่อลดความแปรปรวนของการนับลงเหลือ 5 เปอร์เซ็นต์ ตาม บททบทวน CLSI H44 ที่ De Gruyter แผ่นกริดนับ Miller ในเลนส์ตาช่วยให้นับเซลล์จำนวนมากได้สะดวก ควรกรองสีย้อมหรือเตรียมใหม่ เพราะตะกอนอาจดูคล้ายสิ่งแทรกในเซลล์ที่มีลักษณะเป็นเม็ด

ไฮนซ์บอดีในตัวอย่างเตรียมเดียวกัน

ฟิล์มที่ย้อมแบบซูปราไวทัลเดียวกันยังใช้แสดงไฮนซ์บอดีได้ด้วย ไฮนซ์บอดีเป็นกลุ่มก้อนของฮีโมโกลบินที่ถูกออกซิไดซ์และเสียสภาพ ไม่ใช่ RNA ที่หลงเหลืออยู่ ในตัวอย่างที่ย้อมด้วยนิวเมทิลีนบลู ไฮนซ์บอดีปรากฏเป็นก้อนกลม มักพบเพียงก้อนเดียวและอยู่ใกล้เยื่อหุ้มเซลล์ โดยติดสีน้ำเงินอ่อนกว่าวัสดุลักษณะร่างแหและเส้นใย ไฮนซ์บอดีคงสภาพได้ไม่ดีเมื่อผ่านการตรึงเซลล์และการย้อมสีตัดกัน จึงควรตรวจฟิล์มที่ยังไม่ตรึง ขั้นตอนล่าสุดที่ใช้เลือดใส่ EDTA 20 ไมโครลิตรผสมกับนิวเมทิลีนบลู 1 เปอร์เซ็นต์ 20 ไมโครลิตร และบ่ม 15 นาที ได้วัดสัดส่วนเซลล์ที่พบไฮนซ์บอดีจากเม็ดเลือดแดง 250 เซลล์ ตาม การศึกษาใน PMC ที่รายงานขั้นตอนดังกล่าว

ความแตกต่างสองประการช่วยป้องกันการอ่านผลผิด ประการแรก เมทิลไวโอเลตและคริสตัลไวโอเลตย้อมไฮนซ์บอดีได้เข้มกว่านิวเมทิลีนบลู ตามที่ระบุใน หัวข้อไฮนซ์บอดีของ ScienceDirect นิวเมทิลีนบลูเป็นตัวเลือกที่สะดวกเมื่อต้องประเมินเรติคูโลไซต์และไฮนซ์บอดีพร้อมกัน แต่ไม่ใช่สีย้อมที่ให้สีเข้มที่สุดสำหรับการตรวจไฮนซ์บอดีโดยเฉพาะ ประการที่สอง สิ่งแทรก HbH ในภาวะพาหะอัลฟาธาลัสซีเมียปรากฏเป็นจุดเล็กละเอียดจำนวนมากทั่วเซลล์หลังย้อมแบบซูปราไวทัล ขณะที่ไฮนซ์บอดีแบบคลาสสิกมีจำนวนน้อยกว่า ขนาดใหญ่กว่า และมักสัมพันธ์กับเยื่อหุ้มเซลล์ สิ่งที่ดูคล้ายกันอย่างที่สามคือตะกอนสีย้อม ซึ่งอยู่นอกระนาบโฟกัสของเซลล์และมีลักษณะแตกต่างกันระหว่างบริเวณที่ตรวจ

บริลเลียนต์ครีซิลบลูกับนิวเมทิลีนบลู

สีย้อมทั้งสองชนิดเป็นสีย้อมซูปราไวทัลสำหรับเรติคูโลไซต์ แต่การกำหนดมาตรฐานให้น้ำหนักกับชนิดหนึ่งมากกว่า วิธีตรวจเรติคูโลไซต์ CLSI H44-A2 ซึ่งพัฒนาร่วมกับสภาระหว่างประเทศเพื่อการกำหนดมาตรฐานทางโลหิตวิทยา และแสดงไว้ใน หน้ามาตรฐาน CLSI H44 กำหนดให้การย้อมเลือดที่ใส่ EDTA ด้วยนิวเมทิลีนบลูเป็นวิธีเปรียบเทียบแบบนับด้วยมือ การสอนโลหิตวิทยาแบบดั้งเดิมให้ข้อสรุปตรงกันในด้านลักษณะที่เห็น: นิวเมทิลีนบลูทำให้เส้นใยติดสีเข้มและสม่ำเสมอกว่า ขณะที่บริลเลียนต์ครีซิลบลูให้ผลแตกต่างกันมากกว่าระหว่างรุ่นการผลิตและตัวอย่าง

อย่างไรก็ตาม สถานะดังกล่าวต้องอธิบายพร้อมข้อจำกัด แนวทางการประเมินเครื่องวิเคราะห์ของ ICSH ยอมรับการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์โดยย้อมนิวเมทิลีนบลูและนับด้วยมือเป็นแนวทางเปรียบเทียบอ้างอิง แต่ระบุว่าขึ้นอยู่กับดุลยพินิจของผู้ตรวจและมีความเที่ยงค่อนข้างต่ำ โดยแนะนำให้ใช้ขั้นตอนอ้างอิงแบบโฟลไซโตเมทรีเมื่อมีพร้อม การเปรียบเทียบตัวอย่าง 100 ตัวอย่างในปี 2022 พบว่า เมื่อเทียบกับเครื่องวิเคราะห์ที่ใช้ในการศึกษานั้น บริลเลียนต์ครีซิลบลูมีความเอนเอียงต่ำกว่านิวเมทิลีนบลู ตามรายงานใน การเปรียบเทียบวิธีย้อมใน PMC ข้อสรุปที่มีหลักฐานรองรับสำหรับนักศึกษาคือ ใช้นิวเมทิลีนบลูเป็นวิธีเปรียบเทียบแบบนับด้วยมือที่เป็นมาตรฐาน ตรวจสอบวิธีบริลเลียนต์ครีซิลบลูที่ใช้ในห้องปฏิบัติการของตนเทียบกับวิธีนี้หรือกับระบบอัตโนมัติ และคาดว่าผลจากการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบนับด้วยมือจะกระจายกว้างกว่าไม่ว่าจะใช้สีย้อมใด เอกสารด้านการกำหนดมาตรฐานในอดีตยังเสนอให้ใช้ Azure B ที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์เป็นทางเลือกที่มีองค์ประกอบทางเคมีบริสุทธิ์กว่า เนื่องจากสีย้อมเชิงพาณิชย์แต่ละรุ่นการผลิตแตกต่างกัน ตาม การศึกษาของ Marshall เกี่ยวกับ Azure B ซึ่งอธิบายว่าทำไมเกรดของน้ำยายังคงเป็นประเด็นในการอภิปรายวิธีการ

การหลีกเลี่ยงข้อผิดพลาดที่พบบ่อย

ข้อผิดพลาดสี่อย่างเป็นสาเหตุของตัวอย่างเตรียมที่ไม่สำเร็จส่วนใหญ่ การสั่งเมทิลีนบลูทั่วไปแทนนิวเมทิลีนบลู N ทำให้ติดสีจางด้วยเหตุผลทางเคมี ไม่ใช่เพราะเทคนิค การตรึงเซลล์หรือย้อมสีตัดกันก่อนอ่านผลทำให้สัญญาณจากการย้อมแบบซูปราไวทัลหายไป การนับตะกอนสีย้อมเป็นเม็ดในเซลล์ทำให้ผลสูงเกินจริง ซึ่งป้องกันได้ด้วยเกณฑ์อย่างน้อยสองเม็ดและการกรองสีย้อม การนับเซลล์น้อยเกินไปเมื่อเปอร์เซ็นต์เรติคูโลไซต์ต่ำทำให้ได้ตัวเลขที่ดูแม่นยำ แต่มีช่วงความเชื่อมั่นกว้าง ข้อผิดพลาดแต่ละอย่างมีลักษณะร่วมกัน: ผู้ตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์โทษกล้อง ทั้งที่ผลถูกกำหนดมาตั้งแต่ขั้นตอนการใช้น้ำยาแล้ว