การย้อมเซลล์เยื่อบุกระพุ้งแก้มด้วยเมทิลีนบลู: สิ่งที่ควรสังเกต

นักเรียนคนหนึ่งหยดสารแขวนลอยเซลล์เยื่อบุกระพุ้งแก้มลงบนสไลด์ มองผ่านกล้องจุลทรรศน์ แล้วแทบไม่เห็นอะไรเลย มีเพียงเงาจาง ๆ ไม่กี่เงาลอยผ่านพื้นภาพสว่าง เธอปรับโฟกัส จากนั้นเพิ่มแสง แล้วสรุปว่าสไลด์ว่างเปล่า แต่สไลด์ไม่ได้ว่างเปล่า เซลล์อยู่ตรงนั้น เพียงแต่แทบจะโปร่งใส และความโปร่งใสนี่เองคือปัญหาที่การย้อมสีนี้มีไว้แก้ไข

ความไม่สอดคล้องระหว่างสิ่งที่คาดหวังกับภาพที่เห็นนี้ควรอธิบายให้ชัดเจนก่อนเริ่มขั้นตอน ผู้เริ่มต้นมักคาดหวังว่ากล้องจุลทรรศน์จะเผยรายละเอียดเหมือนการซูมกล้องถ่ายภาพเพื่ออ่านป้ายที่อยู่ไกล แต่กล้องจุลทรรศน์แบบสนามสว่างทำสิ่งที่เฉพาะเจาะจงกว่านั้น คือแสดงความแตกต่างในการดูดกลืนแสง เซลล์เยื่อบุกระพุ้งแก้มที่ไม่ได้ย้อมสีแทบไม่ดูดกลืนแสง จึงแทบไม่สร้างความแตกต่างในภาพ เมทิลีนบลูช่วยเพิ่มความแตกต่างนั้น โดยจับกับส่วนต่าง ๆ ภายในเซลล์อย่างไม่สม่ำเสมอ และทำให้โครงสร้างปรากฏเป็นความเปรียบต่าง เมื่อนักเรียนเข้าใจแนวคิดนี้ ทุกขั้นตอนที่ตามมาจะมีเหตุผลรองรับ แทนที่จะเป็นเพียงคำสั่งให้ทำตาม

ความรู้พื้นฐานว่าการย้อมสีอย่างง่ายเพิ่มความเปรียบต่างในห้องปฏิบัติการของโรงเรียนได้อย่างไรจะช่วยในจุดนี้ และการทบทวนการตั้งค่ากล้องจุลทรรศน์แบบสนามสว่างก่อนย้อมสีช่วยป้องกันสไลด์ที่ใช้ไม่ได้ราวครึ่งหนึ่งได้ ส่วนเคมีเบื้องหลังสีอธิบายไว้ในบทนำเรื่องเมทิลีนบลูในการใช้กล้องจุลทรรศน์ ซึ่งกล่าวถึงเหตุผลที่สีย้อมชนิดนี้ยังคงพบได้เสมอบนโต๊ะปฏิบัติการ

ขั้นตอนสำหรับชั้นเรียน

วิธีเตรียมสไลด์แบบเปียกด้านล่างเป็นตัวเลือกพื้นฐานที่ง่ายกว่าสำหรับชั้นเรียนทั่วไป ไม่ต้องใช้เปลวไฟและไม่ต้องมีขั้นตอนตรึงตัวอย่าง ส่วนวิธีป้ายตัวอย่างแล้วตรึงที่ใช้ในคู่มือระดับวิทยาลัยบางเล่ม เพิ่มการปล่อยให้แห้งในอากาศและการตรึงด้วยความร้อนช่วงสั้น ๆ เช่นในกิจกรรมป้ายตัวอย่างจากกระพุ้งแก้มของ North Central Texas College ที่เผยแพร่ผ่าน Biology LibreTexts แต่การตรึงด้วยความร้อนเป็นแนวปฏิบัติทางจุลชีววิทยา ไม่ใช่ข้อจำเป็นในการมองเห็นเซลล์เยื่อบุผิว

สิ่งที่ต้องใช้: สไลด์และกระจกปิดสไลด์ที่สะอาด ไม้พันสำลีปลอดเชื้อชนิดใช้ครั้งเดียว (แนะนำ) หรือไม้จิ้มฟันแบนอันใหม่ ขวดหยดสารละลายเมทิลีนบลูในน้ำความเข้มข้น 0.5 ถึง 1 เปอร์เซ็นต์ น้ำกลั่นหรือน้ำปราศจากไอออน กระดาษซับ ถุงมือ และกล้องจุลทรรศน์แบบประกอบที่มีกำลังขยายรวม 100x และ 400x

1. บ้วนปากด้วยน้ำเปล่า เพื่อกำจัดเศษอาหารที่จะติดสีเข้มในภายหลังและรบกวนการสังเกตเซลล์
2. นักเรียนแต่ละคนเก็บตัวอย่างจากกระพุ้งแก้มของตนเองเท่านั้น ใช้ไม้พันสำลีปลอดเชื้ออันใหม่ถูด้านในกระพุ้งแก้มเบา ๆ ใช้วิธีกด ไม่ใช่ขูด หยุดก่อนที่จะรู้สึกไม่สบายหรือมีเลือดออก
3. กลิ้งไม้พันสำลีเป็นชั้นบาง ๆ บริเวณกลางสไลด์ที่สะอาด ความบางของชั้นตัวอย่างเป็นปัจจัยสำคัญที่สุดที่บ่งชี้ว่าจะได้สไลด์ที่สังเกตได้ชัดเจน ตัวอย่างสีขาวที่สะสมหนาจะติดสีเป็นก้อนสีน้ำเงินที่แยกโครงสร้างไม่ได้
4. หยดเมทิลีนบลูหนึ่งหยดลงบนบริเวณที่ป้ายตัวอย่าง ทิ้งไว้ 1 ถึง 3 นาที หลายขั้นตอนในระดับวิทยาลัยใช้เวลาเพียงหนึ่งนาทีก็เพียงพอ ส่วนคู่มือห้องปฏิบัติการวิทยาศาสตร์ชั้น IX ของ NCERTใช้เวลาประมาณ 3 นาทีสำหรับการเตรียมสไลด์ชั่วคราว การย้อมนานขึ้นไม่ได้ดีกว่า และการย้อมนานเกินไปเป็นข้อผิดพลาดเรื่องเวลาที่พบบ่อยที่สุด
5. ล้างเบา ๆ ด้วยน้ำกลั่น หรือใช้กระดาษซับดึงสีย้อมส่วนเกินออกตามขั้นตอนของสถานศึกษา พื้นหลังควรเป็นสีฟ้าอ่อน ไม่ใช่สีน้ำเงินกรมท่าเข้ม
6. วางกระจกปิดสไลด์โดยเอียงให้ขอบด้านหนึ่งสัมผัสก่อน แล้วค่อย ๆ ลดลง วิธีนี้ช่วยป้องกันฟองอากาศ
7. เริ่มที่กำลังขยายต่ำเพื่อหาเซลล์ ตรวจสอบโฟกัสและจัดให้อยู่กลางภาพ จากนั้นเปลี่ยนเป็น 100x และสุดท้ายเป็น 400x ที่ 400x ให้ใช้เฉพาะปุ่มปรับภาพละเอียด

เรื่องความเข้มข้นของสีย้อมควรมีคำอธิบายที่ชัดเจนสักประโยค ขั้นตอนในโรงเรียนส่วนใหญ่ใช้สารละลายเมทิลีนบลูในน้ำที่ความเข้มข้นประมาณ 1 เปอร์เซ็นต์ สารละลายตั้งต้นที่เข้มข้นกว่าหรือการสัมผัสสีย้อมนานจะทำให้พื้นหลังเข้มขึ้นเร็วกว่านิวเคลียส ซึ่งส่งผลตรงข้ามกับความเปรียบต่างที่กิจกรรมนี้ต้องการ

การจัดการตัวอย่างจากกระพุ้งแก้มอย่างปลอดภัย

ตัวอย่างจากกระพุ้งแก้มมีน้ำลายและจุลินทรีย์ที่พบตามปกติในช่องปากติดมาด้วย จึงควรปฏิบัติต่อตัวอย่างป้ายสดทุกชิ้นเสมือนเป็นวัสดุที่อาจมีเชื้อ แม้ผู้ให้ตัวอย่างจะเป็นเพื่อนร่วมชั้นที่มีสุขภาพดีก็ตาม แนวทางความปลอดภัยทางชีวภาพสำหรับห้องปฏิบัติการสอนของ American Society for Microbiologyระบุหลักการทั่วไปไว้ว่า ให้ประเมินความเสี่ยงก่อนเริ่มกิจกรรม สวมถุงมือ ป้องกันดวงตาเมื่อมีโอกาสกระเด็น ล้างมือหลังเสร็จงาน ฆ่าเชื้อบนโต๊ะปฏิบัติการ และกำจัดวัสดุใช้แล้วที่ปนเปื้อนผ่านระบบจัดการขยะชีวภาพที่ได้รับอนุมัติ

กฎในชั้นเรียนสี่ข้อครอบคลุมความเสี่ยงส่วนใหญ่ ไม้พันสำลีแต่ละอันและสไลด์แต่ละแผ่นใช้กับผู้ให้ตัวอย่างเพียงคนเดียว ห้ามใช้ร่วมกัน เก็บตัวอย่างจากตนเองเท่านั้น ห้ามเก็บจากเพื่อน ไม้พันสำลีและไม้จิ้มฟันที่ใช้ครั้งเดียวให้ทิ้งลงภาชนะขยะที่กำหนดทันที ห้ามวางกลับบนโต๊ะปฏิบัติการ เมทิลีนบลูเองทำให้ผิวหนังและเสื้อผ้าเปื้อน และระคายเคืองดวงตา จึงต้องสวมถุงมือและปฏิบัติตามหลักสุขอนามัยในการใช้สีย้อมตามปกติ อย่าต่อยอดกิจกรรมนี้ไปเป็นการเพาะเลี้ยงสิ่งใดจากตัวอย่างป้าย และอย่าดัดแปลงวิธีตรึงวัสดุสดจากมนุษย์ด้วยความร้อนนอกเหนือจากขั้นตอนความปลอดภัยของโรงเรียน

สิ่งที่ควรสังเกต และเหตุใดจึงมีลักษณะเช่นนั้น

ที่ 100x ให้มองหาเซลล์แบนกว้างสีฟ้าอ่อน มีขอบเป็นรูปรีหรือรูปหลายเหลี่ยมที่ไม่สม่ำเสมอ เซลล์อาจอยู่เดี่ยว ๆ หรือซ้อนทับกันเป็นแผ่นหลวม ๆ โดยทั่วไปแต่ละเซลล์มีจุดสีน้ำเงินเข้มกว่าหนึ่งจุด จุดนั้นคือนิวเคลียส สังเกตการเรียงตัวด้วย: เซลล์เยื่อบุผิวชนิดแบนเป็นแผ่นบางคล้ายกระเบื้อง ไม่ใช่ทรงกลม ขอบจึงดูคล้ายรอยแตกรานของผิวเคลือบ มากกว่าลูกโป่งกลม ๆ

ที่ 400x จะเห็นลักษณะสามอย่างได้ชัดเจน ขอบเขตเซลล์ปรากฏเป็นเส้นบางสีเข้มกว่าที่ล้อมรอบเซลล์ ไซโทพลาซึมภายในมีสีฟ้าอ่อนสม่ำเสมอ นิวเคลียสมีสีเข้มกว่าและดูแน่นกว่า มักเป็นรูปรี และมักอยู่ใกล้กึ่งกลาง แต่ไม่เสมอไป ให้นักเรียนบันทึกทั้งสามอย่าง รวมถึงรูปร่างและกำลังขยาย เพราะใบงานกำหนดให้บันทึกสิ่งเหล่านี้โดยตรง

มีประเด็นหนึ่งเกี่ยวกับความถูกต้องที่สำคัญ และใบงานหลายชุดอธิบายผิด ขอบเขตที่มองเห็นตรงกับบริเวณเยื่อหุ้มเซลล์ แต่ตัวเยื่อหุ้มเองซึ่งเป็นลิพิดสองชั้นหนาประมาณ 7 ถึง 10 นาโนเมตรนั้น เล็กเกินกว่าที่กล้องจุลทรรศน์ของโรงเรียนจะแยกรายละเอียดได้มาก สิ่งที่นักเรียนเห็นคือขอบเซลล์ที่ปรากฏทางแสงร่วมกับสีย้อมที่สะสมบริเวณนั้น ข้อควรระวังเดียวกันนี้ใช้กับออร์แกเนลล์ด้วย ไมโทคอนเดรีย ร่างแหเอนโดพลาซึม กอลจิบอดี และไรโบโซมไม่ปรากฏให้เห็นในการเตรียมตัวอย่างแบบนี้ กล้องจุลทรรศน์แสงทั่วไปแยกรายละเอียดได้เล็กถึงประมาณ 0.2 ไมโครเมตรภายใต้สภาวะที่ดี ตามที่อธิบายไว้ในข้อมูลพื้นฐานด้านชีววิทยาเซลล์ของ NCBI เรื่องเครื่องมือทางกล้องจุลทรรศน์ และโครงสร้างระดับละเอียดส่วนใหญ่มีขนาดเล็กกว่าหรือใกล้ขีดจำกัดนั้น การเพิ่มกำลังขยายโดยไม่เพิ่มความสามารถในการแยกรายละเอียดทำให้ภาพใหญ่ขึ้น แต่ไม่ได้เพิ่มรายละเอียด

เหตุใดนิวเคลียสจึงติดสีเข้มที่สุด? เมทิลีนบลูเป็นสีย้อมประจุบวก ซึ่งมีประจุบวกในสารละลาย และจับกับวัสดุที่มีประจุลบภายในเซลล์ โดยเฉพาะกรดนิวคลีอิก โครมาตินทำให้ DNA รวมตัวอยู่หนาแน่นในนิวเคลียส นิวเคลียสจึงสะสมสีย้อมมากที่สุด ไซโทพลาซึมมี RNA และโมเลกุลที่มีประจุอื่น ๆ จึงติดสีเช่นกัน แต่กระจายตัวกว่าและจางกว่า ข้อจำกัดสำคัญคือ เมทิลีนบลูไม่ใช่สีย้อมที่จำเพาะต่อ DNA งานวิจัยเรื่องการกระจายตัวของเมทิลีนบลูในการถ่ายภาพนิวเคลียสอธิบายว่าประจุบวกจับกับบริเวณที่มีกรดนิวคลีอิกมาก และงานเชิงปริมาณในอดีตเรื่องการจับของเมทิลีนบลูในตัวอย่างเซลล์ที่เตรียมไว้พบว่าสีย้อมที่จับอยู่ส่วนใหญ่สัมพันธ์กับกรดนิวคลีอิก ดังนั้นนิวเคลียสสีเข้มร่วมกับไซโทพลาซึมสีอ่อนจึงเป็นรูปแบบความเปรียบต่าง ไม่ใช่การทดสอบระดับโมเลกุล

ข้อผิดพลาดที่นักเรียนมักทำ และวิธีตีความ

สไลด์ที่ใช้ไม่ได้แทบทุกแผ่นเข้าข่ายหนึ่งในห้ารูปแบบต่อไปนี้ สอนให้นักเรียนวิเคราะห์ปัญหาของสไลด์ แทนที่จะทำซ้ำโดยไม่รู้สาเหตุ

การย้อมมากเกินไปทำให้เซลล์และพื้นหลังเข้มสม่ำเสมอกัน จนนิวเคลียสกลืนไปกับพื้นภาพ แก้โดยลดเวลาย้อมหรือล้างให้ทั่วถึงขึ้น การย้อมน้อยเกินไปทำให้เห็นเพียงเงาจาง ๆ ที่หายไปเมื่อเพิ่มแสง ให้เพิ่มเวลาทีละสามสิบวินาที ตัวอย่างป้ายที่หนาทำให้เกิดกลุ่มเซลล์ซ้อนทับกันแน่นจนตามขอบเซลล์ไม่ได้ วิธีแก้เป็นเรื่องของการเตรียมตัวอย่าง คือป้ายให้บางลงในครั้งถัดไป เพราะไม่มีวิธีล้างใดช่วยกองเซลล์ที่ซ้อนกันได้ ฟองอากาศปรากฏเป็นวงกลมสมบูรณ์ที่มีขอบเข้มคมชัด และรบกวนผู้เริ่มต้นที่เข้าใจผิดว่าเป็นโครงสร้าง ให้ยกกระจกปิดสไลด์แล้ววางใหม่ช้า ๆ โดยเอียงทำมุม จุดสีเข้มเล็ก ๆ ที่กระจายบนเซลล์หรือรอบเซลล์มักเป็นแบคทีเรียที่พบตามปกติในช่องปาก ดังที่ขั้นตอนของโรงเรียน เช่น ขั้นตอนศึกษาเซลล์เยื่อบุกระพุ้งแก้มของ Ingrid Scienceระบุไว้ จุดเหล่านี้ยืนยันว่ามีสิ่งมีชีวิตอาศัยอยู่ในปาก ซึ่งอาจเป็นสิ่งที่นักเรียนจดจำได้ดี แต่กิจกรรมนี้ไม่สามารถระบุแบคทีเรียถึงระดับชนิดได้ และไม่ควรวาดเป็นส่วนประกอบของเซลล์ เศษอาหารและเส้นเมือกติดสีเข้มอย่างไม่สม่ำเสมอ การบ้วนปากก่อนเริ่มมีไว้เพื่อลดสิ่งเหล่านี้

สิ่งที่กิจกรรมนี้ทำไม่ได้

นี่เป็นการสังเกตเพื่อการศึกษา ไม่ใช่การทดสอบวินิจฉัย ลักษณะของเซลล์จากการย้อมสีในชั้นเรียนไม่สามารถใช้วินิจฉัยการติดเชื้อ มะเร็ง หรือโรคใด ๆ ได้ และไม่ควรตีความบทความนี้ว่าชี้แนะให้ทำเช่นนั้น ตัวอย่างที่เตรียมแสดงรูปร่าง ขอบเขต ไซโทพลาซึม และนิวเคลียสที่กำลังขยายสองระดับ ไม่ได้แสดงโครงสร้างระดับละเอียดของเยื่อหุ้ม รายละเอียดของออร์แกเนลล์ หรือเอกลักษณ์ระดับโมเลกุล การระบุข้อจำกัดอย่างชัดเจนช่วยปกป้องทั้งความถูกต้องทางวิทยาศาสตร์และนักเรียน: ผลงานที่ดีคือภาพวาดที่ติดป้ายกำกับถูกต้อง พร้อมบันทึกกำลังขยายและสีย้อม ไม่ใช่ข้อสรุปเกี่ยวกับสุขภาพ

ใบงานสำหรับนักเรียนและภาพจากกล้องจุลทรรศน์พร้อมป้ายกำกับ

สื่อประกอบโครงการสองชิ้นสำหรับหน้านี้คือภาพจากกล้องจุลทรรศน์พร้อมป้ายกำกับด้านบนและใบงานด้านล่าง พิมพ์ใบงานให้นักเรียนคนละหนึ่งชุด หรือฉายภาพแล้วให้นักเรียนคัดลอกกรอบลงในสมุด

วิธีใช้ในคาบเรียน 45 นาที: สิบนาทีสำหรับชี้แจงความปลอดภัยและเก็บตัวอย่าง สิบนาทีสำหรับย้อมสีและเตรียมสไลด์ สิบห้านาทีสำหรับสังเกตและวาดภาพที่กำลังขยายทั้งสองระดับ และสิบนาทีสำหรับรายการตรวจสอบและเปรียบเทียบกับภาพจากกล้องจุลทรรศน์ที่มีป้ายกำกับ รายการตรวจสอบตั้งใจให้เป็นสิ่งที่ตรวจได้อย่างตรงไปตรงมา ได้แก่ ตัวอย่างป้ายบาง เวลาย้อมถูกต้อง นิวเคลียสเข้มกว่าไซโทพลาซึม และบันทึกกำลังขยาย นักเรียนที่ตรวจผ่านทั้งสี่ข้อได้ย่อมเข้าใจแนวคิดที่บทเรียนนี้มุ่งสอน: กล้องจุลทรรศน์แสดงความแตกต่าง และสีย้อมสร้างความแตกต่างที่ควรค่าแก่การแสดงให้เห็น