เมทิลีนบลู, Nrf2 และการสร้างไมโทคอนเดรียใหม่: สิ่งที่วัดได้และสิ่งที่ยังเป็นข้อเสนอ

ประโยคหนึ่งที่ปรากฏบ่อยในบทความเกี่ยวกับเมทิลีนบลูคือ สารนี้กระตุ้น Nrf2 และสร้างไมโทคอนเดรียใหม่ ประโยคนี้อ่านดูเหมือนเป็นข้อกล่าวอ้างเดียว แต่แท้จริงแล้วประกอบด้วยแนวคิดสองอย่างที่แตกต่างกัน ซึ่งศึกษากันในระบบที่ต่างกันและมีหลักฐานคนละประเภท อย่างแรกคือวิถีส่งสัญญาณ เป็นตัวตรวจจับที่เปิดการทำงานของยีนป้องกันเซลล์ อย่างที่สองคือโปรแกรมการสร้าง ซึ่งเซลล์ใช้สร้างกลไกของไมโทคอนเดรียเพิ่มขึ้น สัญญาณอาจกระตุ้นการสร้างได้ แต่การแสดงว่าสัญญาณถูกกระตุ้นไม่ใช่สิ่งเดียวกับการแสดงว่าสิ่งก่อสร้างเกิดขึ้นแล้ว และการแสดงว่ามีวัสดุก่อสร้างมากขึ้นก็ไม่ใช่สิ่งเดียวกับการแสดงว่าระบบจ่ายพลังงานดีขึ้น บทความนี้แยกทั้งสามสิ่งออกจากกัน

แนวคิดเรื่อง Nrf2: ตัวตรวจจับ ไม่ใช่เกราะป้องกัน

Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2) เป็นปัจจัยควบคุมการถอดรหัส หรือโปรตีนที่มีหน้าที่เปิดการทำงานของยีน ในภาวะพัก โปรตีนตรวจจับชื่อ Keap1 จะยึด Nrf2 ไว้ในไซโทพลาซึมและส่งต่อให้กลไกกำจัดของเซลล์ทำลายอย่างต่อเนื่อง เมื่อสารออกซิไดซ์หรือสารอิเล็กโทรไฟล์ทำให้ตำแหน่งซิสเทอีนที่ไวต่อปฏิกิริยาบน Keap1 เปลี่ยนแปลง การกำจัดจะหยุดลง Nrf2 ที่สร้างขึ้นใหม่จึงสะสม เคลื่อนเข้าสู่นิวเคลียส จับคู่กับโปรตีน Maf ขนาดเล็ก และจับกับลำดับ DNA ที่เรียกว่าองค์ประกอบตอบสนองต่อสารต้านอนุมูลอิสระ การจับนี้เปิดการทำงานของยีนป้องกันเซลล์หลายชนิด

ตัวชี้วัดมาตรฐานของวิถีนี้มีความจำเพาะ NQO1 (NAD(P)H quinone dehydrogenase 1) และ TrxR1 (thioredoxin reductase 1) เป็นยีนเป้าหมายของ Nrf2 ที่เชื่อถือได้มากที่สุดกลุ่มหนึ่ง HO-1 (heme oxygenase-1) สามารถถูกเหนี่ยวนำได้อย่างมาก แต่ก็ตอบสนองต่อตัวควบคุมอื่นด้วย เอนไซม์อย่าง SOD และคะตาเลสเป็นส่วนหนึ่งของกลไกต้านอนุมูลอิสระ แต่ระดับของเอนไซม์เหล่านี้อยู่ภายใต้การควบคุมของปัจจัยควบคุมการถอดรหัสหลายชนิด ดังนั้น การเพิ่มขึ้นของ SOD เพียงอย่างเดียวจึงไม่ได้พิสูจน์ว่า Nrf2 เป็นสาเหตุ หลักฐานที่ใกล้กับเหตุการณ์ส่งสัญญาณมากที่สุดคือการสะสมของ Nrf2 ในนิวเคลียส การกระตุ้นตัวรายงาน ARE หรือการเหนี่ยวนำยีนเป้าหมายมาตรฐานที่หายไปเมื่อกำจัด Nrf2 ส่วนสิ่งอื่นทั้งหมด ไม่ว่าจะเป็นระดับสารออกซิไดซ์ที่ลดลง การอยู่รอดภายใต้ความเครียดที่ดีขึ้น หรือกลูตาไธโอนที่เพิ่มขึ้น ล้วนเป็นผลปลายทางที่เกิดได้จากหลายวิถี

ผลการศึกษาเมทิลีนบลูที่เก่าแก่ที่สุดในเรื่องนี้อยู่ใกล้ด้านที่เชื่อมโยงกับสัญญาณโดยตรงของลำดับหลักฐานดังกล่าว เซลล์ไฟโบรบลาสต์ที่สัมผัสเมทิลีนบลูระดับ nanomolar มีการเข้าสู่ภาวะชราของเซลล์ช้าลง พร้อมกับปริมาณคอมเพล็กซ์ IV ที่สูงขึ้น การใช้ออกซิเจนที่เพิ่มขึ้น และการเหนี่ยวนำเอนไซม์ระยะที่ 2 ได้แก่ TrxR1 และ NQO1 ตามรายงานในการศึกษาที่เชื่อมโยงเมทิลีนบลูกับการเพิ่มสมรรถนะของไมโทคอนเดรียและการชะลอภาวะชราของเซลล์เป็นครั้งแรก TrxR1 และ NQO1 เป็นยีนเป้าหมายมาตรฐานของ Nrf2 ที่ผู้อ่านซึ่งพิจารณาหลักฐานอย่างรอบคอบต้องการเห็นพอดี แต่สิ่งที่การศึกษานี้ไม่ได้แสดงคือเหตุการณ์ส่งสัญญาณเอง กล่าวคือ ไม่มีการวัด Nrf2 ในนิวเคลียส ไม่มีตัวรายงาน ARE และไม่มีชุดควบคุมที่ตัดยีน Nrf2 ออก ดังนั้น การตีความอย่างตรงไปตรงมาคือ เมทิลีนบลูเหนี่ยวนำยีนที่ทราบว่าเป็นเป้าหมายของ Nrf2 ในระบบนี้ ซึ่งสอดคล้องกับการกระตุ้น Nrf2 แต่ยังไม่ได้แยกยืนยันว่า Nrf2 เป็นสาเหตุ การเหนี่ยวนำยีนเป้าหมายเป็นเหตุการณ์ที่อยู่ถัดจากสวิตช์ลงมาหนึ่งขั้น

แนวคิดเรื่องการสร้างไมโทคอนเดรียใหม่: โปรแกรมที่มีจุดตรวจสอบสามจุด

การสร้างไมโทคอนเดรียใหม่เป็นโปรแกรมที่เซลล์ใช้เพิ่มขีดความสามารถของไมโทคอนเดรีย ลำดับขั้นตามตำราประกอบด้วยจุดตรวจสอบสามจุด จุดแรกคือโคแอกทิเวเตอร์ PGC-1alpha เปิดการทำงานของโปรแกรม จุดที่สองคือปัจจัยควบคุมการถอดรหัสในนิวเคลียสผลักดันการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับไมโทคอนเดรีย รวมถึง TFAM ซึ่งทำหน้าที่คงสภาพและจำลอง DNA ของไมโทคอนเดรีย ทั้งนี้ ชื่อชวนสับสน เพราะปัจจัยตัวหนึ่งชื่อ NRF1 หรือ nuclear respiratory factor 1 ซึ่งเป็นคนละโปรตีนกับ Nrf2 จุดที่สามคือเซลล์มีจีโนมไมโทคอนเดรียและกลไกการหายใจระดับเซลล์เพิ่มขึ้น ซึ่งวัดได้จากจำนวนสำเนา mtDNA กิจกรรมของซิเตรตซินเทส หรือปริมาณและกิจกรรมของคอมเพล็กซ์ในระบบการหายใจ

แต่ละจุดตรวจสอบรองรับข้อกล่าวอ้างที่มีน้ำหนักต่างกัน ระดับเมสเซนเจอร์ RNA ของ PGC-1alpha หรือ TFAM ที่สูงขึ้นแสดงว่ามีคำสั่งให้เริ่มโปรแกรม ไม่ใช่ว่าโปรแกรมเสร็จสมบูรณ์แล้ว mtDNA หรือโปรตีนคอมเพล็กซ์ IV ที่เพิ่มขึ้นแสดงว่ามีองค์ประกอบมากขึ้น แต่ไมโทคอนเดรียที่ผ่านการปรับโครงสร้างก็อาจให้ภาพแบบเดียวกันได้ การหายใจที่ดีขึ้น การใช้ออกซิเจนที่สูงขึ้น หรือกิจกรรมของคอมเพล็กซ์ที่เพิ่มขึ้นแสดงว่าการทำงานเปลี่ยนไป แต่การทำงานอาจดีขึ้นได้โดยไม่เกิดไมโทคอนเดรียใหม่เลย ข้อกล่าวอ้างเรื่องการสร้างไมโทคอนเดรียใหม่ที่มีหลักฐานหนักแน่นต้องรวมทั้งสามด้าน ได้แก่ ตัวควบคุม ปริมาณองค์ประกอบ และการทำงาน

การศึกษาติดตามในเซลล์ไฟโบรบลาสต์ตรวจสอบลำดับนี้เกือบครบ ในเซลล์มนุษย์ IMR90 ที่ได้รับเมทิลีนบลู 100 nanomolar อัตราส่วน NAD ต่อ NADH เพิ่มขึ้นชั่วคราวภายใน 15 นาที และกลับสู่ระดับพื้นฐานภายในหนึ่งวัน สัญญาณพลังงานชั่วคราวนี้ตามมาด้วยการเติมหมู่ฟอสเฟตชั่วคราวให้ AMPK ซึ่งเป็นตัวตรวจจับพลังงาน จากนั้นจึงเกิดการเหนี่ยวนำ PGC-1alpha และ SURF1 ซึ่งเป็นโปรตีนที่จำเป็นต่อการประกอบคอมเพล็กซ์ IV ให้ทำงานได้ กิจกรรมของคอมเพล็กซ์ IV เพิ่มขึ้นประมาณสองเท่า สารออกซิไดซ์ในเซลล์ลดลงประมาณ 28 เปอร์เซ็นต์ และเทโลเมียร์สั้นลงช้ากว่าเดิม ลำดับเหตุการณ์ทั้งหมดอธิบายไว้ในบทความวิจัยที่เชื่อมโยงกิจกรรมรีดอกซ์ของเมทิลีนบลูกับ AMPK และการสร้างไมโทคอนเดรียใหม่

รายละเอียดสองข้อในบทความวิจัยนั้นควรได้รับความสนใจ เพราะเป็นรายละเอียดประเภทที่มักถูกละทิ้ง ข้อแรก รูปแบบการกระตุ้นสำคัญกว่าการมีการกระตุ้นเพียงอย่างเดียว เมทิลีนบลูกระตุ้น AMPK ชั่วคราว ขณะที่ยาอ้างอิง AICAR กระตุ้นอย่างต่อเนื่อง และตัวกระตุ้นแบบชั่วคราวชะลอภาวะชราของเซลล์ได้มีประสิทธิภาพมากกว่าประมาณแปดเท่า ดังนั้น ข้อกล่าวอ้างในรูปแบบว่า “เมทิลีนบลูกระตุ้น AMPK” จึงยังไม่ครบถ้วน ข้อกล่าวอ้างที่ตรงประเด็นคือสารนี้กระตุ้น AMPK ชั่วคราว และผลเปรียบเทียบชี้ว่าการกระตุ้นอย่างต่อเนื่องไม่ได้ให้ผลแบบเดียวกัน ข้อที่สอง เมทิลีนบลูไม่ได้เปลี่ยนแปลงวัฏจักรเซลล์ จึงตัดคำอธิบายทางเลือกที่เรียบง่ายที่สุดออกไปได้ นั่นคือเซลล์เพียงแค่แบ่งตัวช้าลงและจึงดูอ่อนวัยกว่า

งานวิจัยในหนู: พฤติกรรม จีโนม และตัวกระตุ้นที่จงใจสวนทางกับคำอธิบายทั่วไป

กลุ่มวิจัยที่ศึกษาหนูวัยกลางได้นำงานเพาะเลี้ยงเซลล์ไปต่อยอดในสัตว์ หลังได้รับเมทิลีนบลูทางปากเป็นเวลา 60 วัน หนูที่ได้รับสารยังคงรักษาความทนทานทางกายและพฤติกรรมสำรวจไว้ได้มากกว่า และแสดงพฤติกรรมคล้ายความวิตกกังวลน้อยกว่าหนูสูงวัยที่ไม่ได้รับสาร ในเนื้อเยื่อสมอง ยีนที่ถูกกดการแสดงออกจากความชรา ได้แก่ NRF1, TFAM, SOD2 และ COX1 ซึ่งเป็นหน่วยย่อยของคอมเพล็กซ์ IV กลับมาแสดงออกใกล้ระดับของหนูวัยโตเต็มวัย และจำนวนสำเนา mtDNA เพิ่มขึ้น ผลเหล่านี้ ซึ่งประกอบด้วยพฤติกรรม ตัวควบคุม และปริมาณจีโนม รายงานไว้ในการศึกษาเมทิลีนบลูและการสร้างไมโทคอนเดรียใหม่ในสมองของหนูวัยกลาง

ตัวกระตุ้นที่ผู้วิจัยเสนอเป็นส่วนที่น่าสนใจ เพราะสวนทางกับคำอธิบายง่าย ๆ ที่ว่าเมทิลีนบลูเป็นสารต้านอนุมูลอิสระ หนูที่ได้รับสารมีการสร้างสารออกซิเจนที่ไวต่อปฏิกิริยาในไมโทคอนเดรียของสมองเพิ่มขึ้น โดยเฉพาะไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ข้อเสนอของผู้เขียนคือ สัญญาณเปอร์ออกไซด์ระดับเล็กน้อยเป็นสิ่งที่กระตุ้นวิถี Nrf2 ซึ่งต่อมาขับเคลื่อนโปรแกรมการสร้างไมโทคอนเดรียใหม่ ในแบบจำลองนี้ เมทิลีนบลูส่งเสริมการเกิดออกซิเดชันในขั้นกระตุ้น และให้ผลต้านออกซิเดชันในขั้นผลลัพธ์ เป็นรูปแบบที่นักเภสัชวิทยาเรียกว่า hormesis ซึ่งความเครียดเล็กน้อยกระตุ้นการป้องกันที่มีขนาดมากกว่าความเครียดนั้นเอง อย่างไรก็ตาม ยังไม่ได้ทดสอบโดยตรงว่าการเพิ่มขึ้นของเปอร์ออกไซด์เป็นสาเหตุของการกระตุ้น Nrf2 จริงหรือไม่ นี่จึงเป็นสะพานเชื่อมที่เสนอขึ้น ไม่ใช่ความเชื่อมโยงที่วัดได้

การศึกษาอีกชิ้นที่เกี่ยวข้องจากกลุ่มเดียวกันได้ทดสอบด้านความปลอดภัยของข้อเสนอนี้อย่างเข้มข้น ในไมโทคอนเดรียที่แยกจากสมอง เมทิลีนบลูเพิ่มการผลิตไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่ความเข้มข้นต่ำเพียง 50 nanomolar แต่ความเข้มข้นระดับที่ใช้ในการรักษาไม่ทำให้เกิดความเสียหายต่อ DNA ของไมโทคอนเดรียที่ตรวจพบได้ พบความเสียหายในชิ้นส่วน mtDNA บางส่วนเฉพาะที่ 100 micromolar ซึ่งสูงกว่าระดับที่ใช้ในการรักษามาก และเมื่อใช้สารสี 20 micromolar ร่วมกับแสงสีแดง จะเกิดออกซิเจนซิงเกลตที่ทำลาย mtDNA ในวงกว้าง ซึ่งเป็นพฤติกรรมการเป็นสารไวแสงของสารสีที่ทราบกันอยู่แล้ว ไม่ใช่ฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาในสภาวะไม่มีแสง การให้สารล่วงหน้ายังช่วยปกป้องไมโทคอนเดรียในสมองส่วนกลางด้านท้องจากรอยเสียหายของ mtDNA ที่เกิดจากโรเทโนนด้วย รายละเอียดการตอบสนองต่อขนาดสารและชุดควบคุมความเป็นพิษต่อสารพันธุกรรมอยู่ในการศึกษาการผลิตเปอร์ออกไซด์ของเมทิลีนบลูโดยไม่ก่อความเป็นพิษต่อสารพันธุกรรม

สิ่งที่วัดได้กับสิ่งที่เสนอ: อ่านแผนภาพอย่างไร

แผนภาพวิถีด้านล่างจัดทำขึ้นสำหรับบทความนี้เพื่อเน้นการแยกแยะที่เนื้อหาอธิบายมา กล่องเส้นขอบทึบคือขั้นตอนที่มีหลักฐานการทดลองโดยตรงในงานวิจัยเกี่ยวกับเมทิลีนบลู ได้แก่ การหมุนเวียนรีดอกซ์ที่เปลี่ยน NAD/NADH การเติมหมู่ฟอสเฟตชั่วคราวให้ AMPK การเหนี่ยวนำ PGC-1alpha และ SURF1 กิจกรรมของคอมเพล็กซ์ IV ที่สูงขึ้น การเหนี่ยวนำ NQO1 และ TrxR1 การฟื้นระดับการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างไมโทคอนเดรียใหม่และจำนวนสำเนา mtDNA ในสมองหนู และการเพิ่มขึ้นของเปอร์ออกไซด์โดยไม่มีความเสียหายต่อ mtDNA ที่ขนาดสารระดับที่ใช้ในการรักษา กล่องเส้นขอบประคือความเชื่อมโยงที่เสนอ ได้แก่ การตรวจจับสัญญาณเปอร์ออกไซด์โดย Keap1 การสะสมของ Nrf2 ในนิวเคลียสที่ขับเคลื่อนยีนป้องกันเซลล์ และลูกศรแสดงความเป็นเหตุเป็นผลจากการกระตุ้น Nrf2 ไปสู่โปรแกรมการสร้างไมโทคอนเดรียใหม่ ขั้นตอนเส้นประเหล่านี้มีความเป็นไปได้ สอดคล้องกับข้อมูล และเป็นชีววิทยามาตรฐานตามตำรา แต่ในบทความวิจัยเหล่านี้ ยังไม่ได้วัดขั้นตอนดังกล่าวพร้อมชุดควบคุม เช่น Nrf2 ในนิวเคลียส ตัวรายงาน ARE และการตัดยีน Nrf2 ออก ซึ่งจะทำให้ยกระดับเป็นกล่องเส้นทึบได้

เมื่อเห็นแผนภาพตรงหน้า ความสับสนสามอย่างจะชัดเจนขึ้น อย่างแรก NRF1 และ Nrf2 เป็นโปรตีนคนละชนิดที่มีชื่อเกือบเหมือนกัน การศึกษาในหนูวัด nuclear respiratory factor 1 ซึ่งเป็นตัวควบคุมการสร้างไมโทคอนเดรียใหม่ ไม่ใช่ปัจจัยควบคุมการถอดรหัสด้านการต้านอนุมูลอิสระ และการเหมารวมทั้งสองเข้าด้วยกันจะยุบแผนภาพทั้งหมดให้เหลือเพียงจุดเดียว อย่างที่สอง การแสดงออกของยีนเป็นจุดเริ่มต้นของเรื่อง ไม่ใช่จุดจบ ระดับเมสเซนเจอร์ RNA ของ TFAM หรือ COX1 ที่ฟื้นกลับมาสนับสนุนว่ามีคำสั่งให้สร้างไมโทคอนเดรียใหม่ ส่วนจำนวนสำเนา mtDNA และกิจกรรมของคอมเพล็กซ์ IV เป็นหลักฐานว่าคำสั่งนั้นได้รับการดำเนินการแล้ว อย่างที่สาม ผลลัพธ์ด้านการต้านอนุมูลอิสระไม่ได้พิสูจน์ว่าเกิดผ่านวิถี Nrf2 การลดลงของสารออกซิไดซ์ 28 เปอร์เซ็นต์ในเซลล์ไฟโบรบลาสต์และการป้องกันผลจากโรเทโนนในหนูเป็นผลปลายทางที่เกิดขึ้นจริง แต่หลายวิถีสามารถนำไปสู่ผลเหล่านี้ได้

อะไรจะทำให้กล่องเส้นประกลายเป็นเส้นทึบ

การทดลองที่ยังขาดอยู่เป็นการทดลองมาตรฐาน การวัดโปรตีน Nrf2 ในนิวเคลียสหลังสัมผัสเมทิลีนบลู โดยติดตามตามช่วงเวลาที่สอดคล้องกับสัญญาณ AMPK ชั่วคราว จะทดสอบได้ว่าสองแขนงนี้ถูกกระตุ้นพร้อมกันจริงหรือไม่ ตามที่สมมติฐานการกระตุ้นอย่างประสานกันเสนอ ตัวรายงานที่ขับเคลื่อนด้วย ARE จะยืนยันกิจกรรมการถอดรหัส แทนการอนุมานจากยีนเป้าหมาย การวัดตัวชี้วัดการสร้างไมโทคอนเดรียใหม่ซ้ำหลังลดการแสดงออกหรือตัดยีน Nrf2 ออกจะทดสอบลูกศรเชิงเหตุและผลได้โดยตรง หากการเหนี่ยวนำคอมเพล็กซ์ IV และการเพิ่มขึ้นของ mtDNA ยังคงเกิดขึ้นโดยไม่มี Nrf2 สะพานเชื่อมดังกล่าวก็ไม่ถูกต้อง และแขนง AMPK เป็นตัวทำให้เกิดผลเพียงลำพัง ในด้านการทดลองสัตว์ การศึกษาที่ให้สารต่อเนื่องระยะยาวและตรวจสอบจุดตรวจทั้งสาม ได้แก่ ตัวควบคุม ปริมาณองค์ประกอบ และการทำงาน จะทดสอบได้ว่าโปรแกรมยังคงทำงานต่อไปหรือเกิดการปรับตัว จนกว่าจะมีหลักฐานเหล่านั้น การกระตุ้นวิถีพลังงานและวิถีป้องกันอย่างประสานกันยังคงเป็นสิ่งที่ผู้เขียนเรียกไว้ นั่นคือปัจจัยสำคัญที่เป็นไปได้ ไม่ใช่กลไกที่ได้รับการยืนยันแล้ว

ผู้อ่านที่มาจากมุมมองทางเภสัชวิทยาที่กว้างกว่าอาจต้องการบริบทโดยรอบ ได้แก่ เมทิลีนบลูถ่ายโอนอิเล็กตรอนในระดับไมโทคอนเดรียอย่างไร สารนี้มีผลอื่นใดต่อไมโทคอนเดรียและพลังงานของเซลล์ ผลการศึกษาเรื่องภาวะชราของเซลล์อยู่ตรงไหนในงานวิจัยด้านความชรา ข้อกล่าวอ้างเรื่องการสร้างไมโทคอนเดรียใหม่สัมพันธ์กับสมรรถนะการรู้คิดอย่างไร และข้อมูลความปลอดภัยที่กำหนดขอบเขตของการอภิปรายเรื่องขนาดสารทุกครั้ง แต่ละเรื่องเป็นแนวคิดแยกกันที่มีหลักฐานของตนเอง และแต่ละเรื่องสมควรได้รับการแยกแยะระหว่างสิ่งที่วัดได้กับสิ่งที่เสนอ เช่นเดียวกับที่บทความนี้ทำกับ Nrf2