เมทิลีนบลูกับไนตริกออกไซด์: NOS, cGMP และการส่งสัญญาณในหลอดเลือด

คำถามนี้ฟังดูเรียบง่าย: เมทิลีนบลูยับยั้งไนตริกออกไซด์หรือไม่? แต่ในห้องปฏิบัติการ คำตอบแยกออกเป็นคำถาม 4 ข้อ และแต่ละข้อมีวิธีทดสอบเชิงทดลองต่างกัน การสับสนระหว่างคำถามเหล่านี้เป็นสาเหตุหลักที่ทำให้งานเขียนเกี่ยวกับเมทิลีนบลูกับไนตริกออกไซด์ดูมั่นใจแต่คลุมเครือ

ลองมองสัญญาณไนตริกออกไซด์เป็นห่วงโซ่ที่มี 4 ข้อ ยีนถูกถอดรหัสเพื่อสร้างเอนไซม์ไนตริกออกไซด์ซินเทส เอนไซม์เปลี่ยนอาร์จินีนเป็นไนตริกออกไซด์ ก๊าซนี้แพร่ไปถึงเป้าหมายก่อนจะทำปฏิกิริยากับสารอื่น กัวนิลเลตไซเคลสชนิดละลายน้ำตรวจรับก๊าซนี้และสร้างไซคลิก GMP มีงานตีพิมพ์รายงานผลของเมทิลีนบลูต่อห่วงโซ่ทุกข้อ แต่หลักฐานมาจากระบบทดลอง ความเข้มข้น และไอโซฟอร์มที่แตกต่างกัน ผลที่พบในห่วงโซ่ข้อหนึ่งไม่ได้พิสูจน์ว่ามีการออกฤทธิ์ในอีกข้อหนึ่ง

ลำดับขั้นมาตรฐาน อธิบายอย่างตรงไปตรงมา

ในผนังหลอดเลือด ลำดับขั้นมาตรฐานดำเนินไปดังนี้ สิ่งเร้ากระตุ้นเซลล์เยื่อบุหลอดเลือด เอนไซม์ไนตริกออกไซด์ซินเทสของเซลล์เยื่อบุหลอดเลือด ซึ่งเรียกว่า eNOS หรือ NOS3 สร้างไนตริกออกไซด์ปริมาณเล็กน้อยเป็นช่วงสั้น ๆ ก๊าซนี้แพร่เข้าสู่เซลล์กล้ามเนื้อเรียบที่อยู่ข้างเคียง จับกับฮีมที่มีเหล็กในสถานะรีดิวซ์ของกัวนิลเลตไซเคลสชนิดละลายน้ำ และเร่งการเปลี่ยน GTP เป็นไซคลิก GMP ไซคลิก GMP กระตุ้นโปรตีนไคเนส G การจัดการแคลเซียมเปลี่ยนไป และกล้ามเนื้อคลายตัว

ยังมีห่วงโซ่อีกแบบหนึ่งที่ควรแยกพิจารณา ระหว่างการติดเชื้อหรือการสัมผัสไซโตไคน์ เซลล์จะถอดรหัสยีนของเอนไซม์อีกชนิดหนึ่ง คือไนตริกออกไซด์ซินเทสชนิดเหนี่ยวนำ หรือ iNOS ซึ่งเรียกอีกชื่อว่า NOS2 เอนไซม์นี้สร้างไนตริกออกไซด์ด้วยอัตราที่สูงกว่าและต่อเนื่องนานกว่า eNOS ส่วนไอโซฟอร์มที่สาม คือ NOS ของเซลล์ประสาท หรือ nNOS อยู่ในอีกบริบทหนึ่ง เมื่อบทความวิจัยกล่าวถึงไนตริกออกไซด์ซินเทสโดยไม่ระบุไอโซฟอร์ม ให้หยุดตรวจสอบก่อนว่าวัดชนิดใด บทความภาพรวมเกี่ยวกับการเคลื่อนย้ายอิเล็กตรอนของเมทิลีนบลูชี้ประเด็นเดียวกันนี้สำหรับเป้าหมายรีดอกซ์โดยทั่วไป: ตัวส่งต่อไม่ได้ทำงานได้เองโดยลำพัง และคู่ปฏิกิริยาที่ปลายแต่ละด้านเป็นตัวกำหนดผลลัพธ์

ค่าไซคลิก GMP ที่วัดได้ยังเป็นค่าที่สะท้อนผลรวมของหลายกระบวนการ ไม่ใช่การทดสอบเอนไซม์โดยตรง ระดับของมันสะท้อนการสังเคราะห์โดยไซเคลสหักลบด้วยการสลายโดยฟอสโฟไดเอสเทอเรส โดยเฉพาะ PDE5 ในกล้ามเนื้อเรียบของหลอดเลือด ดังนั้น การลดลงของไซคลิก GMP จึงหมายถึงมีสัญญาณไปถึงตัวตรวจรับน้อยลง แต่เพียงค่านี้อย่างเดียวไม่ได้ระบุว่าห่วงโซ่ข้อใดล้มเหลว

ข้อที่ 1: มีการสร้างเอนไซม์ iNOS น้อยลง

ในแมคโครฟาจของหนูเมาส์ที่ถูกกระตุ้นด้วยไลโปพอลิแซ็กคาไรด์จากแบคทีเรีย อินเตอร์เฟอรอนแกมมา หรือทั้งสองอย่าง เมทิลีนบลูป้องกันการเพิ่มขึ้นของโปรตีน iNOS ที่คาดว่าจะเกิด และกดระดับอาร์เอ็นเอนำรหัสของ iNOS อย่างมากในการทดลองการถอดรหัสในแมคโครฟาจ ส่วนที่ให้ข้อมูลสำคัญคือสิ่งที่ไม่เปลี่ยนแปลง การสลายของตัวยับยั้ง I kappa B alpha การเติมหมู่ฟอสเฟตให้ NF kappa B และ STAT1 และการเคลื่อนย้ายปัจจัยเหล่านี้เข้าสู่นิวเคลียสยังคงเกิดขึ้นเป็นส่วนใหญ่ สิ่งที่ลดลงคือการจับกับดีเอ็นเอ ซึ่งยืนยันด้วยการตกตะกอนโครมาตินด้วยภูมิคุ้มกันที่แสดงว่ามีการจับบริเวณโปรโมเตอร์ของ iNOS ลดลง

นี่เป็นผลต่อการควบคุมยีนที่อยู่ต้นน้ำของปริมาณเอนไซม์ ไม่ใช่การยับยั้งเอนไซม์ที่มีอยู่แล้วอย่างเฉียบพลัน ผลนี้อยู่ในบริบทของการส่งสัญญาณการอักเสบ ซึ่งปัจจัยการถอดรหัสต้องจับกับโปรโมเตอร์ก่อนที่โปรตีนจะปรากฏขึ้น ผลนี้ไม่ได้บอกอะไรโดยตรงเกี่ยวกับ eNOS ที่แสดงออกเป็นพื้นฐานในหลอดเลือดขณะพัก และควรอธิบายโดยรักษาขอบเขตดังกล่าวไว้

ข้อที่ 2: เอนไซม์ NOS ที่มีอยู่ทำงานช้าลง

การศึกษาในหนูแรตทดสอบในอีกระดับหนึ่ง หนูแรตเพศผู้ที่รู้สึกตัวได้รับไลโปพอลิแซ็กคาไรด์ทางหลอดเลือดดำ จากนั้นอีกสามชั่วโมงได้รับน้ำเกลือหรือเมทิลีนบลูขนาด 3 mg per kg ทางหลอดเลือดดำ และวัดกิจกรรมของไนตริกออกไซด์ซินเทสในไฮโปทาลามัสส่วนฐานด้านกลางจากการเปลี่ยนอาร์จินีนที่ติดฉลากเป็นซิทรูลลีนในการศึกษากิจกรรม NOS ในไฮโปทาลามัส ความเครียดร่วมกับน้ำเกลือเพียงอย่างเดียวเหนี่ยวนำกิจกรรมบางส่วนที่ไม่ขึ้นกับแคลเซียม และไลโปพอลิแซ็กคาไรด์เพิ่มกิจกรรมดังกล่าวเป็นประมาณสิบเท่าของระดับกลุ่มควบคุม เมทิลีนบลูทำให้กิจกรรมที่ถูกเหนี่ยวนำทั้งสองส่วนหายไป กิจกรรมพื้นฐานที่ขึ้นกับแคลเซียมไม่เปลี่ยนแปลงในเนื้อเยื่อนั้น ณ ขนาดและเวลาที่ทดสอบ

อ่านผลนี้ตามที่รายงานอย่างเคร่งครัด: กิจกรรมแบบ iNOS ที่วัดได้ถูกกดภายใต้เงื่อนไขเหล่านั้น นี่ไม่ใช่การวัดการแสดงออกของยีน และไม่ใช่หลักฐานว่ามีความจำเพาะต่อ iNOS มากกว่า eNOS หรือ nNOS อย่างถาวร งานทดลองกับเอนไซม์บริสุทธิ์ยิ่งเน้นให้ต้องระวัง ในการทดสอบไนตริกออกไซด์ซินเทสบริสุทธิ์โดยตรง เมทิลีนบลูยับยั้งการสร้างซิทรูลลีนได้ทั้งหมดที่ 30 micromolar โดยมีความเข้มข้นที่ยับยั้งได้ครึ่งหนึ่งอยู่ใกล้ 5.3 micromolar เมื่อไม่มีซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทส และ 9.2 micromolar เมื่อมีเอนไซม์นี้ ตามรายงานในการเปรียบเทียบ NOS บริสุทธิ์กับกัวนิลเลตไซเคลส การศึกษาอีกชิ้นที่ใช้ nNOS บริสุทธิ์ชี้ว่าการออกซิเดชันของฮีมที่จับกับเอนไซม์มีส่วนเกี่ยวข้อง ข้อสรุปที่ใช้ในการตีความคือ การยับยั้ง NOS โดยตรงเกิดขึ้นจริงในระบบที่แยกออกมาศึกษา แต่ไม่อาจขยายผลจากไฮโปทาลามัสไปเป็นข้อกล่าวอ้างทั่วไปว่าเมทิลีนบลูไม่กระทบ NOS ชนิดพื้นฐานทุกชนิดในทุกบริเวณ

ข้อที่ 3: ไนตริกออกไซด์สูญเสียไปก่อนถึงเป้าหมาย

หลักฐานที่ชัดเจนที่สุดว่ากลไกอื่นนอกเหนือจากการยับยั้งเอนไซม์สามารถอธิบายการลดลงของไซคลิก GMP ได้ มาจากเซลล์กล้ามเนื้อเรียบของหลอดเลือดแดงปอดกระต่ายที่เพาะเลี้ยง การออกแบบการทดลองข้ามขั้นตอน NOS ภายในเซลล์ไปทั้งหมด โดยเติมสารให้ไนตริกออกไซด์โดยตรง แล้วทดสอบว่าเมทิลีนบลูยังคงกดการตอบสนองของไซคลิก GMP หรือไม่ ในการศึกษาซูเปอร์ออกไซด์ในกล้ามเนื้อเรียบของหลอดเลือด

มีการทดสอบสารให้ไนตริกออกไซด์สามชนิดที่ความเข้มข้น 1 ถึง 100 micromolar ได้แก่ เอสไนโตรโซแอลซิสเทอีน โซเดียมไนโตรปรัสไซด์ และสารอนาล็อกที่กำจัดหมู่อะมิโนแล้วและมีความเสถียรชื่อ MPANO ทั้งหมดเพิ่มไซคลิก GMP ประมาณ 1.5 เท่าถึง 12 เท่า เมทิลีนบลูที่ 10 micromolar ยับยั้งการตอบสนองต่อสารสองชนิดแรกได้ 51 ถึง 100 เปอร์เซ็นต์ แต่ไม่เปลี่ยนแปลงการตอบสนองต่อ MPANO หากเมทิลีนบลูเพียงแค่ยับยั้งบริเวณเร่งปฏิกิริยาของไซเคลส ความแตกต่างตามชนิดของสารให้นี้จะอธิบายได้ยาก เพราะทั้งสามชนิดส่งผลไปยังเอนไซม์ตัวเดียวกันในขั้นปลายน้ำ

จากนั้น การทดลองควบคุมสามแบบระบุว่ากลไกนี้เกี่ยวข้องกับซูเปอร์ออกไซด์ แบบแรก การสร้างซูเปอร์ออกไซด์นอกเซลล์ด้วยแซนทีนร่วมกับแซนทีนออกซิเดสให้ผลรูปแบบเดียวกัน คือยับยั้งการตอบสนองต่อ CYSNO และไนโตรปรัสไซด์ แต่ไม่กระทบ MPANO แบบที่สอง เมทิลีนบลูทำให้เซลล์กล้ามเนื้อเรียบผลิตซูเปอร์ออกไซด์โดยขึ้นกับขนาดและเวลา ซึ่งวัดจากการรีดิวซ์ไซโตโครม c แบบที่สาม ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทสป้องกันการยับยั้งได้ทั้งหมด แต่คะตาเลสทำไม่ได้ ซึ่งชี้ว่าซูเปอร์ออกไซด์ ไม่ใช่ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ เป็นชนิดสารที่ก่อผลโดยตรงในระบบทดลองนั้น

การทดลองแบบเพาะเลี้ยงร่วมควรกล่าวถึง เพราะช่วยระบุตำแหน่งที่เกิดผล เซลล์เยื่อบุหลอดเลือดบนแผ่นปิดสไลด์ถูกเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์กล้ามเนื้อเรียบเป็นเวลาสั้น ๆ ทำให้ปัจจัยที่เซลล์เยื่อบุหลอดเลือดปล่อยออกมาในภาวะพื้นฐานเพิ่มไซคลิก GMP ในกล้ามเนื้อเรียบเป็นสามถึงแปดเท่า การให้เมทิลีนบลูกับเซลล์ส่วนใดส่วนหนึ่งล่วงหน้าลดสัญญาณนี้ และซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทสช่วยกู้คืนผลจากการให้เมทิลีนบลูกับเซลล์เยื่อบุหลอดเลือดล่วงหน้าได้บางส่วน กล่าวอีกอย่างคือ เมทิลีนบลูไม่จำเป็นต้องออกฤทธิ์ภายในเซลล์กล้ามเนื้อเรียบที่ทำหน้าที่ตรวจรับเลย มันสามารถลดสัญญาณโดยกำจัดตัวส่งสารระหว่างทาง คู่มือการอ่านงานวิจัยเมทิลีนบลูถือว่านี่เป็นหลักทั่วไป: ระบุส่วนของระบบที่ได้รับการแทรกแซงก่อนระบุเป้าหมายระดับโมเลกุล

การเรียกผลนี้ว่าการยับยั้ง NOS จึงไม่ถูกต้อง สารให้ไนตริกออกไซด์เหล่านี้ไม่ต้องอาศัยขั้นตอนของเอนไซม์ซินเทสเพื่อออกฤทธิ์ แต่สัญญาณก็ยังลดลง

ข้อที่ 4: ตัวตรวจรับเองตอบสนองน้อยลง

เมทิลีนบลูมีผลโดยตรงต่อกัวนิลเลตไซเคลสชนิดละลายน้ำจริง แต่ความเข้มข้นมีความสำคัญ ในการเปรียบเทียบเอนไซม์บริสุทธิ์ที่อ้างถึงข้างต้น ไซเคลสที่ถูกกระตุ้นด้วยไนตริกออกไซด์ต้องใช้เมทิลีนบลูประมาณ 60 micromolar จึงถูกยับยั้งได้ครึ่งหนึ่ง เทียบกับ NOS ที่ถูกยับยั้งได้ครึ่งหนึ่งที่ประมาณ 5 ถึง 9 micromolar และแม้ที่ 1 millimolar การยับยั้งสูงสุดก็ยังเกิดได้เพียงบางส่วน นั่นคือความเข้มข้นต่างกันประมาณหกถึงสิบเอ็ดเท่า ดังนั้น การทดลองในเซลล์ที่ใช้ความเข้มข้นระดับ micromolar ต่ำแล้วพบไซคลิก GMP ลดลง จึงไม่อาจเรียกว่าเป็นการยับยั้งไซเคลสอย่างจำเพาะโดยอาศัยค่าไซคลิก GMP เพียงอย่างเดียว

การศึกษารีดอกซ์ในภายหลังเพิ่มข้อควรระวังอีกประการ: เมทิลีนบลูทำให้ไซเคลสที่ถูกกระตุ้นด้วยไนตริกออกไซด์สูญเสียกิจกรรมผ่านกลไกที่ต่างจากการออกซิเดชันของเหล็กในฮีมด้วยอากาศอย่างง่าย ดังนั้น ตัวตรวจรับอาจทำงานบกพร่องได้ แต่รายละเอียดทางเคมียังไม่เป็นข้อยุติ และช่องว่างของความเข้มข้นนี้หมายความว่า เมื่อใช้ความเข้มข้นระดับ micromolar ต่ำ ควรตัดความเป็นไปได้ของผลจากซูเปอร์ออกไซด์และ NOS ออกก่อน นี่เป็นจุดที่ต้องมีการควบคุมผลของฟอสโฟไดเอสเทอเรสด้วย หากไม่ได้วัดหรือยับยั้งการสลาย การสะสมไซคลิก GMP ที่ลดลงย่อมสอดคล้องได้ทั้งกับการสังเคราะห์ที่น้อยลง การสลายที่เร็วขึ้น หรือทั้งสองอย่าง

เหตุใดจึงสรุปทั้งหมดเป็นข้อกล่าวอ้างเดียวเกี่ยวกับความดันโลหิตไม่ได้

ห่วงโซ่แต่ละข้อได้รับการยืนยันในระบบที่ต่างกัน การถอดรหัสในแมคโครฟาจไม่ใช่กิจกรรมของเอนไซม์ในไฮโปทาลามัส กิจกรรมในไฮโปทาลามัสหลังได้รับไลโปพอลิแซ็กคาไรด์ไม่ใช่ภาวะตึงตัวของหลอดเลือดที่ควบคุมโดยเยื่อบุหลอดเลือดขณะพัก ปัจจัยที่เซลล์เยื่อบุหลอดเลือดปล่อยออกมาในภาวะพื้นฐานระหว่างการเพาะเลี้ยงร่วมไม่ใช่การขยายหลอดเลือดที่ถูกกระตุ้นด้วยสารกระตุ้นตัวรับ เซลล์หลอดเลือดแดงปอดที่เพาะเลี้ยงและได้รับเมทิลีนบลู 10 micromolar ไม่ใช่ระบบไหลเวียนเลือดของมนุษย์ การรวมทั้งหมดเป็นข้อความทำนองว่าเมทิลีนบลูเพิ่มความดันโลหิตโดยยับยั้งไนตริกออกไซด์ เท่ากับทิ้งความแตกต่างที่การทดลองควบคุมถูกออกแบบมาเพื่อรักษาไว้อย่างเฉพาะเจาะจง

การตรวจสอบสามข้อช่วยให้คำอธิบายตรงตามหลักฐาน ข้อแรก ระบุไอโซฟอร์ม: eNOS สำหรับภาวะตึงตัวของหลอดเลือดขณะพัก iNOS สำหรับการสร้างไนตริกออกไซด์ที่ถูกเหนี่ยวนำในภาวะอักเสบ และ nNOS สำหรับบริบทของเซลล์ประสาทและการทดลองเอนไซม์บริสุทธิ์บางงาน ข้อที่สอง ระบุว่าสัญญาณไนตริกออกไซด์มาจากไหน: การสังเคราะห์ภายในระบบ การปล่อยจากเยื่อบุหลอดเลือดในภาวะพื้นฐาน หรือสารให้ชนิดใดชนิดหนึ่ง เช่น CYSNO ไนโตรปรัสไซด์ หรือ MPANO เพราะสารให้ที่เสถียรไม่ถูกเมทิลีนบลูยับยั้ง แต่สารให้ที่ไม่เสถียรถูกยับยั้ง ข้อที่สาม ระบุความเข้มข้นและการกู้คืนผล: การกู้คืนด้วยซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทสชี้ว่าซูเปอร์ออกไซด์มีส่วนเกี่ยวข้อง การที่คะตาเลสไม่ช่วยกู้คืนเป็นหลักฐานคัดค้านบทบาทของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ในระบบทดลองนั้น การเลียนแบบผลด้วยแซนทีนออกซิเดสแสดงว่ากลไกนี้เพียงพอที่จะก่อผล และการทดสอบเอนไซม์บริสุทธิ์แยกผลต่อการเร่งปฏิกิริยาโดยตรงออกจากการสูญเสียสัญญาณระหว่างทาง

ข้อสรุปอย่างย่อคือ ควรมองเมทิลีนบลูเป็นสารที่รบกวนการส่งสัญญาณจากไนตริกออกไซด์ไปสู่ไซคลิก GMP ได้หลายตำแหน่ง มากกว่าจะมองเป็นตัวยับยั้งไซเคลสอย่างจำเพาะ เมทิลีนบลูสามารถลดการจับของปัจจัยการถอดรหัสของ iNOS ยับยั้งเอนไซม์ NOS โดยตรง ลดความพร้อมของไนตริกออกไซด์ผ่านการสร้างซูเปอร์ออกไซด์ และทำให้ไซเคลสที่ถูกกระตุ้นด้วยไนตริกออกไซด์ทำงานบกพร่อง ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับระบบทดลองและความเข้มข้น บทความเรื่องบทบาทของการส่งสัญญาณไซคลิก GMP ในการศึกษาหลอดเลือด และการเปรียบเทียบสารให้ไนตริกออกไซด์ที่ใช้ในการทดสอบเซลล์ ต่างอธิบายรายละเอียดเพิ่มเติมของหนึ่งในแขนงเหล่านั้น ส่วนบทความเรื่องวิธีที่ใช้แยกผลรีดอกซ์ออกจากผลต่อเอนไซม์ อธิบายว่าเหตุใดจึงพบการใช้ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทส คะตาเลส และสารให้ที่เสถียรเป็นชุดควบคุมร่วมกันอยู่บ่อยครั้งในงานวิจัยกลุ่มนี้

ค่าไซคลิก GMP ที่ต่ำหลังได้รับเมทิลีนบลูบ่งชี้ว่าห่วงโซ่ขาดลง มีเพียงการทดลองควบคุมเท่านั้นที่บอกได้ว่าข้อใดขาด