การวัดผลของเมทิลีนบลูต่อไมโทคอนเดรีย: ออกซิเจน ATP และศักย์เยื่อหุ้ม

สมมติว่าห้องปฏิบัติการเติมเมทิลีนบลูลงในไมโทคอนเดรียที่มีการหายใจบกพร่อง แล้วพบว่าการใช้ออกซิเจนเพิ่มขึ้น ข้อสรุปที่มักเขียนตามมาคือสีย้อมช่วยฟื้นฟูการทำงานของไมโทคอนเดรีย แต่ข้อสรุปนั้นอาจผิด ฟลักซ์ออกซิเจน การสังเคราะห์ ATP และศักย์เยื่อหุ้มเป็นแนวคิดที่แตกต่างกันสามอย่าง ทั้งสามเกิดขึ้นในออร์แกเนลล์เดียวกัน เช่นเดียวกับการสำรองข้อมูล การซิงค์ และการแชร์ที่ใช้โฟลเดอร์บนคลาวด์เดียวกัน กล่าวคือเกี่ยวข้องกัน แต่ทำงานภายใต้กฎต่างกัน หากสับสนว่าสิ่งหนึ่งแทนอีกสิ่งหนึ่งได้ การตีความก็จะผิดพลาด แม้การวัดทุกอย่างจะถูกต้องในทางเทคนิคก็ตาม

เมทิลีนบลูทำให้เกิดความสับสนนี้ได้ง่าย เพราะมันมีส่วนร่วมในระบบที่กำลังวัด มันเป็นสารที่หมุนเวียนในวัฏจักรรีดอกซ์ โดยรับอิเล็กตรอนจากส่วนต้นทางและส่งต่อไปยังส่วนปลายทาง เป็นแคตไอออนที่ชอบไขมันซึ่งสะสมในไมโทคอนเดรียที่มีพลังงาน และเป็นสารสีน้ำเงินเข้มที่ดูดกลืนและปล่อยแสงในช่วงเดียวกับโพรบที่ใช้กันทั่วไป ค่าที่อ่านได้เพียงค่าเดียวจึงไม่อาจรองรับความซับซ้อนทั้งหมดนี้ แนวทางที่เชื่อถือได้ ซึ่งปรากฏในงานศึกษาไมโทคอนเดรียจากบูดาเปสต์ คือวัดฟลักซ์ออกซิเจนร่วมกับอัตราการสังเคราะห์ ATP ศักย์เยื่อหุ้ม และการปล่อยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ โดยมีชุดควบคุมเฉพาะสำหรับสีย้อมในทุกขั้นตอน

การวัดการหายใจวัดฟลักซ์ออกซิเจน ไม่ใช่พลังงานที่ผลิตได้

การวัดการหายใจความละเอียดสูง ไม่ว่าจะใช้ Oroboros Oxygraph หรือเครื่องวิเคราะห์ฟลักซ์นอกเซลล์ Seahorse รายงานเพียงสิ่งเดียว คือออกซิเจนถูกรีดิวซ์เร็วเพียงใด ไม่ได้รายงานว่ามีการสูบโปรตอนกี่ตัวต่ออิเล็กตรอน รักษาความชันทางเคมีไฟฟ้าไว้ได้มากเพียงใด หรือ ATP synthase ใช้ความชันนั้นหรือไม่

การเลือกใช้ศัพท์มีความสำคัญ ในไมโทคอนเดรียที่แยกออกมา การเติมซับสเตรตโดยไม่มี ADP ให้ค่าการหายใจจากการรั่วของโปรตอน การเติมซับสเตรตพร้อม ADP ในระดับอิ่มตัวให้ค่าความสามารถในการเกิดออกซิเดทีฟฟอสโฟรีเลชัน และการไทเทรตสารแยกการควบคู่ให้ค่าความสามารถสูงสุดในการถ่ายโอนอิเล็กตรอน ในเซลล์ที่คงสภาพสมบูรณ์ ค่าที่เทียบเคียงกันของ Seahorse ได้แก่ การหายใจพื้นฐาน การหายใจที่เชื่อมโยงกับ ATP และไวต่อโอลิโกไมซิน การรั่วของโปรตอน การหายใจสูงสุดที่กำหนดด้วย FCCP และการใช้ออกซิเจนนอกไมโทคอนเดรียที่ไม่ถูกยับยั้งด้วยโรทีโนนร่วมกับแอนติไมซิน การเรียกผลจาก Seahorse ว่า State 3 และ State 4 เป็นการอ้างความแม่นยำที่ระบบตัวอย่างนี้ไม่รองรับ ดังที่กรอบการทดสอบ Agilent Mito Stress Testอธิบายไว้อย่างชัดเจน

เมทิลีนบลูทำให้ความเชื่อมโยงที่ดูเป็นธรรมชาติระหว่างออกซิเจนที่ใช้มากขึ้นกับพลังงานที่ได้มากขึ้นใช้ไม่ได้ ในไมโทคอนเดรียที่แยกจากสมองหนูตะเภา สีย้อมความเข้มข้น 100 nM ถึง 1 uM เพิ่มการใช้ออกซิเจนขณะพักเมื่อใช้กลูตาเมตร่วมกับมาเลต ซักซิเนต และแอลฟา-กลีเซอโรฟอสเฟตเป็นซับสเตรต โดยเพิ่มขึ้นประมาณ 64 เปอร์เซ็นต์เมื่อใช้แอลฟา-กลีเซอโรฟอสเฟต แต่การหายใจที่กระตุ้นด้วย ADP ในไมโทคอนเดรียปกติแทบไม่เปลี่ยนแปลง ตามงานศึกษาไมโทคอนเดรียที่แยกจากสมอง เมื่อการหายใจจากการรั่วเพิ่มขึ้น แต่ฟลักซ์ที่กระตุ้นด้วย ADP คงเดิม อัตราส่วนการควบคุมการหายใจที่คำนวณได้จึงลดลง การลดลงนี้ไม่ได้หมายความว่าสีย้อมทำลายไมโทคอนเดรีย แต่หมายความว่าสีย้อมเพิ่มวัฏจักรรีดอกซ์ที่ใช้ออกซิเจนเข้ามานอกเหนือจากการหายใจตามปกติ การทดสอบการใช้ออกซิเจนของเมทิลีนบลูที่รายงานเพียงการเพิ่มขึ้นจึงวัดปฏิกิริยาเคมีที่เกิดขึ้นจริง แต่ไม่ได้บอกอะไรเกี่ยวกับการอนุรักษ์พลังงาน

การทดลองฟื้นฟูการทำงานแสดงช่องว่างเดียวกันในระดับที่มากขึ้น เมื่อยับยั้ง Complex I ฟลักซ์ออกซิเจนฟื้นกลับมาประมาณสามเท่า ขณะที่การสังเคราะห์ ATP ฟื้นกลับมาเพียงประมาณ 1.5 เท่า มีออกซิเจนมาถึงขั้วไฟฟ้ามากขึ้น แต่สัดส่วนที่นำไปสร้าง ATP กลับน้อยกว่า การกล่าวว่าออกซิเดทีฟฟอสโฟรีเลชันดีขึ้นจึงต้องมีข้อมูลฝั่ง ATP ประกอบด้วย โดยควรรายงานเป็นอัตราส่วน ATP ต่อออกซิเจน พร้อมระบุหลักเกณฑ์ที่ใช้กำหนดตัวหาร

การทดสอบ ATP วัดอัตราการสังเคราะห์ ซึ่งปริมาณที่มีอยู่ใช้แทนไม่ได้

การทดสอบ ATP ตอบคำถามอีกข้อหนึ่ง คือมีการสร้าง ATP มากเพียงใดต่อหน่วยเวลา การอ่านค่าแบบจลนศาสตร์ ไม่ว่าจะติดตามการเรืองแสงของลูซิเฟอเรสจากหิ่งห้อยเป็นเวลาหลายนาที หรือใช้การทดสอบแบบเอนไซม์ควบคู่ด้วยเฮกโซไคเนสร่วมกับกลูโคส-6-ฟอสเฟตดีไฮโดรจีเนสที่อ่านค่าที่ 340 nm จะให้ค่าอัตรา ส่วนการวัด ATP รวมเพียงครั้งเดียวเมื่อสิ้นสุดการทดลองให้ค่าปริมาณที่มีอยู่ ซึ่งสะท้อนการสังเคราะห์ลบด้วยการใช้ และเพียงลำพังบอกข้อมูลเกี่ยวกับออกซิเดทีฟฟอสโฟรีเลชันได้น้อยมาก

กลุ่มวิจัยจากบูดาเปสต์ใช้วิธีเอนไซม์ควบคู่โดยยับยั้งอะดีไนเลตไคเนส และพบว่าเมทิลีนบลูที่ 1 ถึง 2 uM เพิ่มการผลิต ATP ในไมโทคอนเดรียที่ได้รับโรทีโนนและแอนติไมซินได้เล็กน้อยแต่มีนัยสำคัญ นี่เป็นการฟื้นฟูที่เกิดขึ้นจริง และเป็นการฟื้นฟูเพียงบางส่วน งานศึกษาความเป็นพิษของ TEGDMAให้ผลในลักษณะเดียวกันในแบบจำลองที่ต่างออกไป โดยมอนอเมอร์ทางทันตกรรม TEGDMA ที่ 5 mM ทำให้การหายใจที่เชื่อมโยงกับ Complex I ลดลงอย่างมากจากประมาณ 286 เหลือ 28 หน่วยฟลักซ์ และสีย้อมที่ 2 uM ช่วยให้กลับขึ้นมาประมาณ 86

มีชุดควบคุมสองอย่างที่ขาดไม่ได้เมื่อใช้สารรีดอกซ์ที่มีสี อย่างแรก ใช้โอลิโกไมซินเพื่อระบุว่าการสังเคราะห์ ATP ที่วัดได้พึ่งพา ATP synthase มากเพียงใด อย่างที่สอง ทดสอบการกู้คืนสารเติมมาตรฐานในระบบที่ไม่มีเซลล์ โดยใช้ ATP ในปริมาณที่ทราบร่วมกับรีเอเจนต์ครบชุดและสีย้อมที่ความเข้มข้นตรงกับที่ใช้จริง อย่างน้อยที่ 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM และ 2 uM สีย้อมอาจดูดกลืนแสงที่ปล่อยออกมา ยับยั้งเอนไซม์รายงานสัญญาณ หรือเปลี่ยนเคมีรีดอกซ์ของรีเอเจนต์ และแนวทางทั่วไปสำหรับการทดสอบลูซิเฟอเรสแนะนำให้ใช้การทดสอบทางชีวเคมีเสริมเพื่อตรวจหาการรบกวนประเภทนี้โดยเฉพาะ อย่าสันนิษฐานว่าที่ 1 uM จะปราศจากสัญญาณรบกวน เพียงเพราะการดับสัญญาณมักรุนแรงกว่าที่ความเข้มข้นสูงกว่า

โพรบวัดศักย์เยื่อหุ้มวัดการกระจายตัวของสีย้อม ไม่ใช่ฟลักซ์

ซาฟรานิน O, TMRM และ TMRE, โรดามีน 123 และ JC-1 ล้วนเป็นแคตไอออนที่ผ่านเยื่อหุ้มได้ สารเหล่านี้สะสมในเมทริกซ์ที่มีประจุลบตามสมดุลทางเคมีไฟฟ้า ดังนั้นสัญญาณฟลูออเรสเซนซ์รวมจึงรายงานศักย์ทางอ้อมผ่านตำแหน่งที่โพรบอยู่ ไม่มีโพรบใดในกลุ่มนี้วัด ATP หรือฟลักซ์อิเล็กตรอน

โพรบแต่ละชนิดเหมาะกับระบบตัวอย่างต่างกัน ซาฟรานิน O เหมาะกับไมโทคอนเดรียที่แยกออกมาและเซลล์ที่ทำให้เยื่อหุ้มยอมให้สารผ่าน โดยทั่วไปใช้ความเข้มข้นใกล้ 2 uM กระตุ้นด้วยแสงใกล้ 495 nm และตรวจแสงที่ปล่อยออกมาใกล้ 585 nm ทำงานในสภาวะที่เกิดการดับสัญญาณ ซึ่งการนำโพรบเข้าไปสะสมทำให้สัญญาณฟลูออเรสเซนซ์รวมเปลี่ยนไป TMRM และ TMRE เหมาะกับเซลล์ที่คงสภาพสมบูรณ์ โดยใช้โพรบในระดับนาโนโมลาร์ต่ำในโหมดที่ไม่เกิดการดับสัญญาณ เมื่อศักย์เยื่อหุ้มลดลง สีย้อมจะถูกปล่อยออกมาและฟลูออเรสเซนซ์ในไมโทคอนเดรียจะลดลง แต่เมื่อใช้โพรบในปริมาณสูง ทิศทางของสัญญาณอาจกลับด้านจากการดับสัญญาณด้วยตัวเอง JC-1 ให้อัตราส่วนสีเขียวต่อสีแดงที่ใช้งานสะดวก แต่ขึ้นกับปริมาณโพรบที่โหลดและมวลไมโทคอนเดรีย จึงเหมาะกับงานเชิงปริมาณน้อยกว่า TMRM ที่ควบคุมอย่างรอบคอบ ข้อแลกเปลี่ยนเหล่านี้สรุปไว้ในบทความทบทวนโพรบวัดศักย์เยื่อหุ้มไมโทคอนเดรียที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย

เมทิลีนบลูรบกวนการวัดทางแสงที่ความเข้มข้นใช้งานพอดี แถบการดูดกลืนใกล้ 600 ถึง 665 nm ของมันซ้อนทับกับแสงที่โพรบสีแดงปล่อยออกมา จึงมีเหตุผลที่จะคาดว่าเกิดผลการกรองแสงภายใน การดับสัญญาณ และการดูดกลืนแสงกระตุ้นได้ สีย้อมยังเป็นแคตไอออนที่ชอบไขมันอีกชนิดหนึ่ง ซึ่งการกระจายตัวของมันเองเปลี่ยนตามศักย์ที่กำลังวัด วิธีป้องกันคือใช้การวัดหลายแบบประกอบกันและชุดแบลงก์ ได้แก่ โพรบเพียงอย่างเดียว สีย้อมเพียงอย่างเดียว โพรบร่วมกับสีย้อมแต่ละความเข้มข้น การลดศักย์เยื่อหุ้มจนหมดด้วย FCCP เพื่อเป็นจุดอ้างอิงศูนย์ และหากเป็นไปได้ ควรใช้โพรบตัวที่สองซึ่งมีคุณสมบัติทางแสงต่างกัน งานศึกษาการข้าม Complex IIIวางแบบอย่างนี้ไว้ โดยทดสอบการฟื้นฟูศักย์เยื่อหุ้มซ้ำด้วยทั้งซาฟรานิน O และ TMRM หลังยับยั้งด้วยแอนติไมซินและไมโซไทอะซอล และพบการฟื้นกลับในเชิงคุณภาพเหมือนกัน ตัวรายงานทางแสงเพียงตัวเดียวเป็นเพียงเบาะแส ตัวรายงานอิสระสองตัวจึงเป็นหลักฐาน

ระบบตัวอย่างสามแบบ คำถามสามแบบ

ไมโทคอนเดรียที่แยกออกมา เซลล์ที่ทำให้เยื่อหุ้มยอมให้สารผ่าน และเซลล์ที่คงสภาพสมบูรณ์ ไม่ใช่เพียงการตั้งค่าความไวที่สลับใช้กันได้ในการทดสอบเดียว แต่เป็นแนวคิดที่แตกต่างกันและมีหลักการทำงานต่างกัน

ไมโทคอนเดรียที่แยกออกมายังคงห่วงโซ่การขนส่งอิเล็กตรอน เยื่อหุ้มชั้นใน และกลไกในเมทริกซ์ไว้ ขณะที่นำเยื่อหุ้มเซลล์ ไซโทซอล และโครงสร้างเครือข่ายออกไป การนำสิ่งเหล่านี้ออกคือจุดประสงค์ของวิธีนี้ เพราะทำให้กำหนดซับสเตรต ADP สารยับยั้ง และความเข้มข้นของสีย้อมได้อย่างแน่นอน จึงระบุเส้นทางที่เกี่ยวข้องได้ สิ่งที่ต้องแลกคือการสูญเสียการจัดหาซับสเตรต การส่งสัญญาณ และความต้องการพลังงานตามธรรมชาติ

เซลล์ที่ทำให้เยื่อหุ้มยอมให้สารผ่านยังเก็บไมโทคอนเดรียไว้ภายในโครงสร้างเซลล์ส่วนใหญ่ ขณะเดียวกันก็ให้ซับสเตรตจากภายนอกและ ADP ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ที่เปิดออกได้ ระบบนี้เหมาะสำหรับระบุความบกพร่องของเส้นทางการใช้ซับสเตรตภายในบริบทของเซลล์ หากทำให้เยื่อหุ้มยอมให้สารผ่านมากเกินไป จะทำลายเยื่อหุ้มชั้นนอกของไมโทคอนเดรีย และองค์ประกอบควบคุมในไซโทซอลจะถูกชะออก

เซลล์ที่คงสภาพสมบูรณ์เก็บทุกอย่างไว้ ได้แก่ แนวกั้นของเยื่อหุ้มเซลล์ สารรีดิวซ์ในไซโทซอล การขนส่งซับสเตรตภายในเซลล์ เครือข่ายไมโทคอนเดรีย และความต้องการ ATP ระบบนี้ใกล้เคียงสรีรวิทยามากที่สุด แต่แยกแยะกลไกได้ยากที่สุด เพราะการรับสีย้อมเข้าเซลล์ การรีดิวซ์ และการกักเก็บ ล้วนกำหนดระดับสีย้อมที่ไมโทคอนเดรียสัมผัสจริง

งานศึกษา TEGDMA เลือกใช้ทั้งสามระดับอย่างตั้งใจ ได้แก่ ไมโทคอนเดรียที่แยกจากสมองเพื่อศึกษาการฟื้นฟูออกซิเดชันและศักย์ด้วยสีย้อม เซลล์ต้นกำเนิดจากเนื้อเยื่อในโพรงฟันที่ทำให้เยื่อหุ้มยอมให้สารผ่าน โดยหลักเพื่อระบุว่าความบกพร่องอยู่ที่การออกซิไดซ์ซับสเตรตที่เชื่อมโยงกับ Complex I และเซลล์ต้นกำเนิดที่คงสภาพสมบูรณ์เพื่อศึกษาผลสุทธิในเชิงสรีรวิทยาของสีย้อมที่ 2 uM ต่อการใช้ออกซิเจนที่ถูกกดไว้ สำหรับผู้อ่านที่ต้องการเปรียบเทียบค่าที่อ่านได้จากไมโทคอนเดรียในระบบตัวอย่างต่างกัน บทความประกอบที่อธิบายว่าเมทิลีนบลูเคลื่อนย้ายอิเล็กตรอนผ่านห่วงโซ่การหายใจอย่างไรให้พื้นฐานเกี่ยวกับเส้นทางเหล่านี้ ส่วนคู่มือการอ่านงานศึกษาการหายใจที่ใช้เมทิลีนบลูครอบคลุมหลักการเรื่องปริมาณที่ใช้และสารยับยั้ง

ชุดควบคุมที่จำเป็นสำหรับสีย้อมที่มีฤทธิ์รีดอกซ์

สารที่หมุนเวียนในวัฏจักรรีดอกซ์ต้องมีรายการชุดควบคุมยาวกว่าสารยับยั้งทั่วไป เพราะปฏิกิริยาเคมีจากสีย้อมเพียงอย่างเดียวอาจเลียนแบบกระบวนการทางชีวภาพได้

สำหรับการวัดการหายใจ ให้ใช้ห้องวัดที่มีเพียงบัฟเฟอร์เพื่อตรวจการเลื่อนของสัญญาณ ห้องวัดที่มีบัฟเฟอร์ร่วมกับสีย้อมโดยไม่มีวัสดุชีวภาพ สีย้อมร่วมกับสารรีดิวซ์นอกเซลล์ทุกชนิดที่มีอยู่ในการทดสอบ และเติมโรทีโนนร่วมกับแอนติไมซินในขั้นสุดท้ายเพื่อกำหนดการใช้ออกซิเจนนอกไมโทคอนเดรียในเซลล์ที่คงสภาพสมบูรณ์ โปรดทราบว่าสีย้อมในรูปรีดิวซ์จะถูกออกซิไดซ์กลับโดยถ่ายโอนอิเล็กตรอนให้ออกซิเจนจนเกิดไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ดังนั้นแบลงก์ที่มีเพียงสีย้อมแต่ไม่มีตัวให้อิเล็กตรอนจะประเมินการใช้ออกซิเจนในระบบที่ไม่มีเซลล์ต่ำเกินไป เมื่อเทียบกับสภาวะที่มี NADH หรือ NADPH

สำหรับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ควรเลือก Amplex UltraRed ร่วมกับฮอร์สแรดิชเพอร์ออกซิเดสที่ผ่านการสอบเทียบ แทนสีย้อม DCFDA ที่ไม่จำเพาะ ตรวจยืนยันด้วยคะตะเลส และทดสอบว่าผลขึ้นกับการส่องสว่างหรือไม่ เพราะสีย้อมเป็นสารไวแสง งานศึกษาไมโทคอนเดรียจากสมองพบว่าภาระเปอร์ออกไซด์เพิ่มขึ้นมากกว่าสี่เท่าที่สีย้อมเพียง 100 nM ขณะที่การกำจัดช้าลง โดยเปอร์ออกไซด์เกิดโดยตรงจากสีย้อมในรูปรีดิวซ์โดยไม่มีซูเปอร์ออกไซด์เป็นตัวกลาง รายละเอียดเรื่องการเลือกโพรบและชุดควบคุมแสงอยู่ในบทความประกอบเรื่องการวัดอนุมูลออกซิเจนที่ไวต่อปฏิกิริยาในการทดลองที่ใช้สีย้อม ส่วนคำถามที่กว้างกว่านั้นว่าเมื่อใดเปอร์ออกไซด์ทำหน้าที่เป็นสัญญาณและเมื่อใดเป็นภาระ มีอธิบายร่วมกับเรื่องสมดุลรีดอกซ์ในเซลล์และข้อกล่าวอ้างเกี่ยวกับสารต้านอนุมูลอิสระ

สำหรับข้อสรุปเกี่ยวกับเส้นทาง ให้ทดสอบตำแหน่งยับยั้งทั้งสองของ Complex III ได้แก่ แอนติไมซิน A ที่ตำแหน่ง Qi และไมโซไทอะซอลที่ตำแหน่ง Qo พร้อมทดสอบจุดปลายทางที่ Complex IV ด้วยไซยาไนด์ งานศึกษาสมองหนูเมาส์ก่อนหน้านี้รายงานว่าสีย้อมช่วยฟื้นฟูการหายใจที่ถูกยับยั้งด้วยโรทีโนน แต่ไม่ช่วยเมื่อถูกยับยั้งด้วยแอนติไมซิน ขณะที่งานศึกษาภายหลังในสัตว์สามชนิดพบการฟื้นฟูบางส่วนเมื่อใช้สารยับยั้งทั้งสอง และพบหลักฐานการรีดิวซ์ไซโตโครม c โดยตรง ควรมองการข้ามเส้นทางว่าเป็นคำอธิบายที่สอดคล้องกับข้อมูลใหม่กว่า ไม่ใช่ข้อสรุปที่ยุติแล้ว เพราะความเข้มข้นของสีย้อม ตำแหน่งที่สารยับยั้งออกฤทธิ์ สภาวะของซับสเตรต และการกระจายตัวของสีย้อม ล้วนเปลี่ยนเส้นทางที่สังเกตได้

ตารางเลือกการทดสอบ

ใช้ตารางนี้เลือกการวัดจากคำถาม ไม่ใช่เลือกคำถามจากการวัด

อย่างน้อยที่สุด ข้อสรุปที่น่าเชื่อถือต้องใช้สีย้อมที่ความเข้มข้นเดียวกัน ได้แก่ 100 nM, 300 nM, 1 uM และ 2 uM ในการวัดฟลักซ์ออกซิเจนภายใต้สภาวะการรั่ว สภาวะที่มี ADP โอลิโกไมซิน และสารแยกการควบคู่ รวมถึงวัดอัตราการสังเคราะห์ ATP ศักย์เยื่อหุ้มโดยควรใช้โพรบสองชนิด และการปล่อยเปอร์ออกไซด์ที่ผ่านการสอบเทียบพร้อมคะตะเลสและชุดควบคุมที่ไม่มีเซลล์ รายงานข้อมูลที่เชื่อมโยงกันทั้งชุด ได้แก่ ฟลักซ์ออกซิเจน อัตราการสร้าง ATP, ATP ต่อออกซิเจน ศักย์เยื่อหุ้ม และเปอร์ออกไซด์ ตัวเลขใดตัวเลขหนึ่งเพียงลำพังเป็นเพียงผลการวัดที่ยังต้องหาความหมาย