เมทิลีนบลูกับการได้รับแสง: ความยาวคลื่น ความเข้มรังสี และรูปแบบทางเรขาคณิตของการฉายแสง

บทความวิจัยสองฉบับรายงานการฉายแสงให้เมทิลีนบลูที่ 10 J per square cm งานหนึ่งฆ่าแบคทีเรียได้ อีกงานไม่เกิดผลที่วัดได้ ผู้อ่านที่เปรียบเทียบเฉพาะปริมาณแสงจึงสรุปว่างานวิจัยในสาขานี้ให้ผลไม่สอดคล้องกัน แต่สาขานี้มีความสอดคล้องกัน ปริมาณแสงไม่เคยเป็นข้อมูลทั้งหมดของการได้รับแสง

การได้รับแสงเป็นระบบขนาดเล็กที่ประกอบด้วยพารามิเตอร์ซึ่งทำงานร่วมกัน ได้แก่ ความยาวคลื่น ความเข้มรังสี ระยะเวลา ฟลูเอนซ์ที่ได้ ความพร้อมของออกซิเจน ความเข้มข้นและสถานะการรวมตัวของสีย้อม ช่วงเวลาระหว่างการให้สีย้อมกับการฉายแสง และเส้นทางแสงที่ผ่านตัวอย่างจริง เปลี่ยนเพียงอย่างเดียว เคมีแสงก็เปลี่ยนไป บทความนี้จะอธิบายพารามิเตอร์แต่ละตัว แล้วแยกความแตกต่างระหว่างการปรับการทำงานทางชีวภาพด้วยแสงอินฟราเรดใกล้กับการกระตุ้นสีย้อมด้วยแสงโดยตรง เพราะกระบวนการสองแบบนี้มักถูกสับสนกันมากที่สุด

ความยาวคลื่นกำหนดว่าสีย้อมมีส่วนร่วมในปฏิกิริยาหรือไม่

เมทิลีนบลูในน้ำดูดกลืนแสงสีแดงได้มากเมื่ออยู่ในรูปโมโนเมอร์ โดยมีจุดสูงสุดใกล้ 664 ถึง 665 nm และมีไหล่ของแถบการดูดกลืนที่ความยาวคลื่นสั้นกว่าบริเวณ 610 nm ซึ่งเด่นขึ้นเมื่อสีย้อมรวมตัวเป็นไดเมอร์และกลุ่มซ้อนที่ใหญ่ขึ้น ค่าสัมประสิทธิ์การดูดกลืนเชิงโมลใกล้จุดสูงสุดอยู่ในระดับประมาณ 65,000 ถึง 85,000 M-1 cm-1 ดังนั้นสารละลายระดับไมโครโมลาร์ก็มีสีน้ำเงินเข้มแล้ว บทความทบทวนยุคแรกเกี่ยวกับเคมีแสงของเมทิลีนบลูกับ DNA และสารตั้งต้นทางชีวภาพ บันทึกพฤติกรรมการดูดกลืนนี้และเคมีของสถานะกระตุ้นที่เกิดตามมาไว้ว่า การดูดกลืนทำให้โมเลกุลเข้าสู่สถานะซิงเกล็ตอายุสั้น ก่อนเปลี่ยนข้ามไปยังสถานะทริปเล็ตที่มีอายุยาวกว่า โดยมีค่าผลได้ที่รายงานใกล้ 0.5 และในสารละลายที่มีอากาศ สถานะนี้จะถูกออกซิเจนดับภายในประมาณ 2 microseconds

ขั้นตอนการดับสถานะกระตุ้นนี้เป็นจุดที่เส้นทางเคมีแสงสองแบบแยกจากกัน ในเคมีแบบ Type II สีย้อมในสถานะทริปเล็ตถ่ายโอนพลังงานให้ออกซิเจนในสถานะพื้นและสร้างออกซิเจนซิงเกล็ต โดยค่าผลได้ที่มักอ้างถึงอยู่ใกล้ 0.52 ส่วนเคมีแบบ Type I สถานะทริปเล็ตจะถ่ายโอนอิเล็กตรอนหรือไฮโดรเจนให้สารตั้งต้นแทน ทำให้เกิดอนุมูลต่าง ๆ รวมถึงซูเปอร์ออกไซด์และอนุมูลไฮดรอกซิล ทั้งสองเส้นทางเกิดพร้อมกันได้ และผลโฟโตไดนามิกแบบทั่วไปยังคงพึ่งพาออกซิเจนอย่างมาก แม้จะมีส่วนร่วมจาก Type I ก็ตาม

ผลที่ตามมาสำหรับการเลือกความยาวคลื่นให้เมทิลีนบลูสรุปเป็นหลักง่าย ๆ ได้ว่า แสงสีแดงช่วงประมาณ 630 ถึง 680 nm ซ้อนทับกับแถบการดูดกลืนของสีย้อม โดยช่วง 660 ถึง 665 nm อยู่ใกล้จุดสูงสุดของโมโนเมอร์ จึงขับเคลื่อนเคมีของสารไวแสงได้ในบริเวณที่มีสีย้อมอยู่มากพอ แสงอินฟราเรดใกล้ที่ 810 nm อยู่ห่างออกไปนอกแถบการดูดกลืนของสถานะพื้นอย่างชัดเจน จึงเป็นความยาวคลื่นที่ไม่เหมาะสำหรับกระตุ้นสีย้อมโดยตรง ความเข้มข้นทำให้เรื่องนี้ซับซ้อนขึ้นในประเด็นหนึ่งที่ต้องกล่าวให้ชัดเจน: เมื่อความเข้มข้นเพิ่มขึ้น สีย้อมจำนวนมากขึ้นจะอยู่ในรูปไดเมอร์และกลุ่มรวมตัว ซึ่งดูดกลืนไปทาง 610 nm และทำหน้าที่เป็นสารไวแสงได้มีประสิทธิภาพต่อโมเลกุลน้อยลง ดังนั้นการเพิ่มสีย้อมเป็นสองเท่าจึงไม่ได้เพิ่มผลเป็นสองเท่า บทความทบทวนประกอบเรื่องเมทิลีนบลูกับการบำบัดด้วยแสงสีแดง ถือว่าหลักการดูดกลืนนี้เป็นเงื่อนไขเบื้องต้นของปฏิกิริยาใด ๆ ที่อาศัยสารไวแสง

ความเข้มรังสี ระยะเวลา และฟลูเอนซ์เป็นพารามิเตอร์สามตัว ไม่ใช่ตัวเดียว

ฟลูเอนซ์ในหน่วย J per square cm เท่ากับความเข้มรังสีคูณเวลา การรายงานเฉพาะฟลูเอนซ์ซ่อนอัตราที่พลังงานมาถึง และอัตรานี้มีความสำคัญ

การให้ความเข้มรังสีสูงในช่วงเวลาสั้นกับการให้ความเข้มรังสีต่ำเป็นเวลานานอาจได้ฟลูเอนซ์เท่ากัน แต่เกิดเคมีต่างกัน ความเข้มรังสีสูงใช้ออกซิเจนที่ละลายอยู่เร็วกว่าที่การแพร่จะเติมกลับได้ จึงจำกัดเส้นทาง Type II ที่พึ่งพาออกซิเจนระหว่างการฉายแสง นอกจากนี้ยังถ่ายเทพลังงานความร้อนลงไป และเนื้อเยื่อตอบสนองต่อความร้อนด้วยการเปลี่ยนแปลงการไหลเวียนเลือด ซึ่งเปลี่ยนทั้งระดับออกซิเจนและการกระจายตัวของสีย้อม ความเข้มรังสีต่ำที่ฉายเป็นเวลานานช่วยให้ออกซิเจนได้รับการเติมอย่างต่อเนื่อง แต่ก็ให้เวลากระบวนการซ่อมแซมและการเติมออกซิเจนกลับทำงานระหว่างการฉายแสงด้วย ตำราเคมีแสงเรียกสมมติฐานที่ว่ามีเพียงปริมาณแสงรวมเท่านั้นที่สำคัญว่า หลักการแลกเปลี่ยนกันได้ระหว่างความเข้มกับเวลา หลักการนี้ใช้ไม่ได้เมื่อออกซิเจน ความร้อน หรือกระบวนการทางชีวภาพมีส่วนร่วม ซึ่งในเนื้อเยื่อหมายถึงแทบทุกครั้ง

การฉายแสงโฟโตไดนามิกต้านจุลชีพด้วยเมทิลีนบลูในมนุษย์มักใช้ 6 ถึง 18 J per square cm ซึ่งทับซ้อนกับค่าที่ใช้ในการปรับการทำงานทางชีวภาพด้วยแสง ดังนั้นฟลูเอนซ์เพียงอย่างเดียวจึงระบุไม่ได้ว่าเป็นกระบวนการแบบใด การฉายแสง 10 J per square cm ที่ 660 nm ลงบนเนื้อเยื่อที่มีสีย้อมอยู่เป็นเคมีแสงที่ขับเคลื่อนด้วยสารไวแสง ส่วนฟลูเอนซ์เท่ากันที่ 810 nm ลงบนเนื้อเยื่อที่มีสีย้อมเพียงเล็กน้อยเป็นอีกกระบวนการหนึ่งโดยสิ้นเชิง ตัวเลขตรงกัน แต่แนวคิดต่างกัน

เส้นทางแสงและรูปแบบทางเรขาคณิตของตัวอย่างกำหนดว่าแสงจะพบอะไร

พฤติกรรมตามกฎเบียร์–แลมเบิร์ตหมายความว่าส่วนหน้าของตัวอย่างได้รับแสงมากกว่าส่วนหลังอย่างมาก ในคิวเวตต์ที่มีสีย้อมระดับหลายสิบไมโครโมลาร์ ชั้นแรกที่หนาเพียงหนึ่งมิลลิเมตรอาจดูดกลืนแสงสีแดงที่ตกกระทบไปเกือบทั้งหมด ทำให้ชั้นที่ลึกกว่านั้นแทบไม่ได้รับแสง เมื่อนำสารละลายเดียวกันไปใส่ในหลุมตื้นที่มีปริมาตรน้อย การได้รับแสงจะเกือบสม่ำเสมอ สีย้อมเดียวกัน โคมไฟเดียวกัน ฟลูเอนซ์ที่พื้นผิวเท่ากัน แต่ผลต่างกัน

เนื้อเยื่อเพิ่มการกระเจิงเข้ามานอกเหนือจากการดูดกลืน แสงสีแดงใกล้ 660 nm แทรกผ่านได้ในระดับมิลลิเมตร โดยความลึกที่แน่นอนขึ้นอยู่กับปริมาณเลือด เม็ดสี และชนิดของเนื้อเยื่อ หลุมทดลองมีสิ่งรบกวนเฉพาะของตัวเองเพิ่มเติม ได้แก่ ผลคล้ายเลนส์จากผิวโค้งของของเหลว การสะท้อนจากผนัง การบังแสงของหลุมริมขอบ และการอุ่นขึ้นของของเหลวปริมาตรน้อยใต้แหล่งกำเนิดแสง ห้องปฏิบัติการสองแห่งที่รายงานการตั้งค่าโคมไฟเหมือนกัน แต่ใช้ชนิดเพลต ปริมาตร หรือระยะห่างจากแหล่งกำเนิดต่างกัน กำลังทำการทดลองคนละแบบ

ระยะห่างควรได้รับการเน้นย้ำ เพราะเป็นตัวแปรที่มักถูกละเลยมากที่สุด ความเข้มรังสีลดลงอย่างรวดเร็วเมื่ออยู่ห่างจากแหล่งกำเนิดที่ไม่ได้ทำให้ลำแสงขนาน ดังนั้นการย้ายโคมไฟจากระยะ 2 cm เป็น 5 cm เหนือเพลตอาจลดความเข้มรังสีลงได้หลายเท่า แม้ส่วนวิธีการทดลองจะยังเขียนไว้เหมือนเดิม หากไม่มีการวัดความเข้มรังสีที่พื้นผิวตัวอย่าง ฟลูเอนซ์ที่ตีพิมพ์ซึ่งคำนวณจากค่ากำลังที่ผู้ผลิตระบุเป็นเพียงค่าประมาณ ไม่ใช่ค่าที่วัดได้

คู่มือพารามิเตอร์พร้อมคำอธิบาย: อะไรทำให้การฉายแสงทำซ้ำได้

สื่อประกอบต้นฉบับสำหรับหน้านี้เป็นรายการตรวจสอบ การฉายแสงในงานศึกษาใดที่ละข้อมูลเหล่านี้ไว้ไม่สามารถนำไปเปรียบเทียบกับงานอื่นได้ ไม่ว่าปริมาณแสงที่รายงานโดยสรุปจะดูคล้ายกันเพียงใด

1. ความยาวคลื่นและความกว้างแถบ ระบุจุดสูงสุดและความกว้างเต็ม ไม่ใช่เพียงชื่อสี LED สีแดงครอบคลุมช่วง 630 ถึง 680 nm ซึ่งสีย้อมดูดกลืนได้แตกต่างกันมาก
2. ความเข้มรังสีที่พื้นผิวตัวอย่างซึ่งวัดจริง ในหน่วย mW per square cm กำลังวัตต์ที่ผู้ผลิตระบุไม่ใช่ความเข้มรังสี
3. ระยะเวลาและการให้แสงเป็นพัลส์ การให้แสงต่อเนื่องเทียบกับแบบพัลส์ รวมถึงความถี่พัลส์และสัดส่วนเวลาที่เปิดแสงเมื่อเกี่ยวข้อง
4. ฟลูเอนซ์ที่คำนวณจากค่าความเข้มรังสีและระยะเวลาที่วัดข้างต้น ในหน่วย J per square cm
5. ความเข้มข้นของสีย้อม สูตรตำรับ และสถานะการรวมตัว โมโนเมอร์ที่ดูดกลืนใกล้ 664 nm ทำหน้าที่เป็นสารไวแสงต่างจากกลุ่มรวมตัวที่ดูดกลืนใกล้ 610 nm
6. ช่วงเวลาระหว่างการให้ยากับการฉายแสง ระยะตั้งแต่หลายนาทีถึงหลายชั่วโมงระหว่างการให้สีย้อมกับการฉายแสง ซึ่งกำหนดว่าสีย้อมอยู่ที่ใดเมื่อแสงมาถึง
7. ภาวะออกซิเจน สารละลายที่มีอากาศเทียบกับเนื้อเยื่อที่มีออกซิเจนต่ำเปลี่ยนสมดุลระหว่าง Type I และ Type II โดยตรง
8. รูปแบบทางเรขาคณิต ความลึกและปริมาตรของตัวอย่าง ชนิดภาชนะ ระยะห่างและมุมของแหล่งกำเนิดแสง และความลึกของเป้าหมายในเนื้อเยื่อ

นิสัยที่มีประโยชน์เวลาอ่านบทความวิจัยคือ ตรวจสอบช่วงเวลาระหว่างการให้ยากับการฉายแสงก่อน เพราะจะเผยให้เห็นเจตนาของการทดลอง การออกแบบโฟโตไดนามิกฉายแสงลงบนเนื้อเยื่อที่มีสีย้อมอยู่โดยตั้งใจ ส่วนการออกแบบที่ใช้สองวิธีร่วมกันอาจจงใจแยกทั้งสองออกจากกัน ดังตัวอย่างด้านล่าง

การปรับการทำงานทางชีวภาพด้วยแสงอินฟราเรดใกล้ไม่ใช่การกระตุ้นสีย้อมด้วยแสง

การปรับการทำงานทางชีวภาพด้วยแสง ซึ่งมักย่อว่า PBM ใช้แสงสีแดงหรืออินฟราเรดใกล้เพื่อปรับการส่งสัญญาณที่เกิดขึ้นภายในร่างกายโดยไม่เติมสารไวแสง การบำบัดแบบโฟโตไดนามิก ซึ่งมักย่อว่า PDT ใช้องค์ประกอบสามอย่างร่วมกัน ได้แก่ แสงที่สารไวแสงดูดกลืนได้ ตัวสารไวแสงเอง และออกซิเจน เพื่อสร้างสารที่ไวต่อปฏิกิริยาปริมาณมากในช่วงสั้น ๆ ซึ่งทำลายเป้าหมาย บทความทบทวนเรื่องไมโทคอนเดรียในฐานะเป้าหมายของการปกป้องเซลล์ประสาท จับคู่เมทิลีนบลูกับ PBM เพราะทั้งสองส่งผลมาบรรจบที่กระบวนการหายใจระดับเซลล์จากคนละทิศทาง: สีย้อมทำหน้าที่หมุนเวียนปฏิกิริยารีดอกซ์แบบตัวเร่งเพื่อสนับสนุนการไหลของอิเล็กตรอน ขณะที่มีสมมติฐานว่า PBM ส่งเสริมการแยกตัวของไนตริกออกไซด์ที่ยับยั้งการทำงานออกจากไซโตโครมซีออกซิเดสที่ Complex IV กลไกระดับเอนไซม์นี้ควรยังคงระบุไว้อย่างชัดเจนว่าเป็นสมมติฐาน

งานศึกษาในหนูเมาส์ที่ใช้ทั้งสองวิธีร่วมกันและถูกอ้างถึงมากที่สุดสองงานต่างใช้แสง 810 nm ซึ่งเป็นเหตุผลโดยตรงที่งานเหล่านี้ไม่ได้แสดงการกระตุ้นสีย้อมด้วยแสง ในงานศึกษาการให้ล่วงหน้าก่อนการอดนอน หนูเมาส์ได้รับเมทิลีนบลูทุกวันที่ 0.5 mg per kg เลเซอร์พัลส์ 810 nm วันเว้นวัน หรือทั้งสองอย่างก่อนการอดนอน การให้ทั้งสองวิธีร่วมกันล่วงหน้าปกป้องพฤติกรรมที่เกี่ยวข้องกับความจำและโปรตีนไซแนปส์ในฮิปโปแคมปัส ขณะที่การใช้เพียงวิธีเดียวส่วนใหญ่ไม่ได้ผล ในงานศึกษาความเครียดเรื้อรังที่ให้การรักษาร่วมกัน หนูเมาส์ได้รับ PBM ที่ 810 nm และ 8 J per square cm ควบคู่กับสีย้อมทุกวันที่ 0.5 mg per kg โดยฉายเลเซอร์ก่อนแล้วฉีดสีย้อมสองชั่วโมงต่อมา เพื่อหลีกเลี่ยงการฉายแสงลงบนเนื้อเยื่อที่มีสีย้อมอยู่โดยเฉพาะ กลุ่มทดลองทั้งสามช่วยฟื้นจากความบกพร่องด้านการเรียนรู้ โดยประโยชน์จากการใช้ร่วมกันที่เพิ่มขึ้นพบหลัก ๆ ในคอร์ติซอลในซีรัมและสารออกซิเจนที่ไวต่อปฏิกิริยาในสมอง ผลเหล่านี้ทดสอบการใช้วิธีแทรกแซงไมโทคอนเดรียสองวิธีร่วมกัน ซึ่งเป็นความแตกต่างที่ชุดรวบรวมงานศึกษาโฟโตไดนามิกยังคงแสดงให้เห็นชัดด้วยการบันทึกความยาวคลื่นแยกตามข้อบ่งใช้

หลักฐานด้านผิวหนังอยู่ในอีกฝั่งหนึ่ง ข้อมูลในมนุษย์เกี่ยวกับเมทิลีนบลูร่วมกับแสงบนผิวหนังส่วนใหญ่อยู่ในช่วง 630 ถึง 680 nm โดยใช้สีย้อมทาภายนอกหรือฉีดเข้ารอยโรค และมีจุดมุ่งหมายเพื่อทำลายหรือปรับโครงสร้าง ซึ่งตามนิยามคือ PDT การอ้างผลการกำจัดรอยโรคนั้นเป็นหลักฐานว่าสีย้อมช่วยเสริม PBM หรือการอ้างผลฟื้นฟูในหนูเมาส์ที่ใช้ 810 nm เป็นหลักฐานว่าแผงแสง 660 nm ร่วมกับสีย้อมเป็นแนวทางด้านการรู้คิด เป็นการนำกระบวนการต่างแบบมาปะปนกัน เอกสารอ้างอิงด้านปริมาณการใช้และเภสัชวิทยา รวมถึงคู่มือความปลอดภัยและปฏิกิริยาระหว่างสาร อธิบายส่วนที่เกี่ยวกับความเข้มข้นและข้อห้ามใช้เพิ่มเติม

ระบุแนวคิดให้ชัดก่อนเปรียบเทียบตัวเลข ความยาวคลื่นกำหนดว่าสีย้อมดูดกลืนแสงหรือไม่ ความเข้มรังสีและระยะเวลากำหนดว่าเคมีจะดำเนินไปอย่างไรหลังการดูดกลืนนั้น รูปแบบทางเรขาคณิตกำหนดว่าส่วนใดของตัวอย่างได้รับผลจากกระบวนการเหล่านี้ การฉายแสงสองแบบที่ตรงกันเพียงพารามิเตอร์เดียวแต่ต่างกันในพารามิเตอร์ที่เหลือคือการทดลองคนละแบบ และการถือว่าใช้แทนกันได้คือข้อผิดพลาดที่คู่มือนี้ต้องการป้องกัน เนื้อหาทั้งหมดนี้ไม่ได้ให้แนวทางสำหรับทำเองที่บ้าน การใช้แสงที่มีความยาวคลื่นสอดคล้องกับการดูดกลืนร่วมกับสีย้อมที่ให้เข้าสู่ระบบร่างกาย เปลี่ยนการฉายแสงที่เดิมมีบทบาทปรับการทำงานให้กลายเป็นเคมีแสงที่ขับเคลื่อนด้วยสารไวแสง ซึ่งควรอยู่ภายใต้การดูแลของบุคลากรทางคลินิก