เมทิลีนบลูในฐานะตัวบ่งชี้สภาวะไร้ออกซิเจนและออกซิเจน: การเปลี่ยนสีพิสูจน์อะไรได้บ้าง

เจ้าหน้าที่เทคนิคปิดผนึกโถเพาะเลี้ยงแบบไร้ออกซิเจน ตรวจดูแถบบ่งชี้เมทิลีนบลูผ่านฝา และเห็นสิ่งที่เธอต้องการเห็น แถบเปลี่ยนจากสีฟ้าเป็นสีขาว เธอบันทึกว่ารอบการเพาะเลี้ยงนี้อยู่ในสภาวะไร้ออกซิเจนแล้วไปทำงานอื่นต่อ สองวันต่อมา จานเพาะเลี้ยงหนึ่งจานไม่มีอะไรเจริญ ขณะที่หลอดอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวที่ปิดผนึกอยู่ในโถเดียวกันกลับแสดงสัญญาณของการสัมผัสออกซิเจน แถบบ่งชี้บอกความจริง แต่เธอถามมันผิดคำถาม

ความสับสนนี้เกิดจากการสับสนในแนวคิด ตัวบ่งชี้สภาวะไร้ออกซิเจนเมทิลีนบลูเกี่ยวข้องกับรีดอกซ์ ไม่ใช่ความปราศจากเชื้อ และไม่ใช่การยืนยันความใช้ได้ของระบบทั้งหมด เมื่อแยกความแตกต่างนี้ได้ชัดเจน แถบบ่งชี้ก็จะเป็นเครื่องมือที่แม่นยำและรายงานตามจริง โดยมีหน้าที่เฉพาะที่จำกัด

แนวคิด: คู่รีดอกซ์ที่ผันกลับได้

เมทิลีนบลูที่ละลายอยู่มีสองสถานะ รูปที่ถูกออกซิไดซ์คือแคตไอออนสีฟ้าที่คุ้นเคย ส่วนรูปที่ถูกรีดิวซ์ซึ่งเรียกว่าลิวโคเมทิลีนบลูนั้นไม่มีสี ที่ pH ใกล้เป็นกลาง ครึ่งปฏิกิริยาอย่างง่ายคือแคตไอออนสีฟ้าหนึ่งตัวรวมกับโปรตอนหนึ่งตัวและอิเล็กตรอนสองตัว ให้โมเลกุลลิวโคที่ไม่มีสีหนึ่งโมเลกุล ศักย์ฟอร์มัลอยู่ใกล้บวก 11 มิลลิโวลต์เทียบกับขั้วไฟฟ้าไฮโดรเจนมาตรฐานที่ pH 7 จึงอยู่ในช่วงที่ระบบรีดิวซ์หลายชนิดทำให้เกิดขึ้นได้ และออกซิเจนสามารถทำให้ปฏิกิริยาย้อนกลับได้

การรีดักชันต้องอาศัยศักย์รีดอกซ์ต่ำในบริเวณนั้น การกำจัดออกซิเจนเพียงอย่างเดียวไม่ได้ทำให้เกิดสภาวะนี้เสมอไป งานศึกษาสภาวะไร้ออกซิเจนในระยะแรกพบว่าเมทิลีนบลูในน้ำธรรมดาที่ปราศจากออกซิเจนยังคงมีสี เว้นแต่จะมีสารรีดิวซ์อยู่ด้วย และส่วนผสมของอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวเดกซ์โทรสกับสีย้อมประมาณ 0.01 เปอร์เซ็นต์สูญเสียสีได้ง่ายที่ 37 C ขณะที่ส่วนผสมเดียวกันที่เก็บไว้ที่ 4 C ยังคงเป็นสีฟ้าตลอดหนึ่งวัน ตามรายงานในการทดลองเกี่ยวกับเนื้อเยื่อสดและสภาวะการเพาะเลี้ยงแบบไร้ออกซิเจน อุณหภูมิ pH กลูโคส แอสคอร์เบต ไทโอไกลคอลเลต และกิจกรรมรีดิวซ์ของจุลินทรีย์ ล้วนเป็นตัวกำหนดว่าจะมีอิเล็กตรอนพร้อมสำหรับปฏิกิริยาหรือไม่

การออกซิไดซ์กลับต้องการเพียงออกซิเจน เมื่ออากาศเข้าถึงรูปลิวโค มันจะเปลี่ยนกลับเป็นสีฟ้า ตัวบ่งชี้ที่ออกแบบขึ้นในปัจจุบันใช้ประโยชน์จากวัฏจักรนี้โดยตรง ได้แก่ สีย้อมร่วมกับสารรีดิวซ์และเมทริกซ์ที่ช่วยรักษาเสถียรภาพ ซึ่งไม่มีสีเมื่อออกซิเจนต่ำและกลับเป็นสีฟ้าเมื่อสัมผัสอากาศ ดังที่แสดงในตัวบ่งชี้ออกซิเจนเมทิลีนบลูแบบไฮบริดที่ใช้สีย้อม สารรีดิวซ์ สารลดแรงตึงผิว และดินเหนียว ต้นแบบนั้นใช้สีย้อม 0.01 มิลลิโมลาร์กับแอสคอร์เบตหรือกลูโคส 2.0 มิลลิโมลาร์ที่ pH 11 เปลี่ยนเป็นไม่มีสีเมื่อออกซิเจนอยู่ใกล้ 0.5 เปอร์เซ็นต์โดยปริมาตร และแยกความแตกต่างระหว่างออกซิเจนต่ำกว่า 0.1 เปอร์เซ็นต์กับสูงกว่า 0.5 เปอร์เซ็นต์ได้ในห้องทดสอบ

ดังนั้นหลักการใช้งานจึงเรียบง่าย สีฟ้าหมายความว่าบริเวณตัวบ่งชี้อยู่ในสภาวะออกซิไดซ์ ส่วนการไม่มีสีหมายความว่าบริเวณตัวบ่งชี้เข้าสู่สภาวะรีดิวซ์และมีออกซิเจนต่ำแล้ว การเปลี่ยนแปลงนี้ผันกลับได้ เกิดขึ้นเฉพาะบริเวณ และเป็นการเปลี่ยนแปลงทางเคมี โดยตัวมันเองไม่ได้บอกอะไรเกี่ยวกับจุลินทรีย์

แถบบ่งชี้เมทิลีนบลูในโถเพาะเลี้ยงแบบไร้ออกซิเจนทำงานอย่างไร

แถบบ่งชี้เมทิลีนบลูสำหรับโถเพาะเลี้ยงแบบไร้ออกซิเจนเป็นบริเวณปฏิกิริยาขนาดเล็กที่วางไว้ในบรรยากาศภายในโถ โดยมองเห็นได้โดยไม่ต้องเปิดภาชนะ ผลิตภัณฑ์ที่จำหน่ายมีหลายรูปแบบ ได้แก่ แถบกระดาษ เม็ดที่ต้องละลายหรือทำให้เปียกขณะเตรียมระบบ และกระดาษไฮบริดรุ่นใหม่ บางชนิดต้องใช้น้ำกลั่นหนึ่งหยดเพื่อกระตุ้นบริเวณปฏิกิริยา ส่วนบางชนิดเป็นอุปกรณ์แบบแห้งที่ต้องคงสภาพแห้งไว้ ต้องยึดเอกสารคำแนะนำของผลิตภัณฑ์นั้นเป็นหลัก เพราะการเติมน้ำ ตำแหน่งวาง และเวลาอ่านผลล้วนเป็นส่วนหนึ่งของกระบวนการทางเคมี

ในทางปฏิบัติ การอ่านผลที่ตั้งใจให้ใช้มีสองสถานะ สีฟ้าหมายความว่ายังมีออกซิเจนหรือสภาวะรีดิวซ์ยังไม่เพียงพอที่แถบ สีขาวหรือไม่มีสีหมายความว่าสภาวะรีดอกซ์แบบไร้ออกซิเจนเกิดขึ้นที่แถบแล้ว กระดาษบางผลิตภัณฑ์เติมเม็ดสีพื้นหลังสีแดง ทำให้จุดยุติในสภาพรีดิวซ์อ่านเป็นสีชมพูแทนสีขาว ต้องทราบก่อนว่าผลิตภัณฑ์ของคุณระบุจุดยุติเป็นสีใด จึงค่อยตัดสินผล

เวลาที่ใช้แตกต่างกันไปตามระบบ ในระบบแบบ GasPak ระบบหนึ่ง สีเริ่มจางภายในประมาณหนึ่งชั่วโมงและจางหมดภายในไม่กี่ชั่วโมง ขณะที่การเปรียบเทียบภายใต้การควบคุมที่อุณหภูมิห้องพบว่าเมทิลีนบลูต้องใช้เวลามากกว่าหกชั่วโมง ในงานดังกล่าว ศักย์รีดอกซ์ของอาหารเลี้ยงเชื้อลดลงถึงประมาณลบ 100 มิลลิโวลต์ภายใน 60 ถึง 100 นาที ซึ่งเกิดขึ้นก่อนที่สีย้อมจะเปลี่ยนสีเสร็จมาก และลดต่ำกว่าลบ 200 มิลลิโวลต์ไปมากเมื่อแถบกลายเป็นไม่มีสีทั้งหมด ตัวบ่งชี้ตอบสนองช้ากว่าการเปลี่ยนแปลงของบรรยากาศ แถบสีฟ้าเมื่อครบหนึ่งชั่วโมงไม่ได้พิสูจน์ว่าระบบล้มเหลว และแถบสีขาวเมื่อครบหกชั่วโมงก็อธิบายสภาวะที่แถบเมื่อครบหกชั่วโมงเท่านั้น

ตำแหน่งวางสำคัญด้วยเหตุผลเดียวกัน ให้วางแถบไว้ในช่องว่างอากาศเหนืออาหารเลี้ยงเชื้อ ให้มองเห็นผ่านฝาได้ และอยู่ห่างจากผิววุ้นและอาหารเลี้ยงเชื้อ แถบรายงานสภาวะแวดล้อมที่อยู่ติดกับตัวมัน หากวางแนบผนังที่เย็น ซ่อนไว้ใต้จานเพาะเลี้ยง หรือปล่อยให้หยดน้ำควบแน่นทำให้แถบเปียก แถบก็จะรายงานสภาวะจุลภาคนั้นแทนสภาวะของโถ

แถบบ่งชี้บอกอะไรได้และบอกอะไรไม่ได้

ให้มองตัวบ่งชี้เมทิลีนบลูในโถเพาะเลี้ยงแบบไร้ออกซิเจนเป็นเซนเซอร์หนึ่งตัว ณ ตำแหน่งหนึ่ง มันยืนยันสภาวะรีดอกซ์และออกซิเจนเฉพาะที่บริเวณปฏิกิริยาของตัวเอง ซึ่งอาจเป็นตัวแทนโดยรวมของช่องว่างอากาศได้หากมีการผสมและการเข้าสู่สมดุลอย่างเพียงพอ ข้อสรุปที่ไกลกว่านั้นล้วนเป็นการอนุมาน และการอนุมานต้องอาศัยหลักฐานแยกต่างหาก

แถบที่ไม่มีสีไม่ได้ยืนยันความปราศจากเชื้อ ความปราศจากเชื้อหมายถึงการไม่มีสิ่งมีชีวิตที่ยังมีชีวิตอยู่ ซึ่งต้องพิสูจน์ด้วยกระบวนการทำให้ปราศจากเชื้อที่ผ่านการยืนยันความใช้ได้ และชุดควบคุมสำหรับยืนยันความใช้ได้ของการเพาะเลี้ยง โถอาจอยู่ในสภาวะไร้ออกซิเจนอย่างสมบูรณ์แต่ยังมีการปนเปื้อน หรือปราศจากเชื้ออย่างสมบูรณ์แต่ยังมีออกซิเจนอยู่ก็ได้

แถบไม่ได้ยืนยันความใช้ได้ของทุกส่วนในระบบเพาะเลี้ยง ออกซิเจนที่ละลายอยู่ภายในหลอดปิดผนึก ออกซิเจนที่ติดค้างในวุ้นชั้นลึก ความแตกต่างของสภาวะตามตำแหน่งในโถที่ใส่ภาชนะแน่น และรอยรั่วที่เกิดขึ้นหลังอ่านผล ล้วนอยู่นอกสิ่งที่แถบเพียงแถบเดียวตรวจพบได้ การทดลองเชิงพื้นที่พบบริเวณสีฟ้าและบริเวณไม่มีสีอยู่ติดกันในภาชนะเดียวกัน โดยการแทรกซึมของออกซิเจนและกิจกรรมรีดิวซ์สมดุลกันต่างไปในแต่ละบริเวณ จุดตรวจหนึ่งจุดไม่สามารถรับรองทั้งปริมาตรได้

แถบไม่ได้พิสูจน์ว่ามีสภาวะไร้ออกซิเจนอย่างต่อเนื่องโดยไม่ขาดช่วง การอ่านแถบครั้งเดียวตอนเริ่มเตรียมระบบไม่ได้บอกอะไรเกี่ยวกับชั่วโมงที่ยี่สิบ งานด้านคุณภาพของการเพาะเลี้ยงแบบไร้ออกซิเจนในระยะหลังเตือนว่า ตัวบ่งชี้ทางเคมีอธิบายบรรยากาศ ณ เวลาที่อ่านผล และอาจดูเหมือนให้ผลที่น่าพอใจแม้ยังมีออกซิเจนตกค้างอยู่เล็กน้อย การบันทึกอย่างต่อเนื่องหรือ ณ จุดตรวจที่กำหนด ไม่ใช่การมองจุดยุติเพียงครั้งเดียว เป็นสิ่งที่เชื่อมโยงผลจากแถบเข้ากับช่วงการบ่ม

สำหรับเคมีที่อยู่เบื้องหลังการเปลี่ยนสี ดูวิธีที่เมทิลีนบลูหมุนเวียนระหว่างรูปออกซิไดซ์และรูปรีดิวซ์ ส่วนผลของออกซิเจนต่อการจัดการตัวอย่างในภาพรวม ดูหัวข้อการควบคุมออกซิเจนในงานกล้องจุลทรรศน์และการเพาะเลี้ยง

แผนภาพสำหรับวางไว้ข้างโถ

ภาพด้านล่างสรุปบทความให้เป็นข้อมูลอ้างอิงบนโต๊ะปฏิบัติงาน แสดงสามสถานะของแถบเดียวกัน ปฏิกิริยาทั้งสองทิศทาง และขอบเขตระหว่างหลักฐานจากตัวบ่งชี้กับการยืนยันความใช้ได้ของระบบ

รูปแบบความล้มเหลวที่ทำให้แถบคงเป็นสีฟ้า หรือทำให้มั่นใจผิด ๆ

ความล้มเหลวส่วนใหญ่แบ่งได้เป็นห้ากลุ่ม แต่ละกลุ่มมีลักษณะเฉพาะที่ต่างกัน

โถหรือถุงที่รั่วทำให้ออกซิเจนเข้าสู่บริเวณปฏิกิริยาอย่างต่อเนื่อง แถบจึงคงเป็นสีฟ้าหรือกลับเป็นสีฟ้าหลังจากจางลง ตรวจสอบฝา ปะเก็น ตัวหนีบ และพื้นผิวที่ใช้ปิดผนึกก่อนจะโทษกระบวนการทางเคมี

อุปกรณ์สร้างก๊าซที่หมดสภาพหรือกระตุ้นไม่ถูกต้องจะไม่กำจัดออกซิเจน ในระบบรุ่นเก่าที่กระตุ้นด้วยน้ำ การไม่เกิดหยดน้ำควบแน่นในช่วงประมาณ 10 ถึง 15 นาที และฝาไม่อุ่นขึ้นในช่วงประมาณ 20 ถึง 40 นาที เป็นสัญญาณเตือนล่วงหน้าสำหรับระบบนั้น ซองที่มีความจุน้อยเกินไปในโถที่บรรจุภาชนะมากเกินไปก็ล้มเหลวในลักษณะเดียวกัน

การเสื่อมฤทธิ์ของตัวเร่งปฏิกิริยาจากสารพิษเกี่ยวข้องเฉพาะกับระบบรุ่นเก่าที่ใช้ไฮโดรเจนร่วมกับแพลเลเดียม ซึ่งแพลเลเดียมช่วยให้ไฮโดรเจนและออกซิเจนรวมตัวเป็นน้ำ ความชื้นและไฮโดรเจนซัลไฟด์ทำให้ตัวเร่งเสื่อมสภาพ ซองหลายชนิดในปัจจุบันไม่ใช้แพลเลเดียมเลย จึงไม่ควรใช้แนวทางแก้ไขนี้กับระบบที่ไม่เกี่ยวข้อง

แถบที่เสื่อมสภาพหรือจัดการไม่ถูกต้องอาจใช้การไม่ได้โดยไม่มีสัญญาณชัดเจน สีย้อมและสารรีดิวซ์สูญเสียความสามารถในการผันกลับระหว่างการเก็บรักษา ซึ่งเป็นเหตุผลหนึ่งที่มีการพัฒนาสูตรไฮบริดให้ทนต่อการซีดจางจากแสงและการเสื่อมระหว่างเก็บรักษา ไม่ควรใช้สินค้าที่หมดอายุ มีสีเริ่มต้นผิดปกติ รวมถึงแถบที่ถูกทำให้เปียกทั้งที่ควรแห้ง หรือถูกปล่อยให้แห้งทั้งที่ต้องทำให้เปียก

ความแตกต่างของสภาวะตามตำแหน่งหรือการตอบสนองที่ล่าช้าทำให้ผู้ใช้อ่านผลผิด ไม่ใช่ทำให้เคมีผิดพลาด ช่องว่างอากาศที่ผสมไม่ทั่วถึง หลอดปิดผนึกที่มีออกซิเจนละลายอยู่ และอาหารเลี้ยงเชื้อกึ่งแข็ง ต่างคงสภาวะของตัวเองไว้นานกว่าที่ผลจากแถบชวนให้เข้าใจ แถบรีซาซูรินเปลี่ยนผ่านสีชมพูก่อนเป็นไม่มีสี และมักมีการประชาสัมพันธ์ว่าตอบสนองเร็วกว่า แต่ค่าเกณฑ์ของแถบนั้นขึ้นอยู่กับสูตรของมันเอง และนำมาใช้กับเมทิลีนบลูไม่ได้

ชุดควบคุมและขั้นตอนอ่านผลที่ควรนำไปใช้

ชุดควบคุมราคาประหยัดสองแบบช่วยตรวจพบการอ่านผิดส่วนใหญ่ได้ ให้วางแถบใหม่สำหรับควบคุมในอากาศไว้ในอากาศห้องควบคู่กับรอบการทดสอบ แถบเมทิลีนบลูที่ทำงานได้ควรคงเป็นสีฟ้าที่นั่น ตัวบ่งชี้บางชนิดที่อยู่ในบรรจุภัณฑ์เริ่มต้นด้วยสีอ่อนและเปลี่ยนเป็นสีฟ้าเมื่อเปิด ซึ่งถือเป็นการตรวจสอบการทำงานในตัว และควรนำแถบใหม่ไปวางในระบบไร้ออกซิเจนที่ผ่านการยืนยันความใช้ได้แล้วเป็นระยะ แถบควรถึงจุดยุติในสภาพรีดิวซ์ที่ผ่านการยืนยันไว้ภายในเวลาที่ผลิตภัณฑ์ระบุ หากชุดควบคุมแบบใดแบบหนึ่งให้ผลผิดปกติ ให้เปลี่ยนล็อตก่อนเชื่อถือผลอ่านจากโถ

ขั้นตอนอ่านผลสอดคล้องกับกลไกการทำงาน วางแถบในช่องว่างอากาศ ณ ตำแหน่งที่มองเห็นได้โดยไม่ต้องเปิดโถ และทำตามเอกสารผลิตภัณฑ์ในเรื่องการสัมผัสผนังและการทำให้เปียก บันทึกสีเริ่มต้น เวลาที่ปิดผนึกโถ และสี ณ จุดตรวจที่ผลิตภัณฑ์ระบุ หากภาชนะเอื้ออำนวย ให้บันทึกว่าตัวบ่งชี้ยังคงอยู่ในสภาพรีดิวซ์ ณ จุดตรวจที่กำหนดระหว่างการบ่ม บันทึกสีสุดท้ายทันทีก่อนเปิด สีที่อ่านก่อนเปิดนี้คือจุดยุติของรอบนั้น หลังเปิด ให้คาดว่าแถบจะกลับเป็นสีฟ้า และอย่านำการเปลี่ยนสีภายหลังมาเปลี่ยนข้อสรุปของผลก่อนหน้า

หากแถบยังเป็นสีฟ้าเมื่อพ้นเวลาที่ระบุ ให้ถือว่ายังไม่ยืนยันสภาวะไร้ออกซิเจน ตรวจสอบตามลำดับ ได้แก่ การปิดผนึก ซอง ตัวเร่งปฏิกิริยาหากมี การเติมน้ำให้ตัวบ่งชี้และวันหมดอายุ จากนั้นตรวจสอบการทำงานของตัวบ่งชี้เทียบกับชุดควบคุมในอากาศ ควรตีความการเจริญหรือไม่เจริญก็ต่อเมื่อยืนยันสภาวะบรรยากาศแล้ว โดยใช้การจัดระบบเพาะเลี้ยงแบบไร้ออกซิเจนและชุดควบคุมจุลินทรีย์ที่เหมาะกับงานนั้น

แถบควรมีอำนาจตัดสินเฉพาะในขอบเขตของมันเอง ไม่ว่าจะเป็นสีฟ้าหรือไม่มีสี มันตอบคำถามหนึ่งข้อเกี่ยวกับสถานที่หนึ่งแห่ง ณ เวลาหนึ่ง หากถามคำถามนั้นตามเวลาที่กำหนด พร้อมมีชุดควบคุมอยู่ข้างกัน มันจะตอบได้อย่างเชื่อถือได้ แต่หากถามเรื่องความปราศจากเชื้อ ทุกหลอด หรือการบ่มทั้งหมดจากการมองเพียงครั้งเดียว ก็ไม่มีเคมีของตัวบ่งชี้ใดทำให้การอ่านผลนั้นถูกต้องได้