เหตุใดจึงใช้เมทิลีนบลูเป็นสีย้อมตัดกันในการย้อมทนกรด

เจ้าหน้าที่ตรวจสเมียร์เสมหะหลังผ่านขั้นตอนการย้อมครบทุกขั้น แบคทีเรียรูปแท่งสีแดงเด่นชัดบนพื้นสีน้ำเงิน และรายงานผลว่าพบแบคทีเรียรูปแท่งทนกรด วันถัดมา สไลด์อีกแผ่นมีพื้นสีน้ำเงินสม่ำเสมอโดยไม่มีแบคทีเรียรูปแท่งสีแดง จึงมีการรายงานผลว่าไม่พบวัณโรค รายงานหนึ่งในสองฉบับนี้สรุปเกินกว่าหลักฐานบนสไลด์จะรองรับได้ และไม่ใช่ฉบับแรก

ความสับสนนี้เป็นเรื่องของแนวคิด เจ้าหน้าที่มองว่าสีย้อมสีน้ำเงินเป็นส่วนหนึ่งของเคมีที่ใช้ตรวจหาเชื้อ ราวกับว่าเมทิลีนบลูช่วยค้นหามัยโคแบคทีเรีย แต่ไม่ได้เป็นเช่นนั้น เมื่อเมทิลีนบลูสัมผัสสไลด์ การทดสอบก็เสร็จสิ้นแล้ว สีย้อมนี้เพียงย้อมพื้นหลังเพื่อให้อ่านผลได้ บทความนี้อธิบายหน้าที่ของเมทิลีนบลูในการย้อมทนกรด เหตุใดจึงเลือกสีน้ำเงินแทนสีอื่น และสีแดงบนพื้นสีน้ำเงินเปิดทางให้สรุปอะไรได้บ้าง

คำตอบสั้น ๆ

การย้อมทนกรดเป็นการทดสอบเพื่อแยกความแตกต่างที่ตั้งอยู่บนแนวคิดสามข้อ คาร์บอลฟุคซินซึ่งเป็นสีย้อมหลักถูกผลักให้เข้าสู่เซลล์ทุกชนิด รวมถึงมัยโคแบคทีเรียที่มีผนังลักษณะคล้ายขี้ผึ้ง กรด-แอลกอฮอล์ซึ่งเป็นสารล้างสีจะชะสีย้อมสีแดงออกจากเซลล์ทั่วไป แต่ไม่สามารถสกัดสีออกจากเซลล์ทนกรดได้ จากนั้นเมทิลีนบลูซึ่งเป็นสีย้อมตัดกันจะย้อมทุกสิ่งที่ถูกล้างสีออกไป ทำให้เซลล์ที่ไม่ทนกรด เซลล์ของโฮสต์ และเศษวัสดุปรากฏเป็นสีน้ำเงิน ขณะที่แบคทีเรียรูปแท่งทนกรดยังคงเป็นสีแดง สีย้อมตัดกันทำหน้าที่สร้างความต่างของสี ไม่ได้มีส่วนในกระบวนการทางเคมีที่ทำให้เซลล์ทนกรด

แต่ละขั้นตอนทำหน้าที่อะไร

แผนภาพด้านล่างแสดงการแบ่งหน้าที่ อ่านจากซ้ายไปขวาเพื่อดูขั้นตอนปฏิบัติ และอ่านแถบด้านล่างเพื่อย้ำว่าการย้อมแต่ละกลุ่มตอบคำถามต่างกัน

การทำให้สีแทรกซึมเข้าสู่เซลล์เป็นขั้นตอนแรก มัยโคแบคทีเรียต้านทานสีย้อมในน้ำทั่วไป เนื่องจากชั้นหุ้มเซลล์มีสมบัติไม่ชอบน้ำมากเป็นพิเศษ ขั้นตอนปฏิบัติจึงต้องผลักให้สีเข้าไป ในวิธี Ziehl-Neelsen การให้ความร้อนจนเกิดไอจะช่วยขับคาร์บอลฟุคซินที่มีฟีนอลผ่านผนังคล้ายขี้ผึ้ง ในวิธี Kinyoun แบบเย็น ความร้อนถูกแทนที่ด้วยสูตรสีย้อมหลักที่เข้มข้นกว่ามาก และวิธีดัดแปลงบางแบบที่ไม่ใช้ความร้อนยังเติมสารลดแรงตึงผิวด้วย ขั้นตอนการย้อมทนกรดของสมาคมจุลชีววิทยาอเมริกัน บันทึกสูตรทั้งสองไว้ให้เปรียบเทียบกัน โดยมีความเข้มข้นต่างกันอย่างชัดเจน คือเบสิกฟุคซินประมาณ 0.3 g ต่อ 100 mL สำหรับวิธีใช้ความร้อน เทียบกับประมาณ 4 g สำหรับวิธีแบบเย็น

การแยกความแตกต่างเป็นขั้นตอนที่สอง กรด-แอลกอฮอล์ ซึ่งโดยทั่วไปประกอบด้วยกรดไฮโดรคลอริกเข้มข้น 3 mL ในเอทานอล 95 เปอร์เซ็นต์ 97 mL จะชะสีย้อมสีแดงออกจากทุกเซลล์ที่ผนังไม่มีความต้านทานเป็นพิเศษ เซลล์ที่มีชั้นหุ้มลิพิดของมัยโคแบคทีเรียสมบูรณ์จะคงสีย้อมไว้ ขั้นตอนนี้เป็นหัวใจของวิธีทั้งหมด และเป็นขั้นตอนที่ไวต่อเทคนิคการปฏิบัติมากที่สุด ดังที่จะกล่าวต่อไป

การสร้างความต่างของสีเป็นขั้นตอนสุดท้าย ขณะนี้สไลด์มีเซลล์ทนกรดสีแดงอยู่บนพื้นหลังของเซลล์ที่ถูกล้างสีจนแทบไม่มีสี เมทิลีนบลูที่ความเข้มข้น 0.3 เปอร์เซ็นต์ w/v ทำให้มองเห็นพื้นหลังนั้นอีกครั้งด้วยสีที่แตกต่างจากสีแดงมากที่สุด การย้อมตัดกันใช้เวลาสั้น โดยทั่วไปคือ 20 ถึง 30 วินาทีในวิธีใช้ความร้อน และอาจนานถึงไม่กี่นาทีในวิธีแบบเย็นบางรูปแบบ ระยะเวลาขึ้นอยู่กับขั้นตอนปฏิบัติ ไม่ใช่คุณสมบัติของสีย้อมเอง

เหตุใดจึงใช้สีย้อมนี้ และเหตุใดต้องเป็นสีน้ำเงิน

เมทิลีนบลูเป็นสีย้อมเบสิกชนิดแคตไอออน หมายความว่าไอออนที่ให้สีมีประจุบวกและจับกับพื้นผิวที่มีประจุลบของแบคทีเรียที่ถูกล้างสี เซลล์ของโฮสต์ และเศษวัสดุ ตำราจุลชีววิทยาของ OpenStax อธิบายกลไกของประจุนี้ว่าเป็นหลักการทั่วไปของสีย้อมเบสิก แต่ในบริบทนี้ เมทิลีนบลูไม่ได้มีคุณสมบัติทางเคมีเฉพาะตัว คริสตัลไวโอเลตและซาฟรานินก็เป็นสีย้อมเบสิกเช่นกัน การเลือกใช้จึงเป็นเรื่องของการมองเห็น ไม่ใช่เคมี

แบคทีเรียรูปแท่งสีแดงต้องการพื้นหลังที่มีเฉดสีตัดกัน และสีน้ำเงินให้ความต่างจากสีแดงในแบบที่เป็นประโยชน์ที่สุดสำหรับกล้องจุลทรรศน์สนามสว่าง ซาฟรานินจะเป็นสีย้อมตัดกันที่ไม่เหมาะ เพราะสีชมพูแดงที่ได้ใกล้เคียงกับคาร์บอลฟุคซินที่คงอยู่มากเกินไป จนกลบความแตกต่างที่ขั้นตอนนี้สร้างขึ้น คริสตัลไวโอเลตจะให้พื้นหลังสีม่วงเข้มที่ดึงความสนใจแข่งกับแบคทีเรียรูปแท่งสีแดงขนาดบาง หลักฐานที่ชัดเจนที่สุดว่าหน้าที่นี้คือการสร้างความต่างของสี ไม่ใช่เคมี คือการใช้สีย้อมอื่นแทน สีย้อมตัดกันสีเขียว เช่น มาลาไคต์กรีนและบริลเลียนต์กรีน ใช้ในขั้นตอนทางสัตวแพทย์และขั้นตอนดัดแปลงบางแบบ และการทดสอบยังทำงานได้ เพราะเฉดสีใดก็ตามที่ต่างกันอย่างชัดเจนทำหน้าที่เดียวกันได้

หลักการนี้นำไปสู่ข้อพิจารณาในทางปฏิบัติสองข้อ ข้อแรก สูตรมาตรฐานไม่ได้กำหนดให้ปรับ pH อย่าสับสนระหว่างสารละลายในน้ำธรรมดาที่มีความเข้มข้น 0.3 เปอร์เซ็นต์นี้กับสูตรด่าง เช่น เมทิลีนบลูของ Loeffler ซึ่งอยู่ในแนวคิดการย้อมอีกแบบหนึ่ง ข้อที่สอง การย้อมมากเกินไปส่งผลเสีย เอกสารด้านจุลกายวิภาคศาสตร์เตือนโดยเฉพาะว่าพื้นหลังสีน้ำเงินที่เข้มเกินไปอาจบดบังแบคทีเรียรูปแท่งที่มีอยู่น้อย ดังนั้นการทิ้งสีย้อมให้ท่วมสไลด์นานกว่าที่ขั้นตอนกำหนดจึงลดความชัดเจนในการอ่านผลโดยไม่ได้ประโยชน์อะไรเพิ่ม

เคมีของผนังเซลล์ที่ทำให้การทดสอบนี้เป็นไปได้

เหตุผลที่กรด-แอลกอฮอล์แยกความแตกต่างได้อยู่ที่ชั้นหุ้มเซลล์ของมัยโคแบคทีเรีย แกนโครงสร้างคือสารเชิงซ้อนไมโคไลล์-อะราบิโนกาแลกแทน-เพปทิโดไกลแคน โดยเพปทิโดไกลแคนเชื่อมกับอะราบิโนกาแลกแทน ซึ่งปลายด้านนอกมีกรดไมโคลิกสายยาวมากเกาะอยู่ ก่อเป็นเยื่อไมโคเมมเบรนชั้นนอกที่อุดมด้วยลิพิดและมีความสามารถให้สารผ่านต่ำเป็นพิเศษ บทความทบทวนเรื่องเยื่อหุ้มชั้นนอกของมัยโคแบคทีเรีย อธิบายโครงสร้างนี้ไว้อย่างละเอียด แนวกั้นนี้ทำงานทั้งสองทิศทาง โดยต้านทานการเข้าสู่เซลล์ของสีย้อม จึงต้องใช้ความร้อนหรือสีย้อมหลักที่เข้มข้นขึ้นเพื่อให้สีแทรกซึมเข้าไป และต้านทานการสกัดสีย้อมออก จึงเป็นเหตุให้กรด-แอลกอฮอล์ไม่สามารถชะคาร์บอลฟุคซินออกได้เมื่อสีเข้าไปอยู่ภายในแล้ว แบคทีเรียทั่วไปไม่มีชั้นหุ้มนี้และสูญเสียสีย้อม ดังนั้นจึงควรเข้าใจสมบัติทนกรดว่าเป็นปรากฏการณ์ของแนวกั้นลิพิด ไม่ใช่การที่ฟุคซินจับกับกรดไมโคลิกทางเคมี

เคมีนี้ยังอธิบายข้อสงสัยที่พบบ่อยได้ด้วยว่า เหตุใดมัยโคแบคทีเรียจึงติดสีแกรมได้ไม่ดีและไม่สม่ำเสมอ บางครั้งปรากฏเป็นรูปที่ติดสีจางเป็นเม็ด ๆ หรือเป็นเค้าโครงเซลล์ที่ไม่ติดสี ผนังที่ไม่ชอบน้ำจำกัดการแทรกซึมของคริสตัลไวโอเลต การย้อมทนกรดไม่ใช่การย้อมแกรมแบบดัดแปลง แต่เป็นหลักการแยกความแตกต่างอีกแบบหนึ่งที่อาศัยคุณสมบัติของผนังเซลล์คนละด้าน ดังที่การเปรียบเทียบการย้อมแบบง่ายกับการย้อมแกรม แสดงไว้สำหรับอีกสองวิธี

สามวิธี สามคำถาม

สำหรับกลุ่มวิธีการย้อมแบคทีเรียด้วยสีย้อมชนิดเดียวที่ครอบคลุมกว่านี้ ดูแผนภาพอ้างอิงการย้อมสำหรับกล้องจุลทรรศน์

สิ่งที่สีแดงบนพื้นสีน้ำเงินพิสูจน์ไม่ได้

แบคทีเรียรูปแท่งสีแดงหมายความว่าจุลชีพเหล่านั้นคงคาร์บอลฟุคซินไว้ได้หลังผ่านกรด-แอลกอฮอล์ สิ่งที่พบนี้สอดคล้องกับ Mycobacterium tuberculosis แต่แนวทางการวินิจฉัยวัณโรคของ CDC ระบุชัดเจนว่ามัยโคแบคทีเรียชนิดอื่นก็ทนกรดเช่นกัน ดังนั้นการระบุชนิดเชื้อจึงต้องอาศัยการเพาะเชื้อและการตรวจกรดนิวคลีอิก ไม่ใช่สี

ข้อผิดพลาดด้านเทคนิคมักเกิดในสองขั้นตอนการล้าง การล้างสีไม่เพียงพอทำให้วัสดุพื้นหลังยังเป็นสีแดงและเสี่ยงต่อการอ่านผลบวกลวง การล้างสีมากเกินไปชะสีย้อมหลักที่ยึดอยู่ไม่แน่นออก และมีส่วนทำให้เกิดผลลบลวง การย้อมตัดกันเข้มเกินไปบดบังแบคทีเรียรูปแท่งที่มีอยู่น้อยไว้ในสีน้ำเงิน สเมียร์ที่หนา สารเคมีที่ตกตะกอน และน้ำล้างที่ปนเปื้อนยังทำให้เกิดสิ่งแปลกปลอมจากกระบวนการได้อีกด้วย

ความไวของการตรวจมีข้อจำกัดจากปริมาณเชื้อ ไม่ว่าเทคนิคจะเรียบร้อยเพียงใด การตรวจสเมียร์ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบทั่วไปต้องมีแบคทีเรียรูปแท่งประมาณ 5,000 ถึง 10,000 ตัวต่อเสมหะหนึ่งมิลลิลิตร และบททบทวนหลักฐานของ CDC รุ่นก่อนระบุว่าความไวของการตรวจสเมียร์อยู่ที่ประมาณ 45 ถึง 80 เปอร์เซ็นต์ในกลุ่มผู้ป่วยวัณโรคปอดที่ยืนยันด้วยการเพาะเชื้อ ดังนั้นผลสเมียร์ลบจึงไม่สามารถตัดวัณโรคออกได้ แนวทางปัจจุบันของ CDC ยังคงให้เพาะเชื้อควบคู่กับการตรวจสเมียร์ทุกครั้ง และแนะนำให้ตรวจด้วยวิธีเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิกในสิ่งส่งตรวจจากระบบทางเดินหายใจอย่างน้อยหนึ่งตัวอย่าง เมื่อสงสัยวัณโรคปอดและผลตรวจจะเปลี่ยนแนวทางการดูแล

การปฏิบัติงานจริงต้องเป็นไปตามขั้นตอนที่ได้รับอนุญาต

คำอธิบายเพื่อการสอน รวมถึงบทความนี้ ไม่ใช่การอนุญาตให้ปฏิบัติงานทางคลินิก สำหรับการปฏิบัติงานในห้องปฏิบัติการ ให้ทำตามขั้นตอนปฏิบัติงานมาตรฐานของห้องปฏิบัติการที่ผ่านการตรวจสอบความใช้ได้และสอดคล้องกับเอกสารปัจจุบันของ CDC, APHL หรือ CLSI โดยเอกสารอ้างอิงการย้อมทนกรดของ CDC ที่จัดเก็บในคลัง Stacks แสดงให้เห็นว่าขั้นตอนเหล่านี้ระบุสารเคมีและการอ่านผลไว้อย่างไร การทำงานกับสิ่งส่งตรวจวัณโรคต้องมีการควบคุมการแพร่กระจายเชื้อ โดยเตรียมสเมียร์ในตู้ชีวนิรภัย เพราะการเตรียมทำให้เกิดละอองลอยและการกระเด็น แนวทางความปลอดภัยในห้องปฏิบัติการของ CDC ระบุว่า แม้สเมียร์ที่ตรึงด้วยความร้อนแล้วก็อาจยังมีเชื้อวัณโรคที่มีชีวิต และยังต้องจัดการเสมือนเป็นวัสดุปนเปื้อน รายการในคลังภาพสาธารณสุขของ CDC ที่แสดงสเมียร์ย้อมด้วยคาร์บอลฟุคซินและเมทิลีนบลูเพื่อตรวจหา M. leprae ช่วยเตือนให้เห็นว่าวิธีนี้ใช้ได้กว้างกว่าการตรวจวัณโรค ความต่างระหว่างสีแดงกับพื้นสีน้ำเงินแบบเดียวกันใช้ได้ทุกครั้งที่ต้องการค้นหาจุลชีพทนกรด และผลลบที่อ่านอย่างรอบคอบก็เป็นผลที่ควรบันทึกเช่นกัน

การอ่านสไลด์ที่ย้อมเสร็จแล้ว

สีย้อมตัดกันแสดงประโยชน์ในขั้นตอนการตรวจคัดกรอง ผู้ตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์จะเริ่มกวาดดูด้วยกำลังขยายต่ำ โดยใช้พื้นหลังสีน้ำเงินประเมินคุณภาพสเมียร์ ได้แก่ การกระจายตัวของเซลล์ที่สม่ำเสมอ เซลล์ของโฮสต์ที่สมบูรณ์สำหรับปรับโฟกัส และไม่มีตะกอนหนา จากนั้นสิ่งที่อาจเป็นเชื้อสีแดงจะดึงสายตา เพราะไม่มีสิ่งอื่นบนสไลด์เป็นสีแดง การยืนยันทำภายใต้เลนส์วัตถุแบบใช้น้ำมัน โดยแบคทีเรียรูปแท่งจริงจะแสดงลักษณะเป็นแท่งบางตามที่คาด บางครั้งโค้งเล็กน้อยหรือติดสีเป็นเม็ด ๆ ไม่ใช่เศษสีย้อมที่มีลักษณะสม่ำเสมอ

การย้อมพื้นหลังยังเป็นตัวกำหนดถ้อยคำในรายงานด้วย สไลด์ที่มีแบคทีเรียรูปแท่งสีแดงจะรายงานว่าพบแบคทีเรียรูปแท่งทนกรด โดยมักระบุระดับกึ่งปริมาณตามเกณฑ์ของห้องปฏิบัติการ สไลด์ที่ไม่พบจุลชีพสีแดงจะรายงานว่าไม่พบแบคทีเรียรูปแท่งทนกรด ไม่ใช่รายงานว่าไม่พบวัณโรค ความแตกต่างนี้สำคัญ เพราะพื้นสีน้ำเงินพิสูจน์ว่าการย้อมทำงานได้ เซลล์รับสีย้อมตัดกัน และระบบการมองเห็นเหมาะสม แต่ไม่ได้บอกอะไรเกี่ยวกับจุลชีพที่มีปริมาณต่ำกว่าขีดจำกัดการตรวจพบ พื้นสีน้ำเงินที่ไม่มีเชื้อให้เห็นเป็นผลที่ใช้ได้สำหรับสไลด์ ไม่ใช่ข้อสรุปเกี่ยวกับผู้ป่วย

จดจำการแบ่งหน้าที่นี้ไว้ แล้วจะเขียนรายงานได้อย่างตรงประเด็น คาร์บอลฟุคซินทำให้เห็นสิ่งที่อาจเป็นเชื้อ กรด-แอลกอฮอล์ทำหน้าที่ทดสอบ เมทิลีนบลูเพียงทำให้คำตอบอ่านได้ชัดเจน สีแดงคงสีย้อมไว้เมื่อสัมผัสกรด ส่วนสีน้ำเงินสูญเสียสีย้อมนั้นไปแล้ว เรื่องอื่นทั้งหมด ไม่ว่าจะเป็นชนิดเชื้อ ปริมาณเชื้อ หรือความหมายทางคลินิก ต้องอาศัยงานที่นอกเหนือจากสไลด์