ทำความเข้าใจสีย้อมเมทิลีนบลูชนิดด่างของลอฟเฟลอร์และชนิดพอลิโครม

บนโต๊ะย้อมสีอาจมีขวดสามขวดวางเรียงกัน แต่ละขวดติดฉลากว่าเป็นเมทิลีนบลูชนิดใดชนิดหนึ่ง ขวดหนึ่งระบุว่าเมทิลีนบลูในน้ำ 1% อีกขวดระบุว่าเมทิลีนบลูชนิดด่างของลอฟเฟลอร์ และอีกขวดระบุว่าเมทิลีนบลูชนิดพอลิโครม ผู้ปฏิบัติงานที่กำลังยุ่งหยิบขวดที่อยู่ใกล้มือที่สุดมาใช้ จากนั้นสเมียร์กลับติดสีจางเกินไป หรือเป็นสีน้ำเงินเหมือนกันหมด หรือมีเฉดสีม่วงที่ไม่คาดคิด แล้วปัญหาก็ถูกโยนไปให้ตัวอย่าง

นี่เป็นปัญหาของสูตรสีย้อม ไม่ใช่ปัญหาของตัวอย่าง สารละลายทั้งสามมีสีย้อมที่เกี่ยวข้องกัน แต่ใช้แนวคิดในการย้อมสีต่างกัน ชนิดหนึ่งเป็นสีย้อมประจุบวกธรรมดาที่มี pH ใกล้เป็นกลาง อีกชนิดเป็นสีย้อมเดียวกันที่ด่างช่วยให้ย้อมได้เข้มขึ้น ส่วนอีกชนิดไม่ได้มีสีย้อมเพียงชนิดเดียวอีกต่อไป แต่เป็นส่วนผสมที่ผ่านออกซิเดชันโดยตั้งใจ หากเลือกผิดชนิด หลักการย้อมสีก็เปลี่ยนไปทันทีขณะใช้งาน

คำตอบสั้น ๆ

เมทิลีนบลูชนิดสารละลายน้ำธรรมดาเป็นสูตรพื้นฐาน คือสีย้อมในน้ำประมาณ 1% เป็นสีย้อมประจุบวกอย่างง่ายสำหรับดูสัณฐานของแบคทีเรียและงานจุลทรรศน์ทั่วไป เมทิลีนบลูชนิดด่างของลอฟเฟลอร์เติมด่างเจือจางในปริมาณเล็กน้อยที่ตวงไว้อย่างแน่นอนลงในสารละลายตั้งต้นในแอลกอฮอล์ที่เจือจางด้วยน้ำ ทำให้ pH สูงขึ้นและช่วยให้สีย้อมประจุบวกจับกับโครงสร้างที่เป็นกรดของแบคทีเรียได้มากขึ้น เมทิลีนบลูชนิดพอลิโครมคือเมทิลีนบลูที่ผ่านการบ่มโดยออกซิเดชันในสภาวะด่างอย่างตั้งใจ ดังนั้นในขวดจึงมีส่วนผสมของสารในอนุกรมเดียวกันที่สูญเสียหมู่เมทิล (อะซัวร์ A, azure B, อะซัวร์ C) ไทโอนิน และเมทิลีนไวโอเลต ร่วมกับเมทิลีนบลูที่ยังเหลืออยู่ ส่วนผสมนี้ทำให้โครงสร้างต่างชนิดติดสีต่างเฉดกัน

หากจะจำเพียงประโยคเดียว ให้จำว่า การทำให้เป็นด่างเปลี่ยนความเข้มของการย้อม ส่วนการทำให้เป็นพอลิโครมเปลี่ยนสีที่ได้จากการย้อม

เมทิลีนบลูในน้ำธรรมดา: จุดอ้างอิง

สูตรที่ง่ายที่สุดคือเมทิลีนบลูละลายในน้ำ โดยทั่วไปใช้ความเข้มข้น 1% w/v ไม่เติมด่างและไม่ผ่านออกซิเดชัน สารที่ให้สีคือแคตไอออนเมทิลไทโอนิเนียมซึ่งมีคลอไรด์เป็นไอออนคู่ประจุ เป็นสีย้อมฟีโนไทอะซีนโมเลกุลขนาดเล็กและแบน ซึ่งข้อมูลเมทิลีนบลูของ PubChem ระบุว่าเป็นเมทิลไทโอนิเนียมคลอไรด์ เนื่องจากมีประจุบวก จึงจับกับโครงกระดูกฟอสเฟตของกรดนิวคลีอิกและหมู่ที่เป็นกรดบนผนังเซลล์แบคทีเรีย ทำให้เซลล์ติดสีน้ำเงินบนพื้นหลังสีอ่อน

ข้อดีคือผลที่คาดการณ์ได้ นิวเคลียสและแบคทีเรียจะปรากฏเป็นสีน้ำเงิน ความเปรียบต่างอยู่ในระดับไม่สูงนัก จุลชีพที่มองเห็นได้จางอาจติดสีอ่อน ซึ่งเป็นข้อจำกัดที่ลอฟเฟลอร์ตั้งใจแก้ไขพอดี หากต้องการทำความเข้าใจกลุ่มสีย้อมแบคทีเรียแบบง่ายที่สารละลายนี้จัดอยู่ ให้ดูภาพรวมของการย้อมแบคทีเรียแบบง่าย การตรวจสอบชนิดของสารให้ถูกต้องยังคงสำคัญ เพราะเมทิลบลูเป็นคนละโมเลกุลกันโดยสิ้นเชิง ดังที่อธิบายไว้ในเมทิลบลูกับเมทิลีนบลู ดังนั้นการค้นหาในแค็ตตาล็อกด้วยชื่อสีเพียงอย่างเดียวอาจทำให้ได้สีย้อมผิดกลุ่ม

เมทิลีนบลูชนิดด่างของลอฟเฟลอร์: สีย้อมเดิมที่ย้อมได้เข้มขึ้น

สูตรดั้งเดิมของลอฟเฟลอร์ผสมสารละลายตั้งต้นเมทิลีนบลูในแอลกอฮอล์กับด่างเจือจางในน้ำ สูตรในตำราระบุให้ใช้สีย้อม 0.3 g ในเอทานอล 95% ปริมาตร 30 mL ร่วมกับสารละลายโพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ในน้ำ 0.01% ปริมาตร 100 mL (หรือสูตรเทียบเท่าที่ใช้สารละลายเมทิลีนบลูอิ่มตัวในแอลกอฮอล์ 30 mL น้ำกลั่น 100 mL และ KOH 1% ปริมาตร 1 mL) ได้สารละลายพร้อมใช้ที่มีสีย้อมใกล้เคียง 0.3% และมี pH เป็นด่างอย่างชัดเจน ผลิตภัณฑ์เชิงพาณิชย์ใช้หลักการเดียวกัน และแค็ตตาล็อกสีย้อมทางจุลชีววิทยาของ Thermo Fisher แสดงเมทิลีนบลูชนิดด่างของลอฟเฟลอร์ควบคู่กับชนิดพอลิโครมและชนิดสารละลายน้ำ โดยจัดเป็นรายการสินค้าแยกกันและมีวัตถุประสงค์การใช้งานต่างกัน

หัวใจสำคัญอยู่ที่ด่าง การเพิ่ม pH ทำให้หมู่คาร์บอกซิลและฟอสเฟตบนสิ่งส่งตรวจสูญเสียโปรตอน จึงเพิ่มความหนาแน่นของตำแหน่งที่มีประจุลบ ขณะที่สารละลายตั้งต้นในเอทานอลช่วยให้สีย้อมละลายได้อย่างสมบูรณ์และเข้าถึงตำแหน่งเหล่านั้นในรูปโมโนเมอร์ ผลคือแบคทีเรียติดสีเร็วและเข้มกว่าการใช้สีย้อมในน้ำที่เป็นกลาง โดยเห็นแบคทีเรียรูปแท่งและรูปกลมเป็นสีน้ำเงินเข้มตามที่คุ้นเคยในสเมียร์แบคทีเรียทั่วไป โดยทั่วไปใช้เวลาย้อมหนึ่งถึงสามนาที แล้วล้างด้วยน้ำ

การใช้งานดั้งเดิมคือย้อมคอรีนีแบคทีเรียม ดิฟทีเรียอีที่เพาะบนอาหารเลี้ยงเชื้อซีรัมของลอฟเฟลอร์ ซึ่งเป็นแบคทีเรียรูปแท่งเรียวและมักมีปลายป่องคล้ายกระบอง โดยมีแกรนูลบาเบส–เอิร์นสต์ที่สะสมพอลิฟอสเฟตและติดสีแบบเมตาโครมาติกอย่างเด่นชัด การใช้อาหารเลี้ยงเชื้อและสีย้อมคู่นี้มีที่มาทางประวัติศาสตร์ ทั้งสองอย่างได้รับการยกย่องว่าเป็นผลงานของนักแบคทีเรียวิทยาคนเดียวกัน และความเปรียบต่างของแกรนูลคือประโยชน์ที่ได้ในเชิงการวินิจฉัย นอกจากงานเกี่ยวกับโรคคอตีบแล้ว สีย้อมนี้ยังใช้เป็นสีย้อมแบคทีเรียทั่วไปสำหรับสเมียร์จากเชื้อเพาะเลี้ยง ใช้ดูสัณฐานของไนซีเรียในสเมียร์ทางคลินิก และใช้ในกรณีที่ไม่จำเป็นต้องย้อมแกรมแต่เมทิลีนบลูในน้ำธรรมดาให้สีจางเกินไป นี่คือสีย้อมแบบสีเดียว โครงสร้างทุกอย่างที่เป็นกรดจะติดสีน้ำเงินในเฉดใดเฉดหนึ่ง หากวิธีปฏิบัติกำหนดให้แยกความแตกต่างด้วยสี ด่างเพียงอย่างเดียวไม่สามารถทำได้

ข้อควรระวังในการใช้งานคือ สารละลายสีย้อมที่เป็นด่างจะเสื่อมสภาพและตกตะกอนระหว่างการเก็บและเมื่อดูดซับคาร์บอนไดออกไซด์ ห้องปฏิบัติการจึงเตรียมสารละลายในปริมาณไม่มาก หรือซื้อสารละลายสำเร็จรูปตามแค็ตตาล็อกและใช้งานภายในอายุการเก็บรักษา แทนที่จะพยายามใช้ขวดเก่าที่ทิ้งตะกอนลงบนทุกสไลด์ต่อไป

เมทิลีนบลูชนิดพอลิโครม: ชื่อเดียว แต่มีสีย้อมหลายชนิด

เมทิลีนบลูชนิดพอลิโครมเริ่มจากสีย้อมชนิดเดียวกัน แต่ผ่านออกซิเดชันที่ควบคุมในสภาวะด่าง ซึ่งในอดีตเรียกว่าการบ่มหรือการทำให้เป็นพอลิโครม การบ่มในสภาวะด่าง การให้ความร้อนร่วมกับคาร์บอเนต หรือการออกซิไดซ์ด้วยสารอย่างไดโครเมต จะกำจัดหมู่เมทิลออกจากหมู่แทนที่ไดเมทิลอะมิโนทีละขั้น ผลิตภัณฑ์ที่ได้เป็นส่วนผสม ได้แก่ เมทิลีนบลูที่ยังเหลืออยู่ร่วมกับ azure B (สูญเสียหมู่เมทิลหนึ่งหมู่) อะซัวร์ A และอะซัวร์ C (สูญเสียหมู่เมทิลเพิ่มเติม) ไทโอนิน (สูญเสียหมู่เมทิลทั้งหมด) และผลิตภัณฑ์ข้างเคียงจากออกซิเดชันในกลุ่มเมทิลีนไวโอเลต แต่ละองค์ประกอบมีเฉดสีและความชอบจับกับเนื้อเยื่อเฉพาะตัว ส่วนผสมนี้จึงย้อมแบบเมตาโครมาติก กล่าวคือ นิวเคลียส แกรนูล มิวซิน และกระดูกอ่อนจะติดสีต่างกันในช่วงสีน้ำเงินถึงสีม่วงแดง

เคมีนี้เป็นเคมีเดียวกับที่อยู่เบื้องหลังสีย้อมเลือดที่มีชื่อเสียง ผู้ปฏิบัติงานในยุคแรกพบว่าเมทิลีนบลูที่ทำให้เป็นด่างย้อมนิวเคลียสของปรสิตมาลาเรียให้มีเฉดสีม่วง แต่สารละลายในน้ำที่ผ่านการบ่มนั้นไม่เสถียรและตกตะกอนภายในไม่กี่วัน บทความทบทวนเรื่องการคิดค้นสีย้อมเลือดสีม่วง เล่าถึงการที่มาลาคอฟสกีและโรมานอฟสกีใช้ประโยชน์จากปรากฏการณ์นี้โดยต่างคนต่างทำในปี 1891 การนำเมทานอลมาใช้เพื่อทำให้ตะกอนสีย้อมเสถียรและตรึงฟิล์มโดยไม่ใช้ความร้อน และการที่กีมซากำหนดมาตรฐานของส่วนผสมในเวลาต่อมา โดยใช้ azure B ร่วมกับอีโอซินในปริมาณที่ตวงแน่นอน และใช้กลีเซอรอลช่วยให้เสถียร สีย้อมแบบกีมซาในปัจจุบันพัฒนาสืบต่อมาโดยตรงจากเมทิลีนบลูชนิดพอลิโครมร่วมกับอีโอซิน ซึ่งเป็นคู่สารที่ทำให้เกิดปรากฏการณ์โรมานอฟสกี สำหรับรายละเอียดของการจับคู่กับอีโอซินและองค์ประกอบ azure B ดูสีย้อมแบบโรมานอฟสกีและปฏิสัมพันธ์ระหว่าง azure B กับอีโอซิน

เนื่องจากเป็นส่วนผสม เมทิลีนบลูชนิดพอลิโครมจึงมีความเป็นมาตรฐานน้อยที่สุดในบรรดาสามชนิดโดยธรรมชาติ สัดส่วนของเฉดสีที่ได้ขึ้นอยู่กับวิธีและระดับของการออกซิเดชัน นี่จึงเป็นเหตุผลที่ผู้จำหน่ายผลิตภัณฑ์ทางจุลกายวิภาคศาสตร์ขายสีย้อมนี้เป็นผลิตภัณฑ์แยกต่างหากพร้อมการทดสอบสมรรถนะเฉพาะ ไม่ใช่ขายในฐานะสีย้อมของลอฟเฟลอร์ที่เก็บไว้นาน การใช้งานทั่วไป ได้แก่ การแสดงแกรนูลของแมสต์เซลล์ มิวซิน และกระดูกอ่อนด้วยการติดสีแบบเมตาโครมาติก การแสดงรายละเอียดของพลาสมาเซลล์ และการแสดงเฮลิโคแบคเตอร์ ไพโลไรในชิ้นเนื้อด้วยวิธีพอลิโครมแบบกูดพาสเจอร์ สีย้อมนี้เป็นตัวเลือกที่เหมาะเมื่อโจทย์คือการแยกความแตกต่างด้วยสี แต่ไม่เหมาะเมื่อวิธีปฏิบัติต้องการเห็นรูปร่างแบคทีเรียที่คมชัดด้วยสีเดียว

เปรียบเทียบสูตรและวัตถุประสงค์

ใช้ตารางนี้เป็นแนวทางตัดสินใจ หากสิ่งส่งตรวจติดสีจางเกินไป ให้เปลี่ยนแนวคิดด้าน pH แล้วเลือกสูตรของลอฟเฟลอร์ หากทุกอย่างติดสีแต่ไม่มีอะไรแยกแยะออกจากกันได้ ให้เปลี่ยนแนวคิดด้านสีย้อมแล้วเลือกชนิดพอลิโครม หากสเมียร์ที่ย้อมด้วยสูตรของลอฟเฟลอร์แสดงแกรนูลได้ชัดเจนมาก แต่หัวหน้างานถามว่าทำไมนิวเคลียสกับไซโทพลาซึมจึงเป็นสีน้ำเงินเหมือนกัน คำตอบคือสีย้อมสีเดียวชนิดด่างไม่สามารถทำหน้าที่แยกสีเช่นนั้นได้ โจทย์นี้เป็นหน้าที่ของสีย้อมกลุ่มพอลิโครมและสีย้อมเลือดที่พัฒนาต่อจากกลุ่มนี้

หลีกเลี่ยงความสับสนที่พบบ่อย

ข้อผิดพลาดสองอย่างเป็นสาเหตุของความสับสนส่วนใหญ่ อย่างแรกคือการคิดว่าสูตรของลอฟเฟลอร์ใช้แทนเมทิลีนบลูธรรมดาได้ เพราะทั้งสองดูเป็นสีน้ำเงินเมื่ออยู่ในขวด ทั้งสองต่างกันด้าน pH และความเข้มของการย้อม การใช้สีย้อมเป็นกลางแทนเมื่อวิธีปฏิบัติระบุสูตรของลอฟเฟลอร์จะทำให้สูญเสียความเปรียบต่างของแกรนูล ซึ่งเป็นสิ่งที่วิธีปฏิบัตินั้นออกแบบมาเพื่อให้เห็นโดยเฉพาะ อย่างที่สองคือการถือว่าสีย้อมสีน้ำเงินชนิดด่างที่เก่าหรือถูกบ่มโดยบังเอิญเป็นชนิดพอลิโครม การบ่มที่ไม่มีการควบคุมให้ส่วนผสมที่ไม่ทราบองค์ประกอบและไม่ทราบความเข้มข้น ขณะที่สารละลายพอลิโครมแท้เตรียมด้วยวิธีออกซิเดชันที่กำหนดไว้ และในสายพัฒนาการของสีย้อมเลือดจะผสมกับอีโอซินในปริมาณที่ตวงแน่นอน ประวัติศาสตร์ให้บทเรียนในเรื่องนี้ สารละลายในน้ำที่ผ่านการบ่มและไม่เสถียรในทศวรรษ 1890 ถูกแทนที่ด้วยสูตรในเมทานอลที่ทำให้เสถียรแล้ว ก็เพราะส่วนผสมที่ไม่มีการควบคุมไม่สามารถเตรียมซ้ำให้ได้ผลเหมือนเดิม นี่เป็นบทเรียนที่ควรนึกถึงก่อนย้อมสไลด์เพื่อการวินิจฉัยด้วยสารละลายจากขวดที่ไม่แน่ใจว่าเก็บมานานเท่าใด

การตรวจสอบชื่อให้ถูกต้องช่วยปิดช่องว่างนี้ ยืนยันรายการสินค้าในแค็ตตาล็อกว่าเป็นชนิดสารละลายน้ำ สูตรของลอฟเฟลอร์ หรือชนิดพอลิโครม พร้อมตรวจปริมาณสีย้อมและการใช้งานที่ระบุบนฉลาก แทนที่จะคาดเดาจากสี สูตรทั้งสามมีต้นกำเนิดของโครโมฟอร์ร่วมกัน แต่ไม่ได้มีวัตถุประสงค์เดียวกัน