Оё кабуди метилен метавонад аз маҷмааи III-и митохондрия бо роҳи канорӣ гузарад? Чаро натиҷаҳои таҳқиқот мухолифанд

Ду озмоишгоҳ пурсиданд, ки оё кабуди метилен метавонад аз маҷмааи III-и басташудаи митохондрия бо роҳи канорӣ гузарад. Яке ҷавоб дод: не. Дигаре гуфт: ҳа. Ҳар ду маълумоти таҷрибавӣ доштанд.

Таҳқиқоти аввал, ки дар митохондрияҳои мағзи муш гузаронида шуд, нишон дод, ки рангкунанда ин корро карда наметавонад. Таҳқиқоти дуюм, дар митохондрияҳои мағзи се намуди хоянда, нишон дод, ки қисман метавонад. Таҳқиқоти сеюм, дар ҷигари муш, аксар вақт дар ҳамин замина иқтибос мешавад, аммо масъалаи дигарро санҷидааст. Агар онро дар ҷойи дурусташ гузорем, нисфи нофаҳмӣ бартараф мешавад.

Механизми универсалие нест, ки эълон кунем. Се таҷриба бо блокаторҳо, миқдорҳо ва нишондиҳандаҳои ченкунии гуногун ҳастанд. Аввал шароитро хонед. Хулосаҳо аз он бармеоянд.

Роҳи канорӣ дар ин ҷо чӣ маъно дорад

Электронҳо ба занҷир тавассути маҷмааи I (аз NADH) ё маҷмааи II (аз сукцинат) ворид мешаванд, аз маҷмааи III ба ситохроми c мегузаранд ва сипас тавассути маҷмааи IV ба оксиген мерасанд. Ҳуҷайра градиентеро, ки дар ин роҳ ба вуҷуд меояд, барои ҳосил кардани ATP сарф мекунад.

Иддаои роҳи канорӣ маънои онро дорад, ки кабуди метилен электронҳоро пеш аз нуқтаи басташавӣ мегирад ва баъд аз он медиҳад. Рангкунандаи оксидшуда электронҳоро аз NADH ё ҷузъҳои аввали занҷир гирифта, ба лейкометилени кабуд табдил меёбад ва шакли редуксияшуда онҳоро ба ситохроми c ё боз ба занҷир медиҳад. Агар электронҳо баъд аз нуқтаи басташавӣ дода шаванд, нафаскашӣ ва потенсиали мембрана қисман барқарор мешаванд. Агар онҳо дар худи нуқтаи басташавӣ ё пеш аз он дода шаванд, ҳеҷ чиз барқарор намешавад.

Як ҷузъиёти маҷмааи III қисми зиёди ин баҳсро муайян мекунад. Маҷмаа даври Q-ро бо ду ҷойи таъсири ингибиторҳо иҷро мекунад. Антимицин ба ҷойи Qi мепайвандад. Миксотиазол ба ҷойи Qo мепайвандад. Таҳқиқоте, ки танҳо яке аз онҳоро истифода мебарад, танҳо нисфи маҷмааро санҷидааст.

Таҳқиқоти якум: набудани роҳи канорӣ дар митохондрияҳои мағзи муш

Gureev ва ҳамкоронаш митохондрияҳои қишри мағзи мушҳои C57BL/6-ро истифода карданд, ки бо дигитонин ҷудо шуда, дар консентратсияи 0.1 mg сафеда ба ҳар ml санҷида шуданд. Субстратҳо се таркибро дар бар мегирифтанд: пируват бо малат, ҳар кадом 5 mM; сукцинат бо 10 mM ҳамроҳи глутамат бо 2 mM; ва L-пролин бо 10 mM. Блокаторҳо ротенон бо 1 микромоляр (маҷмааи I) ва антимицин бо 1 микрограмм ба ҳар ml (маҷмааи III) буданд. Миқдорҳои рангкунанда 0.5, 1 ва 2 микромоляр буданд ва 1 микромоляр ҳамчун консентратсияи асосӣ истифода шуд. Усулҳо ва каҷхатти сабтҳо дар мақолаи кӯтоҳи FEBS Letters оварда шудаанд.

Роҳи канории маҷмааи I кор кард. Ротенон нафаскашии бо ADP ангезонидашударо аз тақрибан 121 то тақрибан 2 nmol дар як дақиқа ба ҳар mg коҳиш дод ва рангкунанда бо 1 микромоляр онро то тақрибан 21 барқарор кард. Потенсиали мембрана ҳангоми истифодаи пируват бо малат ва L-пролин барқарор шуд.

Роҳи канории маҷмааи III кор накард. Антимицин нафаскаширо то тақрибан 16 коҳиш дод ва рангкунанда онро танҳо то тақрибан 20 зиёд кард. Потенсиали мембрана бо ҳеҷ яке аз субстратҳо, ҳатто дар миқдорҳои рангкунанда то 5 микромоляр, барқарор нашуд. Маълумоти пероксид низ ҳаминро нишон дод: танҳо рангкунанда хориҷшавии пероксидро аз суръати ибтидоии наздик ба 76 pmol дар як дақиқа ба ҳар mg то тақрибан 1170, 1460 ва 1945 дар се миқдор зиёд кард, аммо антимицин ин сигнали аз рангкунанда баамаломадаро мутаносибан тақрибан 25, 88 ва 96 фоиз коҳиш дод. Агар рангкунандаи редуксияшуда мустақиман бо оксиген вокуниш мекард, бастани маҷмааи III набояд сигналро коҳиш медод. Муаллифон хулоса карданд, ки рангкунандаи редуксияшуда дар ҷойи Qo-и маҷмааи III, пеш аз нуқтаи басташавии антимицин, оксид мешавад. Ҳалқаи кӯтоҳ ба таври шифоҳӣ чунин аст: аз донорҳо ба рангкунанда, аз рангкунанда ба Qo ва баъд идома бо роҳи муқаррарӣ. Ротенон аз роҳи канорӣ гузашта мешавад. Антимицин — не.

Таҳқиқоти дуюм: роҳи канории қисман дар се намуд, дар ҳар ду ҷойи таъсири ингибиторҳо

Svab ва ҳамкоронаш тарҳи таҷрибаро васеъ карданд. Митохондрияҳои мағзи мушҳо, калламушҳо ва хукҳои баҳрӣ бо Percoll ҷудо шуда, дар ҳамон консентратсияи 0.1 mg ба ҳар ml, бо пируват ва малат ё глутамат ва малат, ҳар кадом 5 mM, санҷида шуданд. Онҳо ду блокатори маҷмааи III-ро истифода карданд: антимицин A бо 0.3 микромоляр ва миксотиазол бо 1 микромоляр. Дар аксари санҷишҳо консентратсияи рангкунанда 2 микромоляр ва дар таҷрибаҳои ситохроми c 0.5 буд. Натиҷаҳои ҳар се намуд бо протоколҳои ҳамсон дар мақолаи дастрасии озод оварда шудаанд.

Дар ҳар се намуд ҳар ду басташавӣ қисман бо роҳи канорӣ гузашта шуданд. Дар митохондрияҳои муш антимицин нафаскаширо коҳиш дод ва рангкунанда онро тақрибан 60 фоиз, аз тақрибан 37 то 59 nmol дар як дақиқа ба ҳар mg, зиёд кард. Миксотиазол онро 88 фоиз, то тақрибан 4.5, коҳиш дод ва рангкунанда онро панҷ баробар, то тақрибан 23, зиёд кард. Дар ҳузури ҳар яке аз ингибиторҳо потенсиали мембрана қисман аз нав қутбнок шуд; барои истисно кардани артефактҳои оптикӣ он бо ду рангкунанда — сафранин O ва TMRM-и ратиометрӣ — чен карда шуд.

Ин мақола инчунин интиқоли мустақими электронҳоро санҷид, ки таҳқиқоти аввал ҳеҷ гоҳ онро анҷом надода буд. Ситохроми c-и ацетилшудаи беруна бо 25 микромоляр аз ҷониби митохондрияҳои дорои ҳолати энергетикии фаъол, бо ингибиторҳо ё бе онҳо, редуксия нашуд, аммо илова кардани рангкунанда дар ҳар ду ҳолат редуксияро ба вуҷуд овард. Дар буфери бе ҳуҷайра NADH ҳамроҳи рангкунанда ситохроми c-ро бо суръати мутаносиб ба NADH редуксия кард. Ҷаҳиши дарозтар ба таври шифоҳӣ чунин аст: эквивалентҳои редуксиякунанда ба рангкунанда, рангкунанда мустақиман ба ситохроми c ва маҷмааи IV ба оксиген. Ин роҳ маҷмааи III-ро комилан канор мегузорад, бинобар ин аз ҳар ду блокатор бо роҳи канорӣ гузаштан мумкин аст.

Ду нишондиҳандаи иловагӣ ин тафсирро дастгирӣ мекунанд. Ҳангоми илова кардани рангкунанда ба митохондрияҳои бо миксотиазол коркардшуда флуорессенсияи NAD(P)H паст шуд, яъне эквивалентҳои редуксиякунанда тавассути роҳи нав сарф мешуданд. Ҳамчунин, ҷаббиши рӯшноӣ аз ҷониби рангкунанда дар 660 nm ҳар иловаи пайдарпайро инъикос мекард, дар ҳоле ки моеъҳои болои таҳшин пас аз сентрифугакунӣ нишон доданд, ки рангкунандаи оксидшуда дар дохили митохондрияҳои дорои ҳолати энергетикии фаъол беш аз сад баробар ҷамъ шуда, баъди аз байн рафтани потенсиал берун мебарояд. Тавозуни протонҳо низ мувофиқ аст: гузаштан аз марҳилаҳои интиқоли фаъоли протонҳо тақрибан 2 протон ба ҳар ҷуфти электронро ба ҷойи 10 боқӣ мегузорад. Аз ин рӯ, истеъмоли зудтари оксиген бо танҳо қисман аз нав қутбнокшавӣ нишонаи роҳи канории воқеӣ аст, на далеле бар зидди он.

Ҳамин намунаи омодашуда посухҳоеро нишон дод, ки хондани сатҳиро гумроҳ мекунанд. Дар ҳузури ингибитор ва рангкунанда ADP нафаскаширо ба ҷойи зиёд кардан коҳиш дод ва бастани интиқол онро ба ҷойи суст кардан ангезонд, дар ҳоле ки потенсиали мембрана ҳанӯз ба самтҳои муқаррарӣ тағйир меёфт. Дар ин низом танҳо истеъмоли оксиген ба хулосаи нодуруст мебарад.

Таҳқиқоти сеюм: таҳқиқоти ҷигар, ки маҷмааҳои I ва II-ро санҷид, на III-ро

Lee ва Boelsterli митохондрияҳои ҷигари муш ва гепатоситҳои дар муҳити парваришёфтаеро истифода карданд, ки аз эфавиренз (маҷмааи I, IC50 наздик ба 30 микромоляр) ва гидразин, метаболити изониазид (маҷмааи II, IC50 наздик ба 30 микромоляр), осеб дида буданд. Рангкунанда бо тақрибан 30 микромоляр оксидшавии NADH, потенсиали мембрана ва ATP-ро барқарор кард ва ҳамзамон оксидантҳо ва марги некрозиро коҳиш дод. Мақолаи Redox Biology инро ҳамчун интиқоли электронҳо тавассути рангкунанда аз роҳи канории маҷмааҳои I ва II-и осебдида моделсозӣ мекунад.

Ин натиҷа заминаи тасдиқшудаи қисми болоии занҷир аст ва дар бораи маҷмааи III чизе намегӯяд, зеро дар он таҷриба ҳеҷ чиз дар ин маҷмаа баста нашуда буд. Он ҳеҷ яке аз таҳқиқоти мағзро тасдиқ ё рад карда наметавонад.

Ҷадвали шароит

Чор сабаб, ки ҳар ду таҳқиқоти маҷмааи III метавонанд дар шароити худ дуруст бошанд

1. Блокаторҳо дахолати яксон набуданд. Танҳо антимицин бо 1 микрограмм ба ҳар ml дар муқобили антимицин бо 0.3 микромоляр ва блокатори алоҳидаи ҷойи Qo. Роҳи рангкунандае, ки электронҳоро ба ҷойи Qo медиҳад, маҳз дар ҳамон ҷое ноком мешавад, ки роҳи мустақим ба ситохроми c муваффақ мегардад. Як ҷой наметавонад ҳар дуро намояндагӣ кунад.

2. Миқдори рангкунанда ва вақт фарқ доштанд. Консентратсияҳои асосӣ 1 ва 2 микромоляр буданд, дар ҳоле ки барои ин моддаи дар даври оксидшавию редуксия иштироккунанда воридшавӣ ва редуксияи мустақими ситохроми c аз консентратсия ва вақт вобастаанд. Фарқиятҳои хурди миқдор ҳамроҳи вақти гуногуни ченкунӣ метавонанд шохаҳои гуногуни як шабакаро ошкор кунанд.

3. Усулҳои омодасозӣ фарқ доштанд. Ҷудокунӣ бо дигитонин ва ҷудокунӣ бо градиенти Percoll популятсияҳои митохондриявии қисман ҳампӯш, вале на яксонро интихоб мекунанд. Консентратсияи сафеда дар ҳар ду 0.1 mg ба ҳар ml буд, пас ин тағйирёбанда аз ҳисоб хориҷ мешавад, аммо зерпопулятсия ва якпорчагӣ не. Гумони вобастагӣ ба намуд низ бартараф шуд: гурӯҳи дуюм фенотипи худро дар муш ҳам такрор кард.

4. Ҳолати субстрат муайян мекунад, ки рангкунанда чӣ карда метавонад. Се таркиби субстрат дар муқобили ҷуфтҳои вобаста ба NADH. Таъмини NADH ва потенсиали мембрана якҷоя муайян мекунанд, ки рангкунанда бо чӣ суръат редуксия мешавад ва дар куҷо тақсим мегардад. Роҳе, ки ба рангкунандаи редуксияшуда дар паҳлуи ситохроми c-и оксидшуда ниёз дорад, аз ҳамин интихоб вобаста аст.

Иддаои навбатӣ дар бораи роҳи канориро чӣ гуна бояд хонд

Бипурсед, ки кадом маҷмаа, бо кадом ингибитор, дар кадом ҷой ва бо кадом миқдор баста шудааст. Консентратсияи рангкунанда ва вақти ченкуниро пурсед. Дар бораи бофта, намуд, усули ҷудокунӣ, консентратсияи сафеда ва субстрат бипурсед. Ҳамчунин пурсед, ки оё потенсиал, нафаскашӣ, ҳолати оксидшавию редуксия ва санҷиши интиқоли мустақим бо ҳам мувофиқанд, зеро дар ин ҷо танҳо истеъмоли оксиген бештар аз як бор ба хулосаи нодуруст бурдааст.

Хулосаи маҳдуд ҳамоно эътибор дорад. Дар бораи роҳи канории маҷмааи I тавассути рангкунанда мувофиқа вуҷуд дорад. Дар мавриди маҷмааи III, митохондрияҳои муш бо антимицин бо 1 микрограмм ба ҳар ml ва рангкунанда бо 1 микромоляр роҳи канории функсионалиро нишон намедиҳанд, дар ҳоле ки се намуд бо антимицин бо 0.3 микромоляр ё миксотиазол бо 1 микромоляр ва рангкунанда бо 2 микромоляр роҳи канории қисманро бо интиқоли мустақим аз рангкунанда ба ситохроми c нишон медиҳанд. Ин гуфтаҳо метавонанд ҳамзамон дуруст бошанд. Ҳар хулосаи васеътар экстраполятсия аст.

Мутолиаи марбут иддаои баҳснокро дар доираи химияи бебаҳс нигоҳ медорад: кабуди метилен электронҳоро чӣ гуна интиқол медиҳад барои фаҳмидани занҷири интиқол, таҷрибаҳои роҳи канории маҷмааи I барои ҳолати тасдиқшудаи қисми болоии занҷир, ченкуниҳои потенсиали мембрана ва артефактҳои онҳо барои фаҳмидани зарурати ду рангкунанда ва коркарди озмоишгоҳии моддаҳои дар даври оксидшавию редуксия иштироккунанда барои фаҳмидани мушкилоти миқдор ва вақт.