Алтернативаҳо ба кабуди метилен барои микроскопия

Барои мазоки оддии бактериявӣ, вақте ҳадаф дидани шакли ҳуҷайра аст, бунафши кристаллӣ метавонад кабуди метиленро иваз кунад. Барои ҳуҷайраҳои зинда, алтернативаи беҳтар метавонад контрасти фазавӣ бидуни ягон рангкунӣ бошад. Интихоб аз мушоҳидае вобаста аст, ки бояд анҷом диҳед.

Фарз кунед, ду нафар як фарҳанги бактериявиро меомӯзанд. Яке мехоҳад бактерияҳои чӯбчашаклро аз ҳуҷайраҳои гирд фарқ кунад. Дигаре мехоҳад бидонад, ки оё коркард бактерияҳоро куштааст. Ранге, ки ба шахси аввал тасвири равшан медиҳад, метавонад барои шахси дуюм ҷавоби қобили истифода надиҳад.

Пеш аз интихоби ивазкунанда, ин ҷумларо пур кунед: «Ман бояд ___-ро дар ___ мушоҳида кунам ва ҳуҷайраҳо бояд / шарт нест зинда бимонанд.» Ин ҷумла вазифаеро муайян мекунад, ки ранг бояд иҷро кунад.

Аз намуна ва савол оғоз кунед

Аввал муайян кунед, ки оё ҳуҷайраҳо бояд зинда бимонанд, сипас хусусиятеро, ки бояд мушоҳида кунед, муайян намоед:

Ҳуҷайраҳо бояд зинда бимонанд: барои ҳаракат ё шакл, контрасти фазавии бе рангкунӣ ё DIC-ро баррасӣ кунед; барои ДНК-и ҳастаӣ, Hoechst 33342-ро бо флуоресценсия баррасӣ кунед; барои якпорчагии мембрана, санҷиши тасдиқшуда, ба монанди SYTO 9 бо йодиди пропидиумро интихоб кунед.
Шарт нест ҳуҷайраҳо зинда бимонанд: барои морфологияи бактериявӣ, рангкунии оддии бунафши кристаллӣ ё рангкунии манфии нигрозинро баррасӣ кунед; барои реаксияи Gram, усули пурраи рангкунии Gram-ро истифода баред; барои ДНК-и ҳастаӣ дар ҳуҷайраҳои собитшуда, флуоресценсияи DAPI-ро баррасӣ кунед.

Аз ин ҷадвал барои муқоисаи маҳдудиятҳои ҳар як шоха истифода баред. Инҳо интихоби усуланд, на дастур барои иваз кардани шишаҳои реактив дар протоколи мавҷуда.

Чиро бояд мушоҳида кунед	Намуна ва таҷҳизот	Алтернативаи эҳтимолӣ	Маҳдудияти асосӣ
Шакл ва ҷойгиршавии бактерияҳо	Мазоки омодашудаи бактериявӣ; майдони равшан	Рангкунии оддии бунафши кристаллӣ	Морфологияро нишон медиҳад; реаксияи Gram ё зиндамониро муайян намекунад.
Контури ҳуҷайраҳо дар заминаи торик	Омодасозии бактериологӣ; майдони равшан	Рангкунии манфии нигрозин	Омодасозӣ ва таркиб аҳамият доранд; ҳуҷайраи рангнашуда ҳатман зинда нест.
Реаксияи Gram	Мазоки омодашудаи бактериявӣ; майдони равшан	Усули пурраи рангкунии Gram	Пайдарпайии пурраи реактивҳо ва назоратҳоро талаб мекунад.
Ҳаракат ё тағйирот дар ҳуҷайраҳои зинда	Омодасозии тарии мувофиқ; контрасти фазавӣ ё DIC	Бе ранг	Оптикаи мувофиқро талаб мекунад; контраст молекулаи мушаххасро муайян намекунад.
ДНК-и ҳастаӣ	Ҳуҷайраҳои собитшуда; флуоресценсия	DAPI	Филтрҳои мувофиқи ангезиш ва эмиссияро талаб мекунад.
ДНК-и ҳастаӣ дар ҳуҷайраҳои зинда	Ҳуҷайраҳои зинда; флуоресценсия	Hoechst 33342	Воридшавӣ ба ҳуҷайра исбот намекунад, ки шароити тасвирбардорӣ безарар аст.
Якпорчагии мембранаи бактериявӣ	Бактерияҳои собитнашуда; флуоресценсия	SYTO 9 бо йодиди пропидиум	Рангкунии мембрана ченаки ғайримустақими зиндамонӣ аст.

Барои мазоки оддӣ, усулро боэҳтиёт иваз кунед

Бунафши кристаллӣ вақте номзади амалӣ аст, ки вазифа гирифтани намуди якранги морфологияи бактериявӣ бошад. Дастури таҳлили бактериологии FDA ду таркиби бунафши кристаллиро, ки барои рангкунии оддӣ мувофиқанд, номбар мекунад. Таркиби ҳуҷҷатгузоришуда ва усули омодасозии онро истифода баред; танҳо номи ранг реактиви кориро муайян намекунад.

Бунафши кристаллӣ инчунин дар рангкунии Gram истифода мешавад, аммо ин рангкунии оддии бунафши кристаллиро ба рангкунии Gram табдил намедиҳад. Дар протоколи рангкунии Gram-и ASM, натиҷаи фарқкунанда аз пайдарпай амал кардани бунафши кристаллӣ, йод, берангкунӣ ва рангкунии муқобил вобаста аст. Ҳазфи ин марҳилаҳо он чизеро, ки аз тасвир муайян кардан мумкин аст, тағйир медиҳад. Барои ин фарқият ба рангкунии оддӣ дар муқоиса бо рангкунии Gram нигаред.

Нигрозин роҳи дигаре барои намоён кардани контурҳо пешниҳод мекунад: он заминаро торик мекунад, дар ҳоле ки ҳуҷайраҳои бактериявӣ нисбатан равшан мемонанд. Дар дастурҳои Merck оид ба нигрозин як ҷузъиёти муҳим мавҷуд аст, ки рӯйхати умумии ивазкунандаҳо метавонад онро нодида гирад. Таркиби кории муайяншудаи он формалдегид дорад. Аз ин рӯ, танҳо аз ибораи «рангкунии манфӣ» наметавон мувофиқ будани онро барои ҳуҷайраҳои зинда хулоса кард, ҳатто агар худи ҳуҷайраҳо рангнашуда ба назар расанд. Таркиби пурра ва тарзи омодасозии намунаро санҷед.

Барои намунаҳои зинда, тағйир додани оптикаро баррасӣ кунед

Агар мехоҳед ҳаракат ё тақсимшавии ҳуҷайраҳоро мушоҳида кунед, ворид кардани ранги дигар метавонад мушоҳидаро мураккаб кунад. Тавре Nikon дар дастури худ оид ба контраст дар намунаҳои шаффоф шарҳ медиҳад, контрасти фазавӣ ва контрасти интерференсиалии дифференсиалӣ, ё DIC, намунаҳоро тавассути фарқиятҳои хосиятҳои оптикии онҳо намоён мекунанд. Онҳо метавонанд ҳуҷайраҳои зинда ва рангнашударо нишон диҳанд, ба шарте ки микроскоп ҷузъҳои зарурӣ дошта бошад.

Ин интихоб омодасозии рангнашударо нигоҳ медорад, аммо навъи иттилооти дастрасро тағйир медиҳад. Шумо метавонед сарҳад ё ҳаракатро пайгирӣ кунед, бе он ки бидонед кадом молекула контрастро ба вуҷуд овардааст. Агар савол ҷойгиршавии молекулавӣ бошад, ба ҷойи он усули мувофиқи нишонгузориро интихоб кунед.

Барои ДНК-и ҳастаӣ, муқоисаи рангҳои DAPI ва Hoechst аз Invitrogen истифодаи маъмули DAPI-ро бо ҳуҷайраҳои собитшуда аз Hoechst 33342-и дорои гузариши бештари ҳуҷайравӣ фарқ мекунад, ки барои нишонгузории ҳуҷайраҳои зинда бартарӣ дода мешавад. Ҳарду таҷҳизоти флуоресцентиро талаб мекунанд. Ҳеҷ кадоми онҳо ивазкунандаи мустақими ранги рангаи майдони равшан нестанд.

Таъсири ранг ва рӯшноиро ҳамчун шароити таҷрибавӣ баррасӣ кунед. Вақте рафтори ҳуҷайраҳо ченаки шумо аст, омодасозиҳои рангшуда ва рангнашударо муқоиса кунед.

Ҳуҷайраи сурх худ аз худ ҳуҷайраи мурда нест

SYTO 9 ва йодиди пропидиум аксар вақт якҷоя барои арзёбии якпорчагии мембранаи бактериявӣ истифода мешаванд. Дастури BacLight мембранаҳои якпорчаро бо рангкунии сабз ва мембранаҳои осебдидаро бо рангкунии сурх алоқаманд мекунад. Ин тафсир барои намуна бояд тасдиқ карда шавад.

Тадқиқоти соли 2019 аз Rosenberg ва ҳамкорон мушкилро нишон медиҳад. Дар биофилмҳои 24-соатаи E. coli рӯи шиша дар маҳлули шӯрии буферии фосфатӣ, тақрибан 96% ҳуҷайраҳо дар ҷояшон барои йодиди пропидиум мусбат ба назар расиданд. Бо вуҷуди ин, муаллифон ҳисоб карданд, ки пас аз ҷамъоварӣ 82% қобили кишт буданд. Тасвирҳои конфокалӣ ҳуҷайраҳоеро бо дохили сабз дар зери маводи сурхрангшуда нишон доданд, ки ба саҳми кислотаҳои нуклеинии берунҳуҷайравӣ дар сигнали гумроҳкунанда ишора мекард.

Ин фоизҳо ченкуниҳои гуногунро дар омодасозиҳои ҳамон тадқиқот тавсиф мекунанд, на коэффисиенти универсалии ислоҳ. Дарси муфид ин аст, ки санҷед сигналро чӣ ба вуҷуд овардааст. Дар биофилм, ранги кислотаи нуклеинӣ метавонад ҳам маводи берун аз ҳуҷайраҳо ва ҳам маводи дохили ҳуҷайраҳои осебдидаро ошкор кунад. Барои хулоса дар бораи зиндамонӣ, муҳаққиқон ченкуниҳои иловагӣ, аз ҷумла кишт ё фаъолияти метаболикиро тавсия медиҳанд ва ҳамзамон эътироф мекунанд, ки ҳар кадом маҳдудиятҳои худро доранд.

Санҷед, ки алтернатива воқеан чиро дар бар мегирад

Усули алтернативии рангкунӣ метавонад ҳамоно кабуди метилен дошта бошад. Giemsa намунаи ин аст: Merck маҳсулоти худро ҳамчун маҳлули azure-eosin-methylene-blue тавсиф мекунад, ки барои истифодаҳо, аз ҷумла мазокҳои хун ва мағзи устухон пешбинӣ шудааст. Он метавонад усули дигар барои намунаи дигар бошад, аммо талаботи хориҷ кардани кабуди метиленро қонеъ намекунад.

Агар хориҷ кардани як пайвастагӣ қисми таҷриба бошад, пеш аз муқоисаи тасвирҳо шахсияти реактив ва таркиби онро санҷед. Дастур оид ба methyl blue, methylene blue ва рангҳои дорои номҳои монанд фарқиятҳои номгузориро шарҳ медиҳад.

Пеш аз истифодаи натиҷа, ивазкуниро санҷед

Барои усули нав, бо истифода аз намунаҳои намояндагӣ ва назорати мувофиқ муқоисаи хурд анҷом диҳед. То ҳадди имкон танзимоти микроскопро қобили муқоиса нигоҳ доред. Таркиби реактив, омодасозии намуна, таъсир ва шароити тасвирбардориро сабт кунед, то тасвири беҳтарнамо таҳқиқ карда шавад, на танҳо афзал дониста шавад.

Муваффақиятро нисбат ба саволи ибтидоӣ арзёбӣ кунед. Барои морфология, санҷед, ки оё сарҳадҳо ва ҷойгиршавии ҳуҷайраҳо ҳамоно қобили тафсир ҳастанд. Барои нишонгузории ҳастаӣ, ҷойгиршавии сигнал ва заминаро арзёбӣ кунед. Барои зиндамонӣ, аз ҷудошавии ҷолиби рангҳо бештар далел талаб кунед. Дастури васеътар оид ба рангкунии кабуди метилен ва истифодаҳои лабораторӣ шарҳ медиҳад, ки мушоҳида ва омодасозӣ чӣ гуна бо ҳам мувофиқ мешаванд.

Алтернативаеро интихоб кунед, ки ченкунии зарурии шуморо нигоҳ дорад. Ранг танҳо яке аз хусусиятҳои тасвири ҳосилшуда аст.