న్యూ మిథిలీన్ బ్లూ, రెటిక్యులోసైట్‌లకు రంగు వేయడం: వేరే రంగు పదార్థం, జీవ కణాలతో చేసే పద్ధతి

ఒక విద్యార్థి రెటిక్యులోసైట్‌లను లెక్కించడానికి సిద్ధమై, మిథిలీన్ బ్లూను తెప్పించి, రక్తంతో కలుపుతాడు. కానీ దాదాపుగా ఏమీ కనిపించదు. తోటి విద్యార్థి న్యూ మిథిలీన్ బ్లూ అని లేబుల్ ఉన్న సీసాను ఉపయోగిస్తే, కొన్ని ఎర్ర రక్త కణాల్లో స్పష్టమైన నీలి తంతువులు కనిపిస్తాయి. రెండో సీసాలోని పదార్థం మరింత తాజాగా ఉందనో, ఎక్కువ గాఢతతో ఉందనో మొదటి విద్యార్థి అనుకుంటాడు. ఆ రెండూ నిజం కావు. అందులో ఉన్నది వేరే అణువు.

ఈ అంశంపై కలిగే అయోమయంలో ఎక్కువ భాగానికి మూలం ఈ భావనాపరమైన పొరపాటే. న్యూ మిథిలీన్ బ్లూ అనే పేరు, అది మిథిలీన్ బ్లూ యొక్క మెరుగుపరిచిన బ్యాచ్ అని సూచిస్తున్నట్లు అనిపిస్తుంది. కానీ రసాయనశాస్త్రం వేరే విషయం చెబుతుంది. న్యూ మిథిలీన్ బ్లూ N అనేది ప్రత్యేకమైన ఫీనోథయజీన్ రంగు పదార్థం. దానికి సొంత కలర్ ఇండెక్స్ సంఖ్య, ప్రత్యేక ప్రతిస్థాపన నమూనా, రక్తశాస్త్రంలో ప్రమాణీకరించిన పాత్ర ఉన్నాయి. ఈ తేడా స్పష్టమైతే, పద్ధతిలోని మిగతా అంశాలు—రంగు వేసేటప్పుడు కణాలు ఎందుకు జీవించి ఉండాలి, దేనిని రెటిక్యులోసైట్‌గా లెక్కించాలి, హైన్జ్ కణికల పాత్ర ఏమిటి, బ్రిలియంట్ క్రెసిల్ బ్లూను ఎప్పుడు పరిగణించాలి—సులభంగా అర్థమవుతాయి.

సంక్షిప్త సమాధానం

రక్తశాస్త్రంలో ఉపయోగించే న్యూ మిథిలీన్ బ్లూ N రియాజెంట్‌ను సాధారణంగా న్యూ మిథిలీన్ బ్లూ కోసం ఉన్న PubChem నమోదులో బేసిక్ బ్లూ 24గా గుర్తిస్తారు: C.I. 52030, CAS 1934-16-3, సూత్రం C18H22ClN3S. సాధారణ మిథిలీన్ బ్లూ దాని PubChem నమోదులో మిథైల్‌థయోనినియం క్లోరైడ్, బేసిక్ బ్లూ 9గా పేర్కొనబడింది: C.I. 52015, CAS 61-73-4, సూత్రం C16H18ClN3S. నిర్మాణపరంగా, న్యూ మిథిలీన్ బ్లూలో వలయానికి అనుసంధానమైన రెండు మిథైల్ సమూహాలు, ఇథైల్‌అమినో పక్క గొలుసులు ఉంటాయి; మిథిలీన్ బ్లూలో వాటి స్థానంలో డైమిథైల్‌అమినో సమూహాలు ఉంటాయి. ఈ తేడా రంగు పట్టే ప్రవర్తనను మారుస్తుంది. రక్తశాస్త్ర పాఠ్యగ్రంథాలు సాధారణ మిథిలీన్ బ్లూను రెటిక్యులోసైట్‌లకు రంగు వేయడంలో సాపేక్షంగా బలహీనమైనదిగా, న్యూ మిథిలీన్ బ్లూను మరింత గాఢంగా, సమానంగా రంగు ఇచ్చేదిగా వివరిస్తాయి. ఈ పోలికను న్యూ మిథిలీన్ బ్లూపై ScienceDirect అంశంలో సంక్షిప్తంగా వివరించారు.

అవును, న్యూ మిథిలీన్ బ్లూ ఒక సుప్రావైటల్ రంగు పదార్థం. సుప్రావైటల్ రంగు పద్ధతి సూత్రాలపై NCBI సమీక్ష నిర్వచనం ప్రకారం, సుప్రావైటల్ రంగు వేయడం అంటే శరీరం నుంచి తీసిన తర్వాత, స్థిరీకరణకు ముందు జీవ కణాలకు రంగు వేయడం. న్యూ మిథిలీన్ బ్లూ, బ్రిలియంట్ క్రెసిల్ బ్లూ రెండూ ఈ వర్గానికి చెందుతాయి. CLSI రెటిక్యులోసైట్ ప్రమాణం న్యూ మిథిలీన్ బ్లూను ప్రత్యేకంగా సుప్రావైటల్ రంగు పదార్థంగా పేర్కొంటుంది. విద్యార్థులు కొన్నిసార్లు దీనిని స్థిరీకరించిన స్మియర్‌లపై చేసే రొమనోవ్‌స్కీ రంగు పద్ధతితో కలిపి భావిస్తారు. ఆ అవగాహన ఇక్కడ సరిపోదు. ముందుగా స్థిరీకరిస్తే ఈ పద్ధతి పనిచేయదు.

ఇలాంటి పేర్లున్న రంగు పదార్థాల గురించి తెలుసుకుంటున్న పాఠకుల కోసం, మిథైల్ బ్లూ–మిథిలీన్ బ్లూ పోలిక ఋణావేశిత ట్రైఅరైల్‌మీథేన్ రంగు పదార్థం, ధనావేశిత ఫీనోథయజీన్ కుటుంబం మధ్య ఉండే వేరొక, మరింత పెద్ద అయోమయాన్ని వివరిస్తుంది. ప్రయోగశాల రంగు పద్ధతుల అవలోకనం స్థిరీకరించిన స్మియర్ పద్ధతులతోపాటు సుప్రావైటల్ పనిని వివరిస్తుంది. రక్త కణాల ఆకృతి మార్గదర్శిని, విస్తృత డిఫరెన్షియల్ పరిశీలనలో రెటిక్యులోసైట్ అంచనా స్థానాన్ని చూపిస్తుంది.

కేటలాగ్ విషయంలో ఒక జాగ్రత్త: న్యూ మిథిలీన్ బ్లూకు వేరొక జింక్ క్లోరైడ్ ద్విలవణ రూపం CAS 6586-05-6 కింద ఉంది. కాబట్టి పద్ధతుల విభాగంలో సాధారణ పేరును మాత్రమే కాకుండా, లవణ రూపాన్ని, సరఫరాదారును కూడా పేర్కొనాలి.

సుప్రావైటల్ రంగు వేయడం వాస్తవంగా ఏమి చేస్తుంది

రెటిక్యులోసైట్ అనేది కేంద్రకాన్ని కోల్పోయినా, మిగిలిన రైబోసోమల్ RNAను కలిగి ఉండే యువ ఎర్ర రక్త కణం. రంగు వేయని తడి నమూనాలో ఆ RNA కనిపించదు. సుప్రావైటల్ రంగు పదార్థం జీవ కణంలోకి ప్రవేశించి, ఆ RNAను అవక్షేపింపజేస్తుంది లేదా సమూహాలుగా చేరుస్తుంది. ఫలితంగా నీలి కణికలు, తంతువులు ఏర్పడతాయి. ఆయిల్ ఇమర్షన్‌లో కనిపించే జాలికాకార తంతు పదార్థం ఇదే. కాబట్టి ఆ జాలిక రంగు వేయడం వల్ల ఏర్పడే ఉత్పత్తి; రంగు కోసం ఎదురుచూస్తున్న, ముందే ఏర్పడిన అస్థిపంజరం కాదు. అందుకే విధానంలోని చరరాశులు—రంగు పదార్థం గాఢత, బఫర్, రక్తం–రంగు పదార్థం నిష్పత్తి, ఉష్ణోగ్రత, సమయం—రంగు పదార్థం పేరంత ముఖ్యమైనవి.

ఆచరణలో దీనర్థం పనుల క్రమాన్ని కచ్చితంగా పాటించాలి: ముందుగా గడ్డకట్టకుండా చేసిన రక్తాన్ని రంగు పదార్థంతో కలపాలి, ఇంక్యుబేట్ చేయాలి, తర్వాత స్మియర్‌లు తయారుచేసి స్థిరీకరించకుండా, ప్రతిరంగు వేయకుండా పరిశీలించాలి. రంగు వేయడానికి ముందు స్థిరీకరించడం లేదా పలుచని తంతువులను కప్పివేసే ప్రతిరంగును ఉపయోగించడం వల్ల లెక్కింపుకు అవసరమైన సమాచారం పోతుంది.

న్యూ మిథిలీన్ బ్లూతో ఆచరణయోగ్యమైన రెటిక్యులోసైట్ విధానం

అందరికీ వర్తించే ఒకే తయారీ మిశ్రమం లేదు. కాబట్టి ఉపయోగించిన మిశ్రమాన్ని నివేదించాలి. నమోదైన మూడు విధానాలు వాటి వైవిధ్యాన్ని చూపిస్తాయి.

సాంప్రదాయ బ్రెచర్ తరహా విధానంలో పొటాషియం ఆక్సలేట్‌తో సుమారు 0.5 percent న్యూ మిథిలీన్ బ్లూను ఉపయోగిస్తారు. దాన్ని బాగా కలిపిన EDTA రక్తంతో సమాన పరిమాణాల్లో కలిపి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద సుమారు 10 నుంచి 15 minutes ఇంక్యుబేట్ చేస్తారు. మెల్లగా మళ్లీ కలిపిన తర్వాత, పలుచని చీలిక ఆకారపు స్మియర్‌లను తయారుచేసి, గాలిలో ఆరబెట్టి, స్థిరీకరించకుండా 100x ఆయిల్ ఆబ్జెక్టివ్ కింద పరిశీలిస్తారు. రెటిక్యులోసైట్ లెక్కింపుకు NCBI విధానం ఈ పని క్రమాన్ని, దానితో ఉపయోగించే లెక్కింపు చట్రాన్ని వివరిస్తుంది.

డేసీ అండ్ లూయిస్ విధానంలో సిట్రేట్ సెలైన్‌లో 1.0 percent న్యూ మిథిలీన్ బ్లూను ఉపయోగిస్తారు. దానికి రక్తాన్ని 2 నుంచి 4 రెట్ల పరిమాణంలో కలిపి, స్మియర్‌లు తయారుచేయడానికి ముందు 37 C వద్ద 15 నుంచి 20 minutes ఉంచుతారు. CLSI H44 విధానాన్ని సమన్వయ ప్రమాణాలకు అనుగుణంగా అమలు చేసిన ఇటీవలి అధ్యయనంలో, pH 7.4 ఉన్న ఫాస్ఫేట్ బఫర్డ్ సెలైన్‌లో మరింత తక్కువ గాఢతగల 0.1 percent ద్రావణాన్ని ఉపయోగించారు. 20 C వద్ద 10 minutes ఇంక్యుబేట్ చేసి, స్థిరీకరణ చేయలేదు. దీనిని 2026 NMB సమన్వయ అధ్యయనంలో నివేదించారు.

అన్ని విధానాల్లో లెక్కింపు నియమాలు ఒకేలా ఉంటాయి. ఒక కణంలో నీలి రంగు పట్టిన కనీసం రెండు విడివిడి కణికలు లేదా తంతు భాగాలు ఉంటే, దాన్ని రెటిక్యులోసైట్‌గా లెక్కించాలి. దీనివల్ల ఒంటరిగా ఉన్న రంగు నిక్షేపాన్ని లెక్కలో చేర్చకుండా నివారించవచ్చు. సాధారణ పనిలో కనీసం 1,000 ఎర్ర రక్త కణాలను లెక్కించి, రెటిక్యులోసైట్‌లను శాతంగా నివేదించాలి. శాతం తక్కువగా ఉన్నప్పుడు గణాంకపరంగా మరిన్ని కణాలు అవసరం. రెటిక్యులోసైట్‌లు సుమారు 1 percent ఉన్నప్పుడు, లెక్కింపులో వ్యత్యాసాన్ని 5 percentకు తగ్గించడానికి సుమారు 4,400 కణాలు అవసరమని CLSI H44 పద్ధతిపై సమీక్ష పేర్కొంటుంది; ఇది De Gruyterలోని CLSI H44 సమీక్షలో వివరించబడింది. మిల్లర్ ఆక్యులర్ డిస్క్ పెద్ద సంఖ్యలో కణాలను లెక్కించడం ఆచరణయోగ్యంగా చేస్తుంది. అవక్షేపం కణాల్లోని కణికల్లా కనిపించవచ్చు కాబట్టి రంగు ద్రావణాన్ని వడపోయాలి లేదా తాజాగా తయారుచేయాలి.

అదే నమూనాలో హైన్జ్ కణికలు

అదే సుప్రావైటల్ స్మియర్‌లో హైన్జ్ కణికలను కూడా చూడవచ్చు. ఇవి మిగిలిన RNA కాదు; ఆక్సీకరణకు గురై, సహజ నిర్మాణాన్ని కోల్పోయిన హీమోగ్లోబిన్ సమూహాలు. న్యూ మిథిలీన్ బ్లూతో తయారుచేసిన నమూనాల్లో ఇవి గుండ్రని కణికలుగా కనిపిస్తాయి. తరచుగా ఒక్కొక్కటిగా, కణ త్వచం దగ్గర ఉంటాయి. జాలికాకార తంతు పదార్థంతో పోలిస్తే లేత నీలి రంగు పడుతుంది. స్థిరీకరణ, ప్రతిరంగు ప్రక్రియల్లో ఇవి సరిగా నిలవవు కాబట్టి స్థిరీకరించని స్మియర్‌ను పరిశీలించాలి. ఇటీవలి ఒక విధానంలో 20 microliters EDTA రక్తాన్ని 20 microliters 1 percent న్యూ మిథిలీన్ బ్లూతో కలిపి, 15 minutes ఇంక్యుబేట్ చేశారు. 250 ఎర్ర రక్త కణాల్లో హైన్జ్ కణికలు ఉన్న కణాలను లెక్కించారు. దీనిని ఆ విధానాన్ని నివేదించిన PMC అధ్యయనంలో వివరించారు.

రెండు తేడాలను గుర్తించడం తప్పుగా అర్థం చేసుకోకుండా నివారిస్తుంది. మొదటిది, ScienceDirectలోని హైన్జ్ కణికల అంశం పేర్కొన్నట్లుగా, మిథైల్ వైలెట్, క్రిస్టల్ వైలెట్‌లు న్యూ మిథిలీన్ బ్లూ కంటే హైన్జ్ కణికలకు మరింత గాఢంగా రంగు వేస్తాయి. రెటిక్యులోసైట్‌లు, హైన్జ్ కణికలను కలిపి అంచనా వేసేటప్పుడు న్యూ మిథిలీన్ బ్లూ అనుకూలమైన ఎంపిక; హైన్జ్ కణికల కోసమే ఉపయోగించే అత్యంత గాఢమైన రంగు పదార్థం కాదు. రెండోది, ఆల్ఫా థలసీమియా లక్షణంలో HbH అంతర్గత కణికలు సుప్రావైటల్ రంగు వేసిన తర్వాత కణమంతటా అనేక సూక్ష్మ చుక్కలుగా కనిపిస్తాయి. సాధారణ హైన్జ్ కణికలు మాత్రం సంఖ్యలో తక్కువగా, పరిమాణంలో పెద్దగా, తరచుగా కణ త్వచానికి అనుబంధంగా ఉంటాయి. మూడో అనుకరణ రంగు నిక్షేపం: ఇది కణాల ఫోకల్ సమతలం వెలుపల ఉంటుంది; పరిశీలన క్షేత్రాల మధ్య మారుతూ ఉంటుంది.

బ్రిలియంట్ క్రెసిల్ బ్లూ–న్యూ మిథిలీన్ బ్లూ పోలిక

రెండు రంగు పదార్థాలూ రెటిక్యులోసైట్‌ల కోసం ఉపయోగించే సుప్రావైటల్ రంగులే. అయితే ప్రమాణీకరణలో ఒకదానికి ప్రాధాన్యం ఉంది. ఇంటర్నేషనల్ కౌన్సిల్ ఫర్ స్టాండర్డైజేషన్ ఇన్ హీమటాలజీతో కలిసి అభివృద్ధి చేసి, CLSI H44 ప్రమాణ పేజీలో పేర్కొన్న CLSI H44-A2 రెటిక్యులోసైట్ పద్ధతి, EDTA రక్తానికి న్యూ మిథిలీన్ బ్లూతో రంగు వేయడాన్ని మాన్యువల్ తులనాత్మక పద్ధతిగా నిర్దేశిస్తుంది. కనిపించే రూపం విషయంలో సాంప్రదాయ రక్తశాస్త్ర బోధన కూడా ఇదే అభిప్రాయాన్ని వ్యక్తం చేస్తుంది: న్యూ మిథిలీన్ బ్లూ తంతువులకు మరింత గాఢంగా, సమానంగా రంగు వేస్తుంది; బ్రిలియంట్ క్రెసిల్ బ్లూ విషయంలో బ్యాచ్‌లు, నమూనాల మధ్య వ్యత్యాసం ఎక్కువగా ఉంటుంది.

ఆ స్థానాన్ని ఒక పరిమితితో అర్థం చేసుకోవాలి. ICSH అనలైజర్ మూల్యాంకన మార్గదర్శకం, న్యూ మిథిలీన్ బ్లూతో చేసే మాన్యువల్ సూక్ష్మదర్శిని పరిశీలనను సూచనాత్మక పోలిక పద్ధతిగా అంగీకరిస్తుంది. అయితే ఇది పరిశీలకుడి తీర్పుపై ఆధారపడుతుందని, సాపేక్షంగా తక్కువ ఖచ్చితత్వం కలిగినదని పేర్కొంటూ, అందుబాటులో ఉన్నచోట ఫ్లో సైటోమెట్రిక్ సూచన పద్ధతులకు ప్రాధాన్యం ఇస్తుంది. 100 నమూనాలను పోల్చిన 2022 అధ్యయనంలో, ఉపయోగించిన అనలైజర్‌తో పోల్చినప్పుడు న్యూ మిథిలీన్ బ్లూ కంటే బ్రిలియంట్ క్రెసిల్ బ్లూతో తక్కువ పక్షపాత వ్యత్యాసం కనిపించింది. దీనిని రంగు పద్ధతులపై PMC పోలిక అధ్యయనంలో నివేదించారు. విద్యార్థులకు సమర్థించగల సారాంశం ఇది: ప్రమాణీకరించిన మాన్యువల్ పోలిక కోసం న్యూ మిథిలీన్ బ్లూను ఉపయోగించండి; స్థానికంగా ఉపయోగించే ఏ బ్రిలియంట్ క్రెసిల్ బ్లూ పద్ధతినైనా దానితో లేదా స్వయంచాలక పద్ధతితో పోల్చి ధృవీకరించండి; ఏది ఉపయోగించినా మాన్యువల్ సూక్ష్మదర్శిని పరిశీలనలో ఫలితాల వ్యాప్తి ఎక్కువగా ఉంటుందని ఆశించండి. వాణిజ్య రంగు పదార్థాల బ్యాచ్‌లలో వ్యత్యాసం ఉండటం వల్ల, శుద్ధి చేసిన Azure Bను రసాయనపరంగా మరింత స్వచ్ఛమైన ప్రత్యామ్నాయంగా పాత ప్రమాణీకరణ సాహిత్యం కూడా సూచించింది. ఇది Azure Bపై మార్షల్ అధ్యయనంలో వివరించబడింది. అందుకే పద్ధతుల చర్చల్లో ఇప్పటికీ రియాజెంట్ గ్రేడ్ ప్రస్తావన వస్తుంది.

సాధారణ పొరపాట్లను నివారించడం

నమూనా తయారీ విఫలమయ్యే సందర్భాల్లో ఎక్కువ భాగానికి నాలుగు పొరపాట్లు కారణం. న్యూ మిథిలీన్ బ్లూ Nకు బదులుగా సాధారణ మిథిలీన్ బ్లూను తెప్పిస్తే, సాంకేతికత వల్ల కాదు, రసాయన స్వభావం వల్లే బలహీనంగా రంగు పడుతుంది. పరిశీలించడానికి ముందు స్థిరీకరించడం లేదా ప్రతిరంగు వేయడం సుప్రావైటల్ సంకేతాన్ని తొలగిస్తుంది. రంగు అవక్షేపాన్ని కణికలుగా లెక్కించడం ఫలితాన్ని పెంచి చూపిస్తుంది; రెండు కణికల నియమం, వడపోసిన రంగు ద్రావణం దీనిని నివారిస్తాయి. రెటిక్యులోసైట్ శాతం తక్కువగా ఉన్నప్పుడు చాలా తక్కువ కణాలను లెక్కించడం, విస్తృత విశ్వాస పరిమితులు ఉన్నప్పటికీ ఖచ్చితంగా కనిపించే సంఖ్యను ఇస్తుంది. ప్రతి పొరపాటులోనూ ఒకే లక్షణం కనిపిస్తుంది: రియాజెంట్ దశలో నిర్ణయమైన ఫలితానికి సూక్ష్మదర్శిని పరిశీలకుడు సూక్ష్మదర్శినిని తప్పుపడతాడు.