మిథిలీన్ బ్లూ మరియు ఆటోఫాజీ: AMPK, mTOR, నాడీకణ ప్రయోగాలు

మీరు కణాలపై ఒక ప్రయోగం నిర్వహించి, మిథిలీన్ బ్లూ జోడించిన తర్వాత మీ బ్లాట్‌లో LC3-II అనే ప్రోటీన్ బ్యాండ్ మరింత ముదురుగా కనిపించిందని ఊహించండి. ఆ సమ్మేళనం "ఆటోఫాజీని పెంచుతుంది" అని ప్రకటించి ముందుకు వెళ్లాలనిపించవచ్చు. కానీ ఆ నిర్ధారణ తొందరపాటు అవుతుంది. ముదురైన LC3-II బ్యాండ్ అంటే కణం వ్యర్థాలను తొలగించే మరిన్ని వెసికల్స్‌ను తయారుచేస్తోందని కావచ్చు; లేదా వ్యర్థాల తొలగింపు దశ నిలిచిపోవడంతో ఆ వెసికల్స్ పేరుకుపోతున్నాయని కూడా కావచ్చు. ఈ రెండు అర్థాలు వ్యతిరేక దిశలను సూచిస్తాయి. నాడీకణాల్లో మిథిలీన్ బ్లూపై ఉన్న పరిశోధనా సాహిత్యంలో ఈ రెండు రకాల ఆధారాలకూ ఉదాహరణలు ఉన్నాయి. వాస్తవంగా ఏమి కొలిచారో ఈ వ్యాసం ఒక్కో పరీక్షను పరిశీలిస్తూ వివరిస్తుంది.

ఇక్కడ అధ్యయనం చేసిన మాక్రోఆటోఫాజీ అనేది కణంలో పెద్ద మొత్తంలో పదార్థాలను పునర్వినియోగించే ప్రక్రియ. ఫాగోఫోర్ అనే పొరతో కూడిన సంచి అరిగిపోయిన ప్రోటీన్లు, కణాంగాల చుట్టూ పెరిగి, ఆటోఫాగోసోమ్‌గా మూసుకుపోతుంది. అది లైసోసోమ్‌తో కలిసిన తర్వాత, దానిలోని పదార్థాలు విచ్ఛిన్నమై పునర్వినియోగం కోసం విడుదలవుతాయి. నాడీకణాలు విభజించవు కాబట్టి, విభజన ద్వారా దెబ్బతిన్న భాగాల నిష్పత్తిని తగ్గించలేవు; అందువల్ల అవి ఈ ప్రక్రియపై ఆధారపడతాయి. పునర్వినియోగం నిలిచిపోతే వ్యర్థాలు పేరుకుపోతాయి. అది కొనసాగితే, ఒత్తిడిలో ఉన్న కణం నిర్మాణానికి అవసరమైన మూల పదార్థాలను తిరిగి పొందుతుంది.

ఒక హిప్పోకాంపల్ ప్రయోగం చూపించినది

ప్రధాన ప్రేరేపణ అధ్యయనంలో HT22 ఎలుక హిప్పోకాంపల్ కణాలను 24 గంటలపాటు సెరమ్ లేకుండా ఉంచి ఒత్తిడికి గురిచేశారు. ఈ పరిస్థితి వృద్ధి కారకాలను, పోషణ సంకేతాలను తొలగించి అపోప్టోసిస్, ఆటోఫాజీ రెండింటినీ ప్రేరేపిస్తుంది. మిథిలీన్ బ్లూ మోతాదును బట్టి కణ మరణాన్ని తగ్గించిందని, ఈ రక్షణతో పాటు మాక్రోఆటోఫాజీ సూచనలు కూడా కనిపించాయని పరిశోధకులు నివేదించారు.

సూచికల్లో కనిపించిన మార్పులు నిర్దిష్టంగా ఉన్నాయి. సుమారు 20 nM మిథిలీన్ బ్లూ వద్ద మొదలై, విస్తరించి ఉన్న LC3B స్టెయినింగ్ కేంద్రకం చుట్టూ చిన్న చుక్కలుగా పునర్వ్యవస్థీకరించబడింది. దాదాపు 1 μM వద్ద LC3-I, LC3-II ప్రతిస్పందన అత్యంత బలంగా కనిపించింది. LC3B-I, LC3B-II రెండూ మోతాదు, సమయాన్ని బట్టి పెరిగాయి. ముఖ్యంగా, బృందం ఒకే సమయంలో తీసిన LC3 బ్లాట్‌ను పరిశీలించడానికే పరిమితం కాలేదు. లైసోసోమ్ ద్వారా తొలగింపును అడ్డుకునే 10 μM క్లోరోక్విన్‌ను జోడించి, మిథిలీన్ బ్లూతో చికిత్స చేసిన కణాల్లో LC3-II మరింత పెరగడంతో పాటు p62 స్థిరీకరించబడిందని గుర్తించారు. ఈ నమూనా కేవలం పేరుకుపోవడాన్ని కాకుండా, లైసోసోమ్‌పై ఆధారపడిన విచ్ఛిన్నం–పునరుద్ధరణ చక్రాన్ని సూచిస్తుంది. క్లోరోక్విన్ అపోప్టోసిస్‌ను నిరోధించే ప్రభావాన్ని కొంతవరకు వెనక్కి తిప్పిందని కూడా వారు చూపించారు. ఇది ఈ నమూనాలో కనిపించిన రక్షణను ఆటోఫాజీ, లైసోసోమ్ మార్గంతో అనుసంధానిస్తుంది.

సంకేత ప్రసారానికి సంబంధించిన ఫలితమే ఎక్కువగా తప్పుగా ఉటంకించబడుతుంది. ఫాస్ఫోరిలేట్ అయిన AMPK, దాని దిగువ లక్ష్యమైన ఫాస్ఫోరిలేట్ అయిన ACC ద్వారా కొలిచిన AMPK సంకేత ప్రసారం 12, 24 గంటల వద్ద మోతాదును బట్టి పెరిగింది. చివరి 4 గంటల్లో 20 μM వద్ద ఉపయోగించిన AMPK నిరోధకం Compound C, ACC ఫాస్ఫోరిలేషన్‌ను, LC3 క్రియాశీలతను రెండింటినీ తగ్గించింది. దీనికి విరుద్ధంగా, ఫాస్ఫోరిలేట్ అయిన mTORలో గుర్తించదగిన అణచివేత కనిపించలేదు. కాబట్టి ఒత్తిడికి గురైన హిప్పోకాంపల్ కణాల్లో, స్పష్టంగా కనిపించిన మేరకు mTORపై ఆధారపడని మార్గం ద్వారా AMPKతో అనుసంధానమైన ప్రేరేపణ జరిగింది. సజీవ ఎలుకల్లోనూ ఇదే నమూనా కనిపించింది: మిథిలీన్ బ్లూ చికిత్స కార్టెక్స్, హిప్పోకాంపస్‌లో మాక్రోఆటోఫాజీ సూచికలను ప్రేరేపించింది.

ప్రేరేపణ అంటే పూర్తయిన ఫ్లక్స్ కాదు

ఇక్కడ భావనల మధ్య తేడా అత్యంత ముఖ్యం. ప్రేరేపణ అంటే ప్రారంభ దశ యంత్రాంగం మరిన్ని ఆటోఫాగోసోమ్‌లను తయారుచేయడం. ఫ్లక్స్ అంటే పదార్థాలు మొత్తం మార్గం గుండా ప్రయాణించడం: వేరుచేసి చుట్టుముట్టడం, పరిపక్వత, లైసోసోమ్‌తో కలయిక, విచ్ఛిన్నం, పునర్వినియోగం. మిగిలిన ప్రయాణాన్ని ఫ్లక్స్ పరీక్ష నిర్ధారించే వరకు, LC3-IIలో ప్రతి పెరుగుదల ప్రేరేపణకు సంబంధించిన వాదనగానే ఉంటుంది.

ప్రామాణిక ఫ్లక్స్ పరీక్షలో బాఫిలోమైసిన్ A1 లేదా క్లోరోక్విన్ వంటి పదార్థంతో స్వల్పకాలిక లైసోసోమ్ నిరోధం ఉన్నప్పుడు, లేనప్పుడు LC3-IIను కొలుస్తారు. చికిత్స నిజంగా ఉత్పత్తిని వేగవంతం చేస్తే, విచ్ఛిన్నాన్ని అడ్డుకోవడం LC3-IIను ఇంకా పెంచాలి. టాండెమ్ mCherry-GFP-LC3 రిపోర్టర్ మరో కోణాన్ని అందిస్తుంది: లైసోసోమ్‌తో కలవడానికి ముందు నిర్మాణాలు పసుపు రంగులో మెరుస్తాయి; ఆమ్లత్వం GFP సంకేతాన్ని అణచివేసిన తర్వాత ఎరుపు మాత్రమే కనిపిస్తుంది. కాబట్టి ఎరుపు మాత్రమే కనిపించే చుక్కలు పెరగడం, ఆమ్ల ఆటోలైసోసోమ్‌లలోకి ప్రక్రియ ముందుకు సాగుతోందనడానికి మద్దతిస్తుంది. p62 ప్రోటీన్ తగ్గడం పదార్థాల విచ్ఛిన్నం–పునరుద్ధరణ చక్రాన్ని బలపరచవచ్చు. అయితే p62 ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కూడా ఒత్తిడికి ప్రతిస్పందిస్తుందనే విషయాన్ని గుర్తుంచుకుని, దానిని mRNA స్థాయిలో తనిఖీ చేయాలి.

దిగువ తనిఖీ జాబితా ఈ పరిశోధనా సాహిత్యంలో ఉపయోగించిన ప్రతి పరీక్ష ఏమి కొలుస్తుందో, ఒంటరిగా ఏమి నిరూపించలేదో చూపిస్తుంది. ఈ సూచికలను ఆధారంగా తీసుకునే ఉపవాసం, దీర్ఘాయుష్షుపై వాదనలు సహా, భవిష్యత్తులో వచ్చే ఏ మాక్రోఆటోఫాజీ వాదనకైనా పాఠకులు దీనిని ఉపయోగించవచ్చు.

ఈ పట్టిక నివారించే ఒక పదప్రయోగపు పొరపాటును గమనించండి. ఫాస్ఫోరిలేట్ అయిన ACC అనేది ఎంజైమ్ క్రియ అణచివేయబడిన రూపం. అది పెరగడం AMPK ప్రతిస్పందనను చూపిస్తుంది, ACC క్రియాశీలతను కాదు.

"మాక్రోఆటోఫాజీ నిరోధం నాడీకణ రక్షణను రద్దు చేసింది" అనే పదబంధానికీ అదే ఖచ్చితత్వం అవసరం. HT22 నమూనాలో దాని అర్థం, ఆటోఫాజీ, లైసోసోమ్ మార్గంలో జోక్యం చేసుకోవడం వల్ల సెరమ్ లేని పరిస్థితిలో మిథిలీన్ బ్లూ అందించిన జీవన ప్రయోజనం తొలగిపోయిందని. ఆ కల్చర్ పాత్రలో ఆటోఫాజీ అవసరమైనదని లేదా దోహదపడిందని ఇది సమర్థిస్తుంది. ఆటోఫాజీయే ఆ సమ్మేళనం యొక్క ఏకైక రక్షణ యంత్రాంగమని ఇది నిర్ధారించదు; క్లోరోక్విన్ కేవలం ఆటోఫాజీ ద్వారానే పనిచేస్తుందని నిరూపించదు. కారణ సంబంధ వాదనను మరింత బలపరచడానికి ATG5, ATG7 లేదా ULK1లో జన్యుపరమైన మార్పులు చేసి పరీక్షించాల్సి ఉంటుంది.

ఒకే యంత్రాంగంలోకి రెండు మార్గాలు

ఒక సరళమైన పటం ఉపయోగపడుతుంది. శక్తి ఒత్తిడి AMPKను పెంచుతుంది, AMPK, ULK1 సముదాయాన్ని క్రియాశీలం చేస్తుంది, ఆటోఫాజీ ప్రారంభమవుతుంది. వృద్ధి కారకాలు, పోషకాలు mTORC1ను పెంచుతాయి, mTORC1, ULK1ను నిరోధిస్తుంది, ఆటోఫాజీ ప్రారంభం కాకుండా ఉంటుంది. ULK1కు దిగువన, Beclin-1, VPS34 సముదాయం ఫాగోఫోర్ ఏర్పాటును ప్రారంభిస్తుంది. LC3-I లిపిడేషన్ ద్వారా LC3-IIగా మారుతుంది; ఆటోఫాగోసోమ్ మూసుకుపోయి లైసోసోమ్‌తో కలుస్తుంది; లోపలి పదార్థాలు విచ్ఛిన్నమవుతాయి, p62 కూడా విచ్ఛిన్నం–పునరుద్ధరణ చక్రంలోకి వెళుతుంది.

ఈ పటం ప్రతి మిథిలీన్ బ్లూ ఫలితాన్ని సంబంధిత స్థానంలో చూపిస్తుంది: హిప్పోకాంపల్ ఫలితాన్ని AMPK శాఖ పక్కన, పూర్వగామి కణ ఫలితాన్ని mTOR శాఖ పక్కన.

ఈ వివరణ రెండో Xie అధ్యయనంతో కనిపించే అసంగతతను పరిష్కరిస్తుంది. విస్తరిస్తున్న ర్యాట్ నాడీ పూర్వగామి కణాల్లో, 5 μM మిథిలీన్ బ్లూ కణ విస్తరణను నిరోధించి నిశ్చల స్థితిని ప్రోత్సహించిందని ఒక ప్రత్యేక ప్రయోగం కనుగొంది. 1, 3 రోజుల వద్ద Ki67 పాజిటివ్ కణాలు తగ్గాయి, అయితే ఇప్పటికే నాడీకణాలుగా మారే దిశలో ఉన్న కణాల విభేదీకరణ చెక్కుచెదరలేదు. అక్కడి యంత్రాంగం mTOR సంకేత ప్రసారాన్ని అణచివేయడం ద్వారా పనిచేసింది: మొత్తం mTOR, ఫాస్ఫోరిలేట్ అయిన mTOR తగ్గడంతో పాటు p70S6K, 4EBP1 వ్యక్తీకరణ తగ్గింది; సైక్లిన్లు E1, B1, D1, D2 వ్యక్తీకరణ కూడా తగ్గింది. ప్రధానంగా కనిపించిన లక్షణం పూర్వగామి కణాల నిశ్చల స్థితి. రచయితలు దానిని కణ వార్ధక్యం ఆలస్యమవడంతో అనుసంధానించారు, ఒత్తిడికి గురైన హిప్పోకాంపల్ కణాల రక్షణతో కాదు.

ఈ రెండు పత్రాల మధ్య వైరుధ్యం లేదు. AMPK, mTOR పరిస్థితులకు అనుగుణంగా సమాచారాన్ని సమన్వయించే వ్యవస్థలు, స్థిరమైన స్విచ్‌లు కావు. ఒత్తిడికి గురైన నాడీకణాన్ని పోలిన కణం, కొలవదగిన mTOR నిరోధం లేకుండానే AMPKను క్రియాశీలం చేయవచ్చు. అదే సమయంలో, మైటోజెన్ ప్రేరేపిత పూర్వగామి కణం అదే సమ్మేళనానికి ప్రతిస్పందనగా mTORపై ఆధారపడిన వృద్ధి యంత్రాంగాన్ని మందగించవచ్చు. కణ రకం, ఒత్తిడి సందర్భం, సాంద్రత, పరిశీలించిన సమయ బిందువు ఏ శాఖ ప్రధానంగా పనిచేస్తుందో నిర్ణయిస్తాయి. అందుకే మిథిలీన్ బ్లూ మైటోకాండ్రియల్ శక్తి, రెడాక్స్ ప్రభావాలను కూడా ఇదే చిత్రంలో చూడాలి: నాడీకణ రక్షణ యంత్రాంగాలపై ఒక సమీక్ష వివరించినట్లు, ఈ సమ్మేళనం ప్రత్యామ్నాయ ఎలక్ట్రాన్ వాహకంగా పనిచేస్తుంది, యాంటీఆక్సిడెంట్, అపోప్టోసిస్ నిరోధక సంకేత ప్రసారాన్ని క్రియాశీలం చేస్తుంది, MAO, NOSను నిరోధిస్తుంది, జీవోత్పత్తి, ఆటోఫాజీ ద్వారా మైటోకాండ్రియా పునరుద్ధరణతో అనుసంధానమవుతుంది. అనేక ప్రభావాలు కలిగిన ఈ సమ్మేళనంలో ఆటోఫాజీ ఒక శాఖ మాత్రమే, మొత్తం కథ కాదు.

ప్రయోగాలు చూపించనివి

సెరమ్ లేకుండా ఉంచడం అనేది కల్చర్ పాత్రలో పోషణ, జీవక్రియ ఒత్తిడిని ప్రతిబింబించే నమూనా. అది మొత్తం జీవి ఉపవాసానికి నమూనా కాదు: ప్రాథమిక కల్చర్ మాధ్యమంలో గ్లూకోజ్, అమినో ఆమ్లాలు, లవణాలు అలాగే ఉంటాయి; ఆహారం తీసుకునే ప్రవర్తన ఉండదు. 20 nM నుంచి 5 μM వరకు ఉన్న కల్చర్ సాంద్రతలను లెక్కల ద్వారా మానవ మోతాదులుగా మార్చలేం. ఎందుకంటే శోషణ, ప్రోటీన్ బంధనం, రెడాక్స్ స్థితి, జీవక్రియ, కణజాలాల్లో పేరుకుపోవడం, ఎక్స్‌పోజర్ వ్యవధి అన్నీ భిన్నంగా ఉంటాయి.

రోగుల్లో మిథిలీన్ బ్లూ ప్రేరేపించిన ఆటోఫాజీ ఫ్లక్స్‌ను చూపించడానికి రూపొందించిన మానవ ప్రయోగం ఏదీ లేదు. యంత్రాంగానికి సంబంధించిన ఆధారాలు ఇప్పటికీ కణస్థాయి, ఎక్స్ వివో, జంతు పరిశోధనలకే పరిమితమయ్యాయి; వాటిని క్లినికల్ సందర్భానికి వర్తింపజేసే ఆధారాలు ప్రాథమిక దశలోనే ఉన్నాయని సమీక్షలు ఇప్పటికీ వివరిస్తున్నాయి. కాబట్టి మిథిలీన్ బ్లూ ఉపవాసాన్ని పునరుత్పత్తి చేస్తుందని, ఆటోఫాజీ ద్వారా మానవ ఆయుష్షును పొడిగిస్తుందని, లేదా మానవ మెదడులో ఆటోఫాజీ ఫ్లక్స్‌ను పూర్తి చేస్తుందని ఈ అధ్యయనాలు చూపించవు. ఉపవాసాన్ని అనుకరించడం, దీర్ఘాయుష్షు గురించి చేసే వాదనలకు వాటికంటూ క్లినికల్ ఆధారాలు అవసరం. ఇతర ఉపయోగాల కోసం నిర్వహించిన మానవ మిథిలీన్ బ్లూ ప్రయోగాలు, సంబంధం ఉన్నంత మాత్రాన ఆటోఫాజీ ప్రయోగాలుగా మారవు. పోషక ఒత్తిడి, దీర్ఘాయుష్షు నమూనాలపై పరిశోధనను ఈ హద్దును గుర్తుంచుకుని చదవాలి.

మీరు చదివే తదుపరి పత్రానికి ఈ తనిఖీ జాబితాను క్రమంగా వర్తింపజేయండి. మొదట ఏ శాఖలో మార్పు వచ్చిందో అడగండి: AMPK, mTOR, లేదా రెండింటిలోనూ లేదా. తర్వాత LC3 ఫలితంతో పాటు ఫ్లక్స్ పరీక్ష చేశారా, లేక అది ఒంటరి ఫలితమా అని అడగండి. ఆపై మార్గాన్ని నిరోధించడం ప్రయోజనాన్ని తొలగించిందా, ఏ పద్ధతిలో తొలగించిందో తనిఖీ చేయండి. ఈ మూడింటికీ సమాధానం ఇచ్చిన అధ్యయనం బలమైన యంత్రాంగ వాదనకు అర్హత సాధించింది. మొదటి ప్రశ్నకు మాత్రమే సమాధానం ఇచ్చిన అధ్యయనం ఒక అనుమతి సంకేతాన్ని చూపించింది; మిగిలిన ప్రయాణం ఇంకా పటంలో నమోదు కాలేదు.