మిథిలీన్ బ్లూ సరళ రంజనం, గ్రామ్ రంజనం: ప్రతి పద్ధతి ఏమి నిరూపించగలదు

ఒక విద్యార్థి E. coli అని లేబుల్ చేసిన కల్చర్ నుంచి స్మియర్‌ను సిద్ధం చేసి, దానిపై ఒక నిమిషం పాటు మిథిలీన్ బ్లూ పోసి, కడిగి, ఆయిల్ ఇమ్మర్షన్ లెన్స్ ద్వారా చూస్తాడు. దృశ్యక్షేత్రమంతా నీలి దండాకార కణాలు కనిపిస్తాయి. ప్రయోగశాల నివేదికలో ఇలా రాస్తాడు: "గ్రామ్-నెగటివ్ దండాకార కణాలను E. coliగా గుర్తించాం." పరిశీలన సరైనదే. కానీ ఆ స్లైడ్ ఆధారంగా ఆ నిర్ధారణకు రావడం సమర్థనీయం కాదు.

ఈ పొరపాటు భావనకు సంబంధించినది, సాంకేతికమైనది కాదు. విద్యార్థి సరళ రంజనాన్ని భేదక పరీక్షగా భావించాడు. సరళ రంజనం, గ్రామ్ రంజనం వేర్వేరు రంజన భావనలపై ఆధారపడతాయి కాబట్టి వేర్వేరు ప్రశ్నలకు సమాధానమిస్తాయి. ఒకటి అడిగేది: ఏ ఆకారం ఉంది? మరొకటి అడిగేది: పరీక్షకు గురిచేసినప్పుడు కణ గోడ ఎలా ప్రవర్తిస్తుంది? ఈ రెండింటినీ కలిపేస్తే, సరిగ్గా రంజనం చేసిన స్లైడ్ నుంచి కూడా ఆధారం లేని నివేదిక వస్తుంది.

ఈ పోలిక రెండు పద్ధతుల మధ్య తేడాను స్పష్టంగా ఉంచుతుంది, ప్రతి ఫలితం ఆధారంగా మీరు ఏమి చెప్పవచ్చో చూపుతుంది, విద్యార్థులు ఎక్కువగా అడిగే రెండు ప్రశ్నలకు సమాధానమిస్తుంది: గ్రామ్ రంజనంలో మిథిలీన్ బ్లూను వాడవచ్చా, E. coliపై మిథిలీన్ బ్లూ రంజనం వాస్తవంగా ఏమి చూపుతుంది?

సంక్షిప్త సమాధానం

మిథిలీన్ బ్లూ సరళ రంజనం రంగు పట్టే ప్రతి కణానికీ ఒకే నీలి రంగును ఇస్తుంది. అందువల్ల అది ఆకృతిని (దండాలు, గోళాలు, సర్పిలాలు), అమరికను (విడివిడిగా, జంటలుగా, గొలుసులుగా) వెల్లడిస్తుంది; గ్రామ్ వర్గం గురించి ఏమీ చెప్పదు. గ్రామ్ రంజనంలో అయోడిన్, రంగు తొలగింపు దశ, ప్రతిరంజకం ఉంటాయి. కాబట్టి కణ ఆవరణాలు రంగును నిలుపుకునే తీరు ఆధారంగా అది బ్యాక్టీరియాను గ్రామ్-పాజిటివ్ (ఊదా), గ్రామ్-నెగటివ్ (గులాబీ లేదా ఎరుపు) వర్గాలుగా వేరు చేస్తుంది. మిథిలీన్ బ్లూ తర్వాత నీలి దండాకార కణాలు కనిపిస్తే, దాని అర్థం "దండాకార కణాలు ఉన్నాయి." పూర్తి గ్రామ్ రంజన క్రమం తర్వాత గులాబీ దండాకార కణాలు కనిపిస్తే, దాని అర్థం "గ్రామ్-నెగటివ్ దండాకార కణాలు ఉన్నాయి." రెండో ప్రకటనకు మరింత బలమైన ఆధారం ఉంది, ఎందుకంటే ఆ ప్రక్రియలో అదనపు పరీక్ష జరిగింది.

ఈ వ్యాసం భాగమైన, ఒకే రంజకాన్ని ఉపయోగించే విస్తృత బ్యాక్టీరియా పద్ధతుల సమూహం గురించి తెలుసుకోవడానికి సూక్ష్మదర్శిని రంజన అట్లాస్‌ను చూడండి.

సరళ రంజనం: ఒక రంజకం, ఒక ప్రశ్న

మిథిలీన్ బ్లూ ఒక బేసిక్ (కాటయానిక్) రంజకం. దాని రంగు అయాన్ ధన ఆవేశాన్ని కలిగి ఉంటుంది. అది కణంలోని న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాలు, ఆమ్ల స్వభావం గల ఉపరితల సమూహాలు సహా ఋణ ఆవేశం ఉన్న నిర్మాణాలకు బంధిస్తుంది. అందువల్ల లేత నేపథ్యంపై కణాలు నీలంగా కనిపిస్తాయి. OpenStax తన రంజన అధ్యాయంలో ఈ పాజిటివ్ రంజన సూత్రాన్ని వివరిస్తుంది. రంజక కాటయాన్ అనేది మిథిలీన్ బ్లూ రసాయనశాస్త్ర సూచన వ్యాసంలో వివరించిన చిన్న, సమతల ఫీనోథయజీన్ అయాన్; క్లోరైడ్ ప్రతిఅయాన్ రంగును ఇవ్వదు.

ప్రామాణిక బోధనా విధానాన్ని ఉద్దేశపూర్వకంగానే సరళంగా ఉంచుతారు: పలుచని స్మియర్‌ను తయారు చేయాలి, గాలిలో ఆరబెట్టాలి, వేడితో స్థిరీకరించాలి, సుమారు 1% జలీయ మిథిలీన్ బ్లూతో దాదాపు ఒక నిమిషం పాటు కప్పాలి, నీటితో మెల్లగా కడగాలి, పీల్చుకునే కాగితంతో తేమను అద్దుతూ ఆరబెట్టాలి, ఆయిల్ ఇమ్మర్షన్‌తో పరిశీలించాలి. LibreTexts బోధనా విధానం సరిగ్గా ఈ 1%, ఒక నిమిషం పద్ధతినే ఇస్తుంది; కొన్ని ప్రయోగశాలలు సమయాన్ని పెంచుతాయని కూడా పేర్కొంటుంది. రంగు బంధకం లేదు, రంగు తొలగించే కారకం లేదు, రెండో రంజకం లేదు. అవి లేకపోవడమే ఇక్కడ ముఖ్యమైన విషయం. ఒకే రంజకం ఉండి, ఎంపిక చేసిన కణాల నుంచి రంగును తొలగించే దశ లేకపోవడంతో, రంగును బంధించే ప్రతి కణం చివరికి ఒకే రంగులో ఉంటుంది.

E. coli విషయంలో, విడివిడిగా లేదా జంటలుగా లేదా చిన్న సమూహాలుగా ఉన్న నీలి దండాకార కణాలు (బాసిల్లై) కనిపించడం సాధారణంగా ఆశించే దృశ్యం. నీలి రంగు రంజకం వల్ల వస్తుంది. దండాకారం జీవి వల్ల వస్తుంది. కానీ ఈ రెండూ కలిసినా జీవిని గుర్తించలేవు, ఎందుకంటే అనేక జాతులు దండాకారంలో ఉంటాయి; సరళ రంజనంలో అనేక దండాకార కణాలు నీలంగా రంగు పులుముకుంటాయి. ATCC తన సూక్ష్మజీవశాస్త్ర కల్చర్ మార్గదర్శినిలో ఈ ఆకృతి-మాత్రమే అనే పరిమితిని స్పష్టంగా చెబుతుంది. సరైన నివేదిక ఇలా ఉంటుంది: "నీలి బాసిల్లై కనిపించాయి." ఆకారం, అమరికకు మించి ఏదైనా చెప్పాలంటే మరింత ఆధారం అవసరం.

గ్రామ్ రంజనం: నాలుగు కారకాలు, ఒక ప్రవర్తనా పరీక్ష

గ్రామ్ రంజనం ఒక భేదక రంజన పద్ధతి. ఇది అన్ని కణాలనూ ఒకే క్రమానికి గురిచేసి, ఏ కణాలు మొదటి రంజకాన్ని నిలుపుకుంటాయో, ఏవి కోల్పోతాయో పరిశీలిస్తుంది. అమెరికన్ సొసైటీ ఫర్ మైక్రోబయాలజీ గ్రామ్ రంజన విధానాలు ప్రామాణిక నాలుగు దశల క్రమాన్ని నిర్వచిస్తాయి: క్రిస్టల్ వైలెట్ (ప్రాథమిక రంజకం), గ్రామ్ అయోడిన్ (రంగు బంధకం), ఆల్కహాల్ లేదా అసిటోన్ ఆల్కహాల్ (రంగు తొలగించే కారకం), ఆ తర్వాత సాఫ్రనిన్ (ప్రతిరంజకం).

ప్రామాణిక బోధనా నమూనా ఈ విభజనను కణ ఆవరణ నిర్మాణం ద్వారా వివరిస్తుంది. గ్రామ్-పాజిటివ్ కణాలకు మందమైన పెప్టిడోగ్లైకాన్ గోడ ఉంటుంది. ఆల్కహాల్‌తో కడిగేటప్పుడు అది నీటిని కోల్పోయి, క్రిస్టల్ వైలెట్–అయోడిన్ సంక్లిష్ట సమ్మేళనాన్ని నిలుపుకుంటుంది. గ్రామ్-నెగటివ్ కణాలకు పలుచని పెప్టిడోగ్లైకాన్ పొరతో పాటు లిపిడ్లు అధికంగా ఉన్న బాహ్య పొర ఉంటుంది. రంగు తొలగించే కారకం ఆ బాహ్య పొరను దెబ్బతీస్తుంది. దాంతో సంక్లిష్ట సమ్మేళనం కడిగి తొలగిపోతుంది; ఆ తర్వాత కణాలు సాఫ్రనిన్‌ను గ్రహిస్తాయి. NCBI Bookshelf గ్రామ్ రంజన సమీక్ష ఈ కణ గోడ వివరణను ఇస్తుంది. పూర్తి భౌతిక రసాయన ప్రక్రియ గోడ మందం ఒక్కదానికే పరిమితం కాకుండా మరింత సంక్లిష్టంగా ఉంటుందని నిపుణులు చెబుతారు. అయినప్పటికీ ప్రయోగశాల ఫలితాలను అర్థం చేసుకోవడానికి ఈ ప్రవర్తనా నియమం వర్తిస్తుంది: ఊదా అంటే మొదటి రంగు నిలిచింది; గులాబీ అంటే మొదటి రంగు పోయి, తర్వాత ప్రతిరంజకం పట్టింది.

వివరణాత్మక ప్యానెల్‌లు. పద్ధతుల పోలిక కోసం రూపొందించిన శైలీకృత చిత్రాలు, కెమెరాతో తీసిన సూక్ష్మదర్శిని ఛాయాచిత్రాలు కావు. తర్కాన్ని బోధించడానికి రంగులను సరళీకరించారు: సరళ రంజనంలో ఒక రంగు, గ్రామ్ రంగు తొలగింపు తర్వాత రెండు రంగులు.

గ్రామ్ రంజనంలో మిథిలీన్ బ్లూను ఉపయోగించవచ్చా

ఈ ప్రశ్నకు రెండు అర్థాలు ఉన్నాయి; వాటికి వేర్వేరు సమాధానాలు అవసరం.

మొదటి అర్థం: మిథిలీన్ బ్లూను ఒక్కసారి పోయడం మొత్తం గ్రామ్ రంజన క్రమానికి ప్రత్యామ్నాయం కాగలదా? కాదు. అయోడిన్, రంగు తొలగించే కారకం, ప్రతిరంజకం లేకుండా భేదక దశ ఉండదు. కాబట్టి ఏ గ్రామ్ వర్గాన్నీ పరీక్షించినట్లు కాదు. మిథిలీన్ బ్లూ ఒక్కటే వాడిన తర్వాత కనిపించే నీలి దృశ్యక్షేత్రం సరళ రంజన ఫలితమే, ఆ సీసా గ్రామ్ రంజన కారకాల పక్కనే ఉన్నా సరే. దానిని గ్రామ్ ఫలితంగా నమోదు చేయవద్దు.

రెండో అర్థం: 4వ దశలో ప్రతిరంజకంగా సాఫ్రనిన్ స్థానంలో మిథిలీన్ బ్లూను వాడవచ్చా? పనితీరు పరంగా అది రంగు తొలగిపోయిన కణాలకు రంగునివ్వగలదు. అలా మార్చితే గ్రామ్-పాజిటివ్ కణాలు ఊదాగా, గ్రామ్-నెగటివ్ కణాలు నీలంగా కనిపిస్తాయని ఒక పాఠ్యపుస్తక అభ్యాసం అంచనా వేస్తుంది. ఈ తర్కం సరైనదే, ఎందుకంటే సరిగ్గా రంగు తొలగించిన గ్రామ్-నెగటివ్ కణాలు దాదాపు రంగులేనివిగా ఉండి, మరో కాటయానిక్ రంజకాన్ని గ్రహిస్తాయి. కానీ ఇది ప్రామాణిక విధానం కాదు. ASM విధానాలు సాఫ్రనిన్‌ను పేర్కొంటాయి; కొన్ని రూపాంతరాల్లో బేసిక్ ఫ్యూక్సిన్ వంటి గుర్తింపు పొందిన ప్రత్యామ్నాయాలు ఉంటాయి, మిథిలీన్ బ్లూ కాదు. ఒక ఆచరణాత్మక ఇబ్బంది కూడా ఉంది: ఊదా రంగుతో పోల్చినప్పుడు గులాబీని వేరు చేయడం కంటే నీలాన్ని వేరు చేయడం కష్టం. ముఖ్యంగా ప్రారంభ స్థాయిలో ఉన్నవారికి, కాంతి బలహీనపడిన సూక్ష్మదర్శిని దీపాల కింద ఇది మరింత కష్టమవుతుంది. పాఠ్యాభ్యాసంలోనూ, ప్రాముఖ్యత గల ఏ ఫలితం కోసమైనా మీ విధానం సూచించే ప్రతిరంజకాన్నే వాడండి; సాధారణంగా అది సాఫ్రనిన్. మిథిలీన్ బ్లూ ప్రతిరంజనాన్ని సమానమైన ప్రామాణిక పద్ధతిగా కాకుండా, ప్రదర్శన కోసం ఉపయోగించే రూపాంతరంగా పరిగణించండి.

మిథిలీన్ బ్లూను ఇతర ఏక-రంజక ఎంపికలతో ఎలా పోల్చాలి అనే సంబంధిత ప్రశ్నను సరళ బ్యాక్టీరియా రంజనాల పోలికలో చర్చించారు.

E. coli మిథిలీన్ బ్లూ రంజనం ఏమి నిరూపిస్తుంది, ఏమి నిరూపించదు

E. coli ఒక గ్రామ్-నెగటివ్ దండాకార జీవి. కానీ ఆ వాక్యం అనేక పద్ధతుల నుంచి వచ్చిన విషయాలను కలుపుతుంది: ఆకృతి సూక్ష్మదర్శిని పరిశీలన నుంచి, గ్రామ్ ప్రతిచర్య గ్రామ్ రంజనం నుంచి, గుర్తింపు కల్చర్‌తో పాటు జీవరసాయన లేదా అణు స్థాయి పరీక్షల నుంచి వస్తాయి. మిథిలీన్ బ్లూ స్మియర్ మొదటి భాగానికి మాత్రమే ఆధారం ఇస్తుంది. రంజనం చేసిన నమూనాలో దండాకార కణాలు ఉన్నాయని, అవి ఎలా అమరి ఉన్నాయని అది నిర్ధారిస్తుంది. రంగు తొలగింపు పరీక్ష చేయలేదు కాబట్టి అది గ్రామ్ ప్రతిచర్యను నిర్ధారించదు. ఈ స్థాయి స్పష్టతలో అనేక జాతుల దండాకార కణాలు ఒకేలా కనిపిస్తాయి కాబట్టి అది జాతిని గుర్తించదు.

ఇక్కడే నివేదికలు సాధారణంగా ఒకే విధంగా తప్పుదోవ పడతాయి. నివేదిక రాసేవారు నేపథ్య పరిజ్ఞానాన్ని ("ఈ కల్చర్ E. coli అయి ఉండాలి, E. coli గ్రామ్-నెగటివ్") పరిశీలన వాక్యంలోకి తెస్తారు. దాంతో వాస్తవానికి ముందే ఊహించిన విషయాన్ని స్లైడ్ నిర్ధారించినట్లు కనిపిస్తుంది. మరింత స్పష్టమైన నివేదిక ఈ అంశాలను వేరు చేస్తుంది: "మిథిలీన్ బ్లూ సరళ రంజనం: నీలి బాసిల్లై కనిపించాయి; ఆకృతి మాత్రమే, గ్రామ్ వర్గాన్ని పరీక్షించలేదు." తర్వాత, నియంత్రణ నమూనాలతో గ్రామ్ రంజనాన్ని సరిగ్గా నిర్వహించి ఉంటే: "గ్రామ్ రంజనం: గులాబీ దండాకార కణాలు, గ్రామ్-నెగటివ్‌కు అనుగుణంగా ఉన్నాయి." జాతి గుర్తింపు ఆ తర్వాత గుర్తింపు ప్రక్రియ నుంచి వస్తుంది, రంగు ఒక్కదాని నుంచి కాదు.

ఫలితాలను అర్థం చేసుకోవడానికి ఆచరణాత్మక మార్గదర్శిని

ప్రయోగశాలలో ఈ నిర్ణయ నియమాన్ని ఉపయోగించండి. అన్ని కణాలూ ఒకే రంగులో ఉండి, విధానంలో రంగు తొలగించే కారకం లేకుండా ఒకే రంజకాన్ని వాడితే, మీరు సరళ రంజనం చేశారు. ఆకారం, పరిమాణ అంచనా, అమరికను నివేదించండి. అక్కడితో ఆపండి. తెలిసిన పాజిటివ్, నెగటివ్ నియంత్రణ నమూనాలతో పాటు క్రిస్టల్ వైలెట్, అయోడిన్, రంగు తొలగించే కారకం, ప్రతిరంజకాన్ని విధానంలో వాడితే, మీరు గ్రామ్ రంజనం చేశారు. రంగుతో పాటు ఆకృతిని నివేదించండి: గొలుసులుగా ఉన్న ఊదా గోళాకార కణాలు, గులాబీ దండాకార కణాలు, తదితరాలు.

చాలావరకు గందరగోళానికి మూడు పొరపాట్లు కారణం. మొదటిది, నీలి దండాకార కణాలను చూసి E. coli నిర్ధారణగా అతిగా అర్థం చేసుకోవడం. రెండోది, నోట్‌బుక్‌లో మిథిలీన్ బ్లూ స్లైడ్‌ను "గ్రామ్ రంజనం" శీర్షిక కింద నమోదు చేయడం; తర్వాత చదివేవారు దానిని తప్పుగా అర్థం చేసుకుంటారు. మూడోది, ప్రతిరంజకాలను యథేచ్ఛగా మార్చి, తర్వాత వేర్వేరు ప్రయోగశాలల రంగుల ఫలితాలను ఒకే రంగుల వ్యవస్థ వాడినట్లు పోల్చడం. ప్రతి పొరపాటుకూ పరిష్కారం ఒకటే: వాస్తవంగా నిర్వహించిన పద్ధతి పేరును చెప్పండి; ఆ పద్ధతి పరీక్షించే విషయాన్ని మాత్రమే పేర్కొనండి.

సరళ రంజనం పరిమిత విషయాలను మాత్రమే తెలియజేస్తుంది కాబట్టే దానికి ఒక ప్రత్యేక స్థానం ఉంది. ఇది వేగంగా పూర్తవుతుంది, చిన్న తేడాలను తట్టుకుంటుంది, ప్రశ్న ఆకృతికి సంబంధించినదైతే సరిపోతుంది: అక్కడ ఏమైనా ఉందా, ఉంటే దాని ఆకారం ఏమిటి? ప్రశ్న వర్గీకరణకు సంబంధించినదైతే, భేదక పరీక్షను నిర్వహించండి. నీలి స్లైడ్ కణాలు ఎలా కనిపిస్తాయో చెబుతుంది. ఊదా లేదా గులాబీ స్లైడ్ వాటి గోడలు ఎలా ప్రవర్తిస్తాయో చెబుతుంది. ఏ స్లైడ్ కూడా, ఒక్కటే, జాతి ఏమిటో చెప్పదు.