మిథిలీన్ బ్లూ ప్రయోగాల్లో క్రియాశీల ఆక్సిజన్ జాతులను కొలవడం

రెండు ప్రయోగశాలలు మిథిలీన్ బ్లూ యాంటీఆక్సిడెంట్ ప్రయోగం అని తాము పిలిచే ప్రయోగాలను నిర్వహిస్తాయి. ఒకటి ఈ రంగు పదార్థం క్రియాశీల ఆక్సిజన్ జాతులను తగ్గిస్తుందని నివేదిస్తుంది. మరొకటి వాటిని ఉత్పత్తి చేస్తుందని నివేదిస్తుంది. రెండూ స్పష్టమైన మోతాదు ప్రతిస్పందన వక్రరేఖలను చూపిస్తాయి. రెండూ నిజాయితీగా పనిచేస్తున్నాయి. ఈ తేడాకు కారణం మోసం లేదా అసమర్థత కాదు. రెండు బృందాలు వేర్వేరు కాంతి పరిస్థితుల్లో, వేర్వేరు ప్రశ్నలకు సమాధానం ఇచ్చే ప్రోబ్‌లతో వేర్వేరు విషయాలను కొలిచి, ఆ రెండు సమాధానాలనూ ఒకే పదంతో వర్ణించాయి: ROS.

మిథిలీన్ బ్లూను కచ్చితంగా కొలవడం కష్టం. ఎందుకంటే అది పరిశీలించాల్సిన రసాయన ప్రక్రియలో తానే పాల్గొంటుంది. చీకటిలో అది దాతలు, గ్రహీతల మధ్య ఎలక్ట్రాన్‌లను బదిలీ చేస్తూ తన ప్రారంభ రూపానికి తిరిగి వస్తుంది, మరో చక్రానికి సిద్ధమవుతుంది. కాంతిలో అది కాంతి సున్నితీకరణ కారకంగా మారి, ఉత్తేజిత ట్రిప్లెట్ స్థితికి చేరుకుంటుంది. ఆ స్థితి నుంచి ఆక్సిజన్‌కు శక్తిని బదిలీ చేసి సింగ్లెట్ ఆక్సిజన్‌ను ఉత్పత్తి చేయవచ్చు, లేదా ఎలక్ట్రాన్‌లను బదిలీ చేసి రాడికల్స్, హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్‌ను ఉత్పత్తి చేయవచ్చు. ఆ వ్యవస్థలో ఉంచిన ఏ ప్రోబ్ అయినా రంగు పదార్థం వల్లనే ఆక్సీకరణకు, క్షయీకరణకు, బ్లీచింగ్‌కు గురికావచ్చు లేదా దాని సంకేతం దృశ్యపరంగా మరుగుపడవచ్చు. కాబట్టి ఏ ROS కొలతలోనైనా మొదటి ప్రశ్న సంఖ్య ఎంత అన్నది కాదు. ఆ పరీక్ష నిజంగా దేనిని గుర్తిస్తుంది, రంగు పదార్థం ఆ పరీక్షపై ఎలాంటి ప్రభావం చూపుతుంది అన్నదే.

Amplex Red: కాలిబ్రేట్ చేసిన హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ పరీక్ష

సరిగ్గా ఏర్పాటు చేసినప్పుడు, ఈ పరిశోధనా సాహిత్యంలో మిథిలీన్ బ్లూ Amplex Red కలయికకు అత్యంత బలమైన ఆధారం ఉంది. దీని రసాయన ప్రక్రియ నిర్దిష్టమైనది: హార్స్‌రాడిష్ పెరాక్సిడేస్ హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్‌ను ఉపయోగించి Amplex సబ్‌స్ట్రేట్‌ను ఫ్లోరోసెంట్ ఉత్పత్తి అయిన రెసోరుఫిన్‌గా ఆక్సీకరిస్తుంది. ఇది సుమారు ఒకటికి ఒకటి స్టాయికియోమెట్రీలో జరుగుతుంది. నమూనాలోని పెరాక్సైడ్ డిటెక్టర్‌లో ఫ్లోరోసెన్స్‌గా మారుతుంది. సాధారణంగా ROS కుటుంబంలో చేర్చే మరే ఇతర జాతీ ఆ ప్రతిచర్యను నేరుగా నడిపించదు.

దీని నిర్ణయాత్మక ప్రయోజనం కాలిబ్రేషన్. జాగ్రత్తగా పనిచేసే పరిశోధకుడు అదే బఫర్‌లో, అదే పెరాక్సిడేస్, సబ్‌స్ట్రేట్ సాంద్రతలతో, అదే ఇంక్యుబేషన్ సమయం, అదే ఆప్టికల్ సెట్టింగ్‌లతో తెలిసిన పెరాక్సైడ్ ప్రమాణాలను పరీక్షిస్తాడు. ఆ వక్రరేఖతో నమూనాల కొలతలను పోలుస్తాడు. ఈ పద్ధతికి ఆధారమైన, వేరుచేసిన మెదడు మైటోకాండ్రియాపై అధ్యయనంలో రచయితలు సరిగ్గా ఇదే చేశారు. ప్రతి ప్రయోగం చివరలో తెలిసిన పరిమాణాల్లో పెరాక్సైడ్‌ను జోడించారు. ఫలితాలను యాదృచ్ఛిక ఫ్లోరోసెన్స్ యూనిట్లకు బదులుగా, ప్రతి మిల్లీగ్రామ్ ప్రోటీన్‌కు ప్రతి నిమిషానికి పికోమోల్‌ల రేట్లుగా నివేదించారు. వెలుగును కొలతగా మార్చేది ఇదే.

ఆ అధ్యయనంలోని మూడు వివరాలను అనుసరించాలి. మొదట, పెరాక్సైడ్‌ను విచ్ఛిన్నం చేసే కాటలేస్‌తో రచయితలు సంకేతాన్ని ధృవీకరించారు. కాటలేస్‌ను జోడించినప్పుడు మిథిలీన్ బ్లూ వల్ల ఫ్లోరోసెన్స్‌లో వచ్చిన పెరుగుదల ఆగిపోయింది. దీనితో ఆ సంకేతం పెరాక్సైడ్ వల్ల వచ్చిందని, ఆప్టికల్ ఆర్టిఫాక్ట్ కాదని నిర్ధారించారు. రెండవది, ఉత్తేజన కాంతి పుంజాన్ని షట్టర్‌తో నియంత్రించి, నమూనాలకు సాధారణ కాంతి మోతాదులో ఎనిమిదో వంతు మాత్రమే అందేలా చేసి, కాంతి ప్రభావాన్ని నేరుగా పరీక్షించారు. సంకేతం కేవలం తొమ్మిది శాతం తగ్గింది. వారు నివేదించిన పెరాక్సైడ్‌లో తొంభై శాతానికి పైగా కొలత కోసం ఉపయోగించిన కాంతిపై ఆధారపడలేదు. మూడవది, ఎలక్ట్రోడ్‌తో పెరాక్సైడ్ తొలగింపును విడిగా కొలిచి, రంగు పదార్థం ఉత్పత్తిని పెంచడంతోపాటు తొలగింపును నెమ్మదింపజేస్తుందని గుర్తించారు. నికర ఫ్లోరోసెన్స్‌ను మాత్రమే నివేదించే ప్రోబ్ ఈ రెండు ప్రభావాలను కలిపి చూపించేది.

ఈ పరీక్షలో ఇప్పటికీ విఫలమయ్యే పరిస్థితులు ఉన్నాయి. మిథిలీన్ బ్లూ వాటిలో అనేకాన్ని కలిగిస్తుంది. రెసోరుఫిన్ కాంతిని ఉద్గారించే ఎరుపు ప్రాంతంలోనే ఈ రంగు పదార్థం విస్తృతంగా కాంతిని శోషిస్తుంది. అందువల్ల అధిక రంగు పదార్థ సాంద్రతల్లో అంతర్గత ఫిల్టర్ ప్రభావాల ద్వారా నమూనా తన సంకేతాన్ని తానే మరుగుపరచవచ్చు. కాబట్టి ప్రమాణాల్లోనూ నమూనాల్లో ఉన్నంత రంగు పదార్థ సాంద్రత ఉండాలి. Amplex Red స్వయంగా కూడా కాంతి ఆక్సీకరణకు గురికావచ్చు. దాని ఉత్పత్తి రెసోరుఫిన్ సూపర్‌ఆక్సైడ్, పెరాక్సైడ్‌ను ఉత్పత్తి చేసే ఫోటోరెడాక్స్ చక్రీయ ప్రక్రియలో పాల్గొనవచ్చు. ప్రయోగంలో కాంతి సున్నితీకరణ కారకాన్ని కూడా ప్రకాశింపజేస్తున్నప్పుడు ఇది చాలా ముఖ్యమైనది. ఆచరణలో పరిష్కారం ఏమిటంటే, ముందుగా మిథిలీన్ బ్లూ నమూనాలను కాంతికి గురిచేసి, తర్వాత వాటి నుంచి తీసిన భాగాలను చీకటిలో Amplex కారకాలతో పరీక్షించడం. రంగు పదార్థాన్ని, ప్రోబ్‌ను కలిపి ప్రకాశింపజేయకూడదు. చివరగా, సూపర్‌ఆక్సైడ్ డిస్మ్యూటేస్ Amplex సంకేతాన్ని కేవలం తగ్గించదు: సూపర్‌ఆక్సైడ్‌ను పెరాక్సైడ్‌గా మార్చడం వల్ల సంకేతం పెరగవచ్చు. ఫ్లోరోసెన్స్‌ను పెంచే SOD నియంత్రణ విఫలమైనట్లు కాదు. అది ప్రతిచర్యలో ముందరి దశలో సూపర్‌ఆక్సైడ్ ఉందని గుర్తించింది.

DCFDA: నిర్దిష్టత లేని ఆక్సీకరణ సూచిక

మిథిలీన్ బ్లూ DCFDA కలయికే చాలా గందరగోళానికి మూలం. DCFH-DA అనేది కణాల్లోకి ప్రవేశపెట్టే పూర్వగామి పదార్థం. కణం లోపల ఉన్న ఎస్టరేస్‌లు దాని అసిటేట్ సమూహాలను తొలగించి, ఫ్లోరోసెన్స్ లేని DCFHను మిగులుస్తాయి. DCFH ఆక్సీకరణ వల్ల ఫ్లోరోసెంట్ DCF ఏర్పడుతుంది. దానిని ఆక్సీకరించే పదార్థాల జాబితా పెద్దది: హైడ్రాక్సిల్ రాడికల్స్, పెరాక్సిడేస్, హీమ్ మధ్యవర్తులు, నైట్రోజన్ డైఆక్సైడ్, హైపోక్లోరస్ ఆమ్లం, పెరాక్సినైట్రైట్ నుంచి ఉత్పన్నమైన రాడికల్స్. హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ ఒక్కటే దానిని ఉపయోగకరమైన రేటుతో నేరుగా ఆక్సీకరించదు; పెరాక్సైడ్‌పై ఆధారపడే ఫ్లోరోసెన్స్‌కు సాధారణంగా ఆ ప్రక్రియలో ఇనుము, హీమ్ ప్రోటీన్లు లేదా పెరాక్సిడేస్ రసాయన ప్రక్రియ అవసరం.

ప్రతి పద్ధతుల విభాగం ఉదహరించాల్సిన విమర్శ, కళ్యాణరామన్ మరియు సహచరులు DCFHను ప్రోబ్‌గా విశ్లేషించిన అధ్యయనం నుంచి వచ్చింది. ఈ కారణంతో DCFDAను తిరస్కరించిన మెదడు మైటోకాండ్రియా అధ్యయనంలో ఆ విశ్లేషణను సంగ్రహించారు. ప్రోబ్ రంగు పదార్థం నెమ్మదిగా ప్రతిచర్య జరుపుతుందని, దాని స్టాయికియోమెట్రీ నిర్ధారించలేదని, చెల్లుబాటు అయ్యే కాలిబ్రేషన్ లేదని, ROS కాని సమ్మేళనాలతోనూ ప్రతిచర్య జరుపుతుందని వారు చూపించారు. ప్రోబ్ తాను కొలిచే ప్రక్రియను కూడా పెంచుతుంది: DCFH ఒక ఎలక్ట్రాన్ ఆక్సీకరణకు గురైనప్పుడు DCF రాడికల్ ఏర్పడుతుంది. అది ఆక్సిజన్‌తో ప్రతిచర్య జరిపి సూపర్‌ఆక్సైడ్‌ను ఉత్పత్తి చేస్తుంది. ఆ సూపర్‌ఆక్సైడ్ డిస్మ్యూటేషన్ ద్వారా అదనపు పెరాక్సైడ్‌గా మారుతుంది. కొలత తాను నివేదించే రసాయన ప్రక్రియలో కొంత భాగాన్ని తానే సృష్టిస్తుంది.

ఇవేవీ DCFDAను పనికిరానిదిగా చేయవు. అవి దానిని ప్రాథమిక పరిశీలన పరీక్షగా పరిమితం చేస్తాయి, నిర్దిష్ట పదార్థాన్ని గుర్తించే పరీక్షగా కాదు. DCF ఫ్లోరోసెన్స్ పెరుగుదల అంటే ఆక్సీకరణ కారకాలపై ఆధారపడిన ప్రోబ్ ఆక్సీకరణ పెరిగిందని అర్థం. పెరాక్సైడ్ పెరిగిందని దాని అర్థం కాదు. మొత్తం ROS పెరిగిందని అసలు అర్థం కాదు; ఏ ఒక్క ప్రోబ్ కూడా ఆ పరిమాణాన్ని కొలవదు. ఒక మైక్రోమోలార్‌కు మించిన సాంద్రతల్లో DCF ఆక్సీకరణపై ఆధారపడిన మునుపటి మిథిలీన్ బ్లూ పరిశోధనలు ఆక్సీకరణను పెంచే ప్రభావాలను నివేదించాయి. అదే కాలంలోని ఇతర వ్యవస్థలు పెరాక్సైడ్ వల్ల కలిగే కణ మరణం నుంచి రక్షణను నివేదించాయి. వేర్వేరు రెడాక్స్ సందర్భాల్లో ఒకే రంగు పదార్థానికి ఈ రెండు పరిశీలనలూ నిజం కావచ్చు. DCF ఫలితం ఒక్కటే ఆ సంకేతానికి ఏ ఆక్సీకరణ కారకం కారణమో చెప్పలేదు. మునుపటి మెదడు మైటోకాండ్రియా పరిశోధనకు ప్రాముఖ్యత ఏమిటంటే, అది ఈ ప్రాథమిక పరిశీలనకు బదులుగా కాలిబ్రేట్ చేసిన పెరాక్సైడ్ కొలతను ఉపయోగించి, పెరాక్సైడ్ భారాన్ని నేరుగా గుర్తించింది: కేవలం వంద నానోమోలార్ రంగు పదార్థం కూడా పరీక్షించిన ప్రతి సబ్‌స్ట్రేట్, ప్రతి శ్వాసక్రియా స్థితిలో పెరాక్సైడ్ విడుదలను అనేక రెట్లు పెంచింది.

DCFDAలో మిథిలీన్ బ్లూకు ప్రత్యేకమైన మరో చిక్కు ఉంది. ఈ రంగు పదార్థానికి గాఢమైన వర్ణం ఉంది, రెడాక్స్ క్రియాశీలత కూడా ఉంది. అందువల్ల అది ఫ్లోరోసెన్స్‌ను బ్లీచ్ చేయవచ్చు, కాంతి ఉద్గారాన్ని తగ్గించవచ్చు లేదా కణాల్లోని ROSతో సంబంధం లేకుండానే ప్రోబ్ రసాయన ప్రక్రియను ఆక్సీకరించవచ్చు. రంగు పదార్థం, ప్రోబ్ మాత్రమే ఉండి కణాలు లేని నియంత్రణ ఐచ్ఛికంగా జోడించే అలంకారం కాదు. రంగు పదార్థం ప్రోబ్‌తో పరస్పర చర్య జరుపుతుందో లేదో తెలిపే ప్రయోగం అదే.

స్పిన్ ట్రాపింగ్, ఆక్సిజన్ వినియోగం: గుర్తింపు, ప్రవాహ రేటు

ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్‌లు ఆక్సీకరణకు గురయ్యే ఏదో పదార్థం కనిపించిందని నివేదిస్తాయి. స్పిన్ ట్రాప్‌లతో ఎలక్ట్రాన్ స్పిన్ రెసొనెన్స్ మాత్రం అది ఏ పదార్థమో మరింత దగ్గరగా తెలియజేస్తుంది. మిథిలీన్ బ్లూ కాంతి రసాయనశాస్త్రంపై ప్రసిద్ధ అధ్యయనం రంగు పదార్థం, ఆస్కార్బేట్, కాంతి నుంచి ఏర్పడిన ఆస్కార్బేట్ రాడికల్‌ను గుర్తించడానికి ESRను ఉపయోగించింది. తర్వాత ఆక్సిజన్ వినియోగ ప్రయోగాల్లో పెరాక్సైడ్ ఏర్పడటాన్ని, స్పిన్ ట్రాపింగ్ ప్రయోగాల్లో ఇనుము ఉత్ప్రేరణతో హైడ్రాక్సిల్ రాడికల్ ఏర్పడటాన్ని చూపించింది. ఇతర పద్ధతులు సమాధానం ఇవ్వలేని ప్రశ్నకు ప్రతి పద్ధతి సమాధానం ఇచ్చింది: ESR రాడికల్ గుర్తింపును ఇచ్చింది, ఆక్సిజన్ వినియోగం ఏ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్‌పైనా ఆధారపడకుండా ప్రతిచర్య ప్రవాహ రేటును ఇచ్చింది. ఈ రెండింటి కలయిక ఒకే ప్రకాశిత వ్యవస్థలో సింగ్లెట్ ఆక్సిజన్ మార్గాలు, రాడికల్ మార్గాలు రెండూ పనిచేస్తున్నాయని చూపించింది.

ఆ 1984 ఫలితం ఇప్పటికీ హెచ్చరికగా చదవదగినది. కాంతి, క్షయీకరణ కారకం ఉన్నప్పుడు రంగు పదార్థం పెరాక్సైడ్‌ను ఉత్పత్తి చేసింది. ఇనుము ఉన్నప్పుడు ఆ వ్యవస్థ ఈ జాతుల సమూహంలో అత్యంత క్రియాశీలమైన హైడ్రాక్సిల్ రాడికల్‌ను ఉత్పత్తి చేసింది. రచయితలు దీనిని కంటిలోని ఆస్కార్బేట్‌తో అనుసంధానించి, నేత్ర సంబంధిత ఉపయోగాల్లో విచక్షణ లేకుండా వాడటాన్ని ప్రశ్నించారు. నేటి పాఠకులు ఆ పరిస్థితులను గమనించాలి: కాంతి, క్షయీకరణ కారకం, ఇనుము కలిసి ఉండటం. వీటిలో ఏ ఒక్కటి తొలగించినా ఆ మార్గం బలహీనపడుతుంది లేదా పూర్తిగా కనుమరుగవుతుంది.

ఆక్సిజన్ ఎలక్ట్రోడ్‌ల ఉపయోగం వేరే విధంగా ఉంటుంది. క్లార్క్ రకం ఎలక్ట్రోడ్ నికర ఆక్సిజన్ వినియోగాన్ని కొలుస్తుంది. దీనితో రంగు పదార్థం నడిపించే రెడాక్స్ రసాయన ప్రక్రియ అణు ఆక్సిజన్‌ను వినియోగిస్తోందని నిర్ధారించవచ్చు. ఏ ఫ్లోరోసెన్స్ ఆర్టిఫాక్ట్ కూడా తప్పుడు రూపంలో చూపించలేని ప్రతిచర్య గతిశాస్త్ర వివరాలను ఇది అందిస్తుంది. అయితే ఉత్పత్తిని గుర్తించదు. పెరాక్సైడ్, సూపర్‌ఆక్సైడ్, నీరు ఏర్పడటం, సింగ్లెట్ ఆక్సిజన్ క్షయం అన్నీ ఆక్సిజన్‌ను వినియోగిస్తాయి. గుర్తింపు లేని ప్రవాహ రేటు ఎంత అసంపూర్ణమో, ప్రవాహ రేటు లేని గుర్తింపు కూడా అంతే అసంపూర్ణం. అందుకే బలమైన పరిశోధనా పత్రాలు ఎలక్ట్రోడ్‌ను కాలిబ్రేట్ చేసిన పెరాక్సైడ్ పరీక్షతో లేదా ట్రాప్‌తో కలిపి ఉపయోగిస్తాయి.

యాంటీఆక్సిడెంట్ ఫలితాలు ఎందుకు విరుద్ధంగా ఉంటాయి

ఈ మూడు కొలతలను పక్కపక్కన ఉంచితే, మిథిలీన్ బ్లూ పరిశోధనా సాహిత్యంలో కనిపించే విరుద్ధతలను పద్ధతుల్లో తేడాలు, మూడు జీవసంబంధ వాస్తవాలతో వివరించవచ్చు.

మొదట, రంగు పదార్థం ఎలక్ట్రాన్ బదిలీ కారకంగానూ, పెరాక్సైడ్ మూలంగానూ పనిచేస్తుంది. ఆక్సిజన్ సూపర్‌ఆక్సైడ్‌గా మారే శ్వాసక్రియా స్థానాల నుంచి ఎలక్ట్రాన్‌లను మళ్లించడం ద్వారా అది ఒక ROSను తగ్గించవచ్చు. అదే సమయంలో దాని క్షయీకృత రూపం ఆక్సిజన్‌ను నేరుగా పెరాక్సైడ్‌గా క్షయీకరించి మరో ROSను పెంచవచ్చు. అందువల్ల మైటోకాండ్రియా రెడాక్స్ రసాయనశాస్త్రం, దానిలో మిథిలీన్ బ్లూ ప్రత్యామ్నాయ మార్గ పాత్రను పరిశీలించే ప్రయోగశాల ప్రోబ్‌పై ఆధారపడే సమాధానాలను ఆశించాలి: ఒకే క్యూవెట్‌లో సూపర్‌ఆక్సైడ్‌కు స్పందించే కొలత తగ్గుతుండగా, పెరాక్సైడ్ కొలత పెరుగుతుంది.

రెండవది, తక్కువ మోతాదుల్లో పెరాక్సైడ్ కేవలం నష్టాన్ని కలిగించే పదార్థం కాదు, ఒక సంకేతం కూడా. మునుపటి పరిశోధనను అనుసరించిన ఎలుక మెదడు మైటోకాండ్రియా అధ్యయనం యాభై నానోమోలార్ అంత తక్కువ రంగు పదార్థంతోనే పెరాక్సైడ్ ఉత్పత్తి అవుతుందని, చికిత్సలో ఉపయోగించే స్థాయిల్లో మైటోకాండ్రియా DNA దెబ్బతినలేదని గుర్తించింది. ముందస్తు చికిత్స తర్వాత రోటెనోన్ వల్ల కలిగే DNA నష్టం నుంచి రక్షణ కనిపించింది. చికిత్సా పరిధికి చాలా ఎక్కువగా ఉన్న వంద మైక్రోమోలార్ వద్ద మాత్రమే రంగు పదార్థం కొన్ని ఎంపిక చేసిన DNA ఖండాలను దెబ్బతీసింది. ఎరుపు కాంతితో కలిపిన ఇరవై మైక్రోమోలార్ రంగు పదార్థం సింగ్లెట్ ఆక్సిజన్‌ను ఉత్పత్తి చేసి, పరీక్షించిన అన్ని ఖండాలనూ దెబ్బతీసింది. ప్రతిపాదించిన యంత్రాంగం హార్మెసిస్‌పై ఆధారపడింది: స్వల్ప పెరాక్సైడ్ ఉత్పత్తి Nrf2తో అనుసంధానమైన యాంటీఆక్సిడెంట్ రక్షణలను, మైటోకాండ్రియా జీవోత్పత్తిని ప్రేరేపిస్తుంది. అందువల్ల స్వల్పకాలంలో ఆక్సీకరణ పెరిగినట్లు చూపే కొలత తర్వాత, దీర్ఘకాలంలో యాంటీఆక్సిడెంట్ ఫలితం రావచ్చు. ఒక గంటకు చదివిన పరీక్ష, ఒక రోజుకు చదివిన పరీక్ష వేర్వేరు ఫలితాలను ఇవ్వవచ్చు. ఎందుకంటే వాటి మధ్య జీవప్రక్రియ మారింది.

మూడవది, ఏ అణువు ఉందనేదాన్నే కాంతి నిర్ణయిస్తుంది. కాంతికి గురికావడం వల్ల రంగు పదార్థం డీమిథైలేషన్ చెంది Azure B, సంబంధిత ఉత్పత్తుల వైపు మారుతుంది. డిష్‌పై ఉన్న సూక్ష్మదర్శిని దీపం కూడా దానిని కాంతి సున్నితీకరణ స్థితికి తీసుకెళ్లడానికి సరిపోతుంది. చీకటిలో చేసే ప్రయోగాలు, కాంతిలో చేసే ప్రయోగాలు వేర్వేరు ప్రయోగాలు. ఏ ప్రయోగ విధానంలోనైనా కాంతి, రంగు పదార్థ నిర్వహణ నియంత్రణల విభాగం వాటిని అలాగే పరిగణించాలి.

కనీస నియంత్రణల సమితి, ఏ వాదననైనా ఎలా అర్థం చేసుకోవాలి

కింద ఇచ్చిన పోలిక ఈ వ్యాసం కోసం రూపొందించిన అసలు సూచన వనరు. ఏ మిథిలీన్ బ్లూ ROS ఫలితాన్నైనా అంగీకరించే ముందు, రచయితలు ఏ వరుసను పూర్తి చేశారో, ఏది వదిలేశారో పరిశీలించండి.

దీనినుంచి ఒక ఆచరణాత్మక పఠన నియమం వస్తుంది. పెరాక్సిడేస్‌తో నిర్వహించి, కాలిబ్రేట్ చేసి, కాటలేస్‌తో తనిఖీ చేసిన Amplex పరీక్ష పెరాక్సైడ్ గురించి ఆధారం ఇస్తుంది. DCFDA నిర్దిష్టత లేని ప్రోబ్ ఆక్సీకరణ గురించి మాత్రమే ఆధారం ఇస్తుంది. స్కావెంజర్ నియంత్రణలతో చేసిన స్పిన్ ట్రాపింగ్ రాడికల్ గుర్తింపు గురించి ఆధారం ఇస్తుంది. ఆక్సిజన్ వినియోగం ప్రవాహ రేటు గురించి ఆధారం ఇస్తుంది. ఒక వాక్యం తన పరీక్ష సమర్థించగలిగిన దానికంటే ఎక్కువగా వాదిస్తే, ఎంత నమ్మకంగా రాసినా, అది ప్రోబ్ గురించి చెప్పే వాక్యమే, రంగు పదార్థం గురించి కాదు. మోతాదుపై ఆధారపడటం, హార్మెసిస్ పరిధి, మైటోకాండ్రియా ఎలక్ట్రాన్ ప్రవాహం, రంగు వేసిన నమూనాల్లో పరీక్షకు కలిగే అంతరాయం, సూక్ష్మదర్శిని కాంతి వల్ల కలిగే ఆర్టిఫాక్ట్‌లపై సంబంధిత చర్చలు ఈ అంశాల్లో ప్రతిదానినీ మరింత విస్తరిస్తాయి. ప్రతి అంశానికి తాత్కాలికంగా ఉంచిన సూచనను అసలు సూచనతో మార్చిన తర్వాత కూడా అది చెల్లుబాటవుతుంది.