మిథిలీన్ బ్లూ మైటోకాండ్రియా ప్రభావాలను కొలవడం: ఆక్సిజన్, ATP, పొర విద్యుత్ విభవం

ఒక ప్రయోగశాల శ్వాసక్రియ బలహీనపడిన మైటోకాండ్రియాకు మిథిలీన్ బ్లూను జోడించి, ఆక్సిజన్ వినియోగం పెరగడాన్ని గమనించిందనుకుందాం. ఆ రంగు పదార్థం మైటోకాండ్రియా పనితీరును పునరుద్ధరించిందని రాయడం సహజం. కానీ ఆ వాక్యం తప్పు కావచ్చు. ఆక్సిజన్ ప్రవాహం, ATP సంశ్లేషణ, పొర విద్యుత్ విభవం మూడు వేర్వేరు భావనలు. బ్యాకప్, సింక్, షేరింగ్ ఒకే క్లౌడ్ ఫోల్డర్‌ను ఉపయోగించినట్లే, ఇవి ఒకే కణాంగంలో జరుగుతాయి: పరస్పర సంబంధం ఉన్నా, వేర్వేరు నియమాలకు లోబడి ఉంటాయి. ఒకదాన్ని మరొకటిగా భావిస్తే, ప్రతి కొలత సాంకేతికంగా సరైనదైనా దాని వ్యాఖ్యానం తప్పుతుంది.

మిథిలీన్ బ్లూ తాను కొలిచే వ్యవస్థలోనే పాల్గొంటుంది కాబట్టి ఈ గందరగోళానికి అవకాశం ఎక్కువ. ఇది ఎలక్ట్రాన్ రవాణా మార్గంలో ముందరి దశల్లో ఎలక్ట్రాన్‌లను స్వీకరించి, తరువాతి దశల్లో వాటిని అందించే రెడాక్స్ చక్రీయ పదార్థం; శక్తిస్థితిలో ఉన్న మైటోకాండ్రియాలో పేరుకుపోయే లిపోఫిలిక్ ధన అయాన్; సాధారణ ప్రోబ్‌లు ఉపయోగించే కాంతి బ్యాండ్‌లలోనే కాంతిని శోషించి, ఉద్గారించే గాఢ నీలి సమ్మేళనం. ఒక్క కొలతతో ఈ సంక్లిష్టత అంతటినీ వివరించలేం. బుడాపెస్ట్ మైటోకాండ్రియా అధ్యయనాల్లో కనిపించిన విశ్వసనీయ పద్ధతి ఏమిటంటే, ప్రతి దశలో రంగు పదార్థానికి ప్రత్యేకమైన నియంత్రణలతో ఆక్సిజన్ ప్రవాహం, ATP సంశ్లేషణ రేటు, పొర విద్యుత్ విభవం, హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ విడుదలను కలిపి కొలవడం.

రెస్పిరోమెట్రీ ఆక్సిజన్ ప్రవాహాన్ని కొలుస్తుంది, శక్తి ఉత్పత్తిని కాదు

Oroboros Oxygraph ద్వారా చేసినా, Seahorse బాహ్యకణ ప్రవాహ విశ్లేషకం ద్వారా చేసినా, అధిక-రిజల్యూషన్ రెస్పిరోమెట్రీ ఒకే విషయాన్ని తెలియజేస్తుంది: ఆక్సిజన్ ఎంత వేగంగా క్షయీకరణ చెందుతోంది. ప్రతి ఎలక్ట్రాన్‌కు ఎన్ని ప్రోటాన్‌లు పంప్ అయ్యాయి, ఎంత ప్రవణత నిలిచి ఉంది, ATP సింథేస్ దానిని ఉపయోగించిందా అనే విషయాలను అది తెలియజేయదు.

పదజాలం ముఖ్యం. వేరుచేసిన మైటోకాండ్రియాలో ADP లేకుండా సబ్‌స్ట్రేట్‌ను అందిస్తే లీక్ శ్వాసక్రియ, సంతృప్తి స్థాయి ADPతో సబ్‌స్ట్రేట్‌ను అందిస్తే ఆక్సిడేటివ్ ఫాస్ఫోరిలేషన్ సామర్థ్యం, అన్‌కప్లర్ టైట్రేషన్ చేస్తే గరిష్ఠ ఎలక్ట్రాన్ బదిలీ సామర్థ్యం తెలుస్తాయి. చెక్కుచెదరని కణాల్లో వాటికి సమానమైన Seahorse కొలతలు ప్రాథమిక శ్వాసక్రియ, ఒలిగోమైసిన్‌కు సున్నితమైన ATP-అనుబంధ శ్వాసక్రియ, ప్రోటాన్ లీక్, FCCPతో నిర్ధారించిన గరిష్ఠ శ్వాసక్రియ, రోటెనోన్‌తో పాటు యాంటిమైసిన్‌కు నిరోధకమైన మైటోకాండ్రియేతర ఆక్సిజన్ వినియోగం. Seahorse ఫలితాలను State 3, State 4 అని పిలవడం, ఆ నమూనా సన్నాహం సమర్థించని స్థాయి ఖచ్చితత్వాన్ని ఆపాదించడమేనని Agilent Mito Stress Test విధాన చట్రం స్పష్టం చేస్తుంది.

ఎక్కువ ఆక్సిజన్ అంటే ఎక్కువ శక్తి అనే సహజ అంచనాను మిథిలీన్ బ్లూ భంగపరుస్తుంది. వేరుచేసిన మెదడు మైటోకాండ్రియా అధ్యయనం ప్రకారం, గినియా పంది మెదడు నుంచి వేరుచేసిన మైటోకాండ్రియాలో 100 nM నుంచి 1 uM రంగు పదార్థం, గ్లూటమేట్‌తో పాటు మాలేట్, సక్సినేట్, ఆల్ఫా-గ్లిసెరోఫాస్ఫేట్ సబ్‌స్ట్రేట్‌లతో విశ్రాంతి స్థితి ఆక్సిజన్ వినియోగాన్ని పెంచింది. ఆల్ఫా-గ్లిసెరోఫాస్ఫేట్‌తో ఈ పెరుగుదల సుమారు 64 శాతం ఉన్నా, ఆరోగ్యకరమైన మైటోకాండ్రియాలో ADP-ప్రేరిత శ్వాసక్రియ దాదాపుగా మారలేదు. లీక్ పెరిగి, ADP-ప్రేరిత ప్రవాహం మారకుండా ఉండటం వల్ల లెక్కించిన శ్వాసక్రియ నియంత్రణ నిష్పత్తి తగ్గుతుంది. ఆ తగ్గుదల రంగు పదార్థం మైటోకాండ్రియాను దెబ్బతీసిందని అర్థం కాదు. సాధారణ శ్వాసక్రియకు అదనంగా ఆక్సిజన్‌ను వినియోగించే రెడాక్స్ చక్రాన్ని రంగు పదార్థం జోడించిందని అర్థం. పెరుగుదలను మాత్రమే నివేదించే మిథిలీన్ బ్లూ ఆక్సిజన్ వినియోగ పరీక్ష నిజమైన రసాయనిక చర్యను కొలిచినా, శక్తి సంరక్షణ గురించి ఏమీ చెప్పదు.

పునరుద్ధరణ ప్రయోగాలు ఇదే వ్యత్యాసాన్ని మరింత పెద్ద స్థాయిలో చూపుతాయి. కాంప్లెక్స్ Iను నిరోధించినప్పుడు, ఆక్సిజన్ ప్రవాహం సుమారు మూడు రెట్లు పునరుద్ధరించబడగా, ATP సంశ్లేషణ సుమారు 1.5 రెట్లు మాత్రమే పునరుద్ధరించబడింది. ఎక్కువ ఆక్సిజన్ ఎలక్ట్రోడ్‌ను చేరింది. అందులో తక్కువ భాగమే ATP ఉత్పత్తికి తోడ్పడింది. ఆక్సిడేటివ్ ఫాస్ఫోరిలేషన్ మెరుగుపడిందనే ఏ వాదనకైనా ATP వైపు లెక్కలు అవసరం; ఆదర్శంగా, హారాన్ని ఏ పద్ధతిలో నిర్వచించారో పేర్కొంటూ, ఆక్సిజన్‌కు ATP నిష్పత్తిగా వాటిని వ్యక్తీకరించాలి.

ATP పరీక్షలు సంశ్లేషణ రేటును కొలుస్తాయి; మొత్తం పరిమాణం దానికి ప్రత్యామ్నాయం కాదు

ATP పరీక్ష వేరొక ప్రశ్నకు సమాధానమిస్తుంది: ప్రతి కాల ప్రమాణానికి ఎంత ATP ఉత్పత్తి అవుతోంది. కొన్ని నిమిషాల పాటు మిణుగురు పురుగు లూసిఫరేస్ కాంతి ఉద్గారాన్ని అనుసరించినా, 340 nm వద్ద చదివే హెక్సోకైనేస్‌తో పాటు గ్లూకోజ్-6-ఫాస్ఫేట్ డీహైడ్రోజినేస్ సంయుక్త పరీక్షను ఉపయోగించినా, కాలక్రమ కొలత ఒక రేటును ఇస్తుంది. ఒకే ముగింపు సమయంలో మొత్తం ATPని కొలిస్తే దాని పరిమాణం తెలుస్తుంది. అది సంశ్లేషణ నుంచి వినియోగాన్ని తీసివేసిన ఫలితాన్ని ప్రతిబింబిస్తుంది; దానికదే ఆక్సిడేటివ్ ఫాస్ఫోరిలేషన్ గురించి చాలా తక్కువ సమాచారం ఇస్తుంది.

బుడాపెస్ట్ బృందం అడెనిలేట్ కైనేస్‌ను అణచివేసి, సంయుక్త ఎంజైమ్ పద్ధతిని ఉపయోగించింది. రోటెనోన్‌తో, యాంటిమైసిన్‌తో చికిత్స చేసిన మైటోకాండ్రియాలో 1 నుంచి 2 uM మిథిలీన్ బ్లూ ATP ఉత్పత్తిని స్వల్పంగా, కానీ గణాంకపరంగా గణనీయంగా పెంచిందని కనుగొంది. అది నిజమైన పునరుద్ధరణే, కానీ పాక్షికమైనది. TEGDMA విషపూరితత అధ్యయనం వేరొక నమూనాలో ఇదే తరహా ఫలితాన్ని ఇచ్చింది: 5 mM దంత మోనోమర్ TEGDMA, కాంప్లెక్స్ Iతో అనుబంధమైన శ్వాసక్రియను సుమారు 286 నుంచి 28 ప్రవాహ యూనిట్లకు పడగొట్టింది; 2 uM రంగు పదార్థం దానిని సుమారు 86కు పునరుద్ధరించింది.

రంగు కలిగిన రెడాక్స్ సమ్మేళనంతో రెండు నియంత్రణలు తప్పనిసరి. మొదట, కొలిచిన ATP సంశ్లేషణలో ఎంత భాగం ATP సింథేస్‌పై ఆధారపడుతుందో నిర్ధారించడానికి ఒలిగోమైసిన్‌తో పరీక్షించాలి. రెండవది, తెలిసిన పరిమాణంలో ATP, పూర్తి రియాజెంట్ మిశ్రమం, ప్రయోగంలో ఉపయోగించిన ఖచ్చితమైన రంగు పదార్థ సాంద్రతలను కలిపి, కణరహిత స్పైక్ రికవరీ పరీక్ష చేయాలి; కనీసం 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, 2 uM వద్ద చేయాలి. రంగు పదార్థం ఉద్గారించిన కాంతిని శోషించవచ్చు, సంకేతాన్ని ఇచ్చే ఎంజైమ్‌ను నిరోధించవచ్చు, లేదా రియాజెంట్ రెడాక్స్ రసాయనిక చర్యలను మార్చవచ్చు. సాధారణ లూసిఫరేస్ పరీక్ష మార్గదర్శకాలు ఇటువంటి అంతరాయాలను గుర్తించడానికే జీవరసాయనిక ప్రతిపరీక్షలను సిఫార్సు చేస్తాయి. అధిక సాంద్రతల వద్ద కాంతి ఉద్గార అణచివేత సాధారణంగా ఎక్కువగా ఉంటుందని, 1 uM వద్ద కొలతలో కృత్రిమ ప్రభావాలు ఉండవని భావించవద్దు.

పొర విద్యుత్ విభవ ప్రోబ్‌లు రంగు పదార్థ పంపిణీని కొలుస్తాయి, ప్రవాహాన్ని కాదు

సాఫ్రనిన్ O, TMRM, TMRE, రోడమైన్ 123, JC-1 అన్నీ పొరను దాటగల ధన అయాన్‌లు. విద్యుత్‌రసాయన సమతుల్యత ప్రకారం అవి రుణ ఆవేశం కలిగిన మ్యాట్రిక్స్‌లో పేరుకుపోతాయి. కాబట్టి ప్రోబ్ ఎక్కడ ఉందనే దాని ద్వారా మొత్తం ఫ్లోరెసెన్స్ విద్యుత్ విభవాన్ని పరోక్షంగా సూచిస్తుంది. వాటిలో ఏదీ ATPని లేదా ఎలక్ట్రాన్ ప్రవాహాన్ని కొలవదు.

ప్రతి ప్రోబ్‌కు అనుకూలమైన నమూనా సన్నాహం ఉంటుంది. సాఫ్రనిన్ O వేరుచేసిన మైటోకాండ్రియాకు, పారగమ్యత కల్పించిన కణాలకు సరిపోతుంది. సాధారణంగా సుమారు 2 uM వద్ద, ఉత్తేజన సుమారు 495 nm వద్ద, ఉద్గారం సుమారు 585 nm వద్ద ఉపయోగిస్తారు. ఇది కాంతి ఉద్గార అణచివేత విధానంలో పనిచేస్తుంది; ప్రోబ్ లోపలికి చేరడం వల్ల మొత్తం ఫ్లోరెసెన్స్ మారుతుంది. TMRM, TMRE చెక్కుచెదరని కణాలకు, తక్కువ నానోమోలార్ లోడింగ్‌తో, కాంతి ఉద్గార అణచివేత లేని విధానంలో సరిపోతాయి. ఇందులో డిపోలరైజేషన్ వల్ల రంగు పదార్థం బయటకు వచ్చి, మైటోకాండ్రియా ఫ్లోరెసెన్స్ తగ్గుతుంది; అధిక లోడింగ్‌లో స్వీయ కాంతి ఉద్గార అణచివేత వల్ల సంకేత దిశ తారుమారవచ్చు. JC-1 సౌకర్యవంతమైన ఆకుపచ్చ-ఎరుపు నిష్పత్తిని ఇస్తుంది. కానీ అది లోడింగ్‌పై, మైటోకాండ్రియా ద్రవ్యరాశిపై ఆధారపడుతుంది కాబట్టి, జాగ్రత్తగా నియంత్రించిన TMRMతో పోలిస్తే పరిమాణాత్మక అధ్యయనాలకు తక్కువ అనుకూలం. విస్తృతంగా ఉపయోగించే మైటోకాండ్రియా పొర విద్యుత్ విభవ ప్రోబ్‌ల సమీక్ష ఈ ప్రయోజనాలు, పరిమితులను సంగ్రహిస్తుంది.

మిథిలీన్ బ్లూ పరీక్షలో ఉపయోగించే సాంద్రతల వద్దనే కాంతిపరమైన అంతరాయం కలిగిస్తుంది. సుమారు 600 నుంచి 665 nm వద్ద ఉన్న దాని శోషణ బ్యాండ్‌లు ఎరుపు ప్రోబ్ ఉద్గారంతో అతివ్యాప్తి చెందుతాయి. అందువల్ల అంతర్గత వడపోత ప్రభావాలు, కాంతి ఉద్గార అణచివేత, ఉత్తేజన కాంతి శోషణ అన్నీ సంభవించే అవకాశముంది. ఈ రంగు పదార్థం రెండవ లిపోఫిలిక్ ధన అయాన్ కూడా; కొలుస్తున్న విద్యుత్ విభవంతో దాని సొంత పంపిణీ మారుతుంది. దీనికి రక్షణగా పరస్పర ధృవీకరణ కొలతలు, బ్లాంక్‌లు అవసరం: ప్రోబ్ మాత్రమే, రంగు పదార్థం మాత్రమే, ప్రతి రంగు పదార్థ సాంద్రతతో ప్రోబ్, శూన్య సూచనగా FCCPతో పూర్తి డిపోలరైజేషన్, ఆదర్శంగా కాంతిపరంగా భిన్నమైన రెండవ ప్రోబ్. కాంప్లెక్స్ III బైపాస్ అధ్యయనం ఈ విధానానికి ఉదాహరణగా నిలిచింది. యాంటిమైసిన్, మిక్సోథయజోల్ నిరోధం తరువాత సాఫ్రనిన్ O, TMRM రెండింటితో పొర విద్యుత్ విభవ పునరుద్ధరణను మళ్లీ పరీక్షించి, ఒకే గుణాత్మక పునరుద్ధరణను పొందింది. ఒక్క కాంతి ఆధారిత రిపోర్టర్ ఒక సూచన. రెండు స్వతంత్ర రిపోర్టర్లు ఆధారం.

మూడు నమూనా సన్నాహాలు, మూడు వేర్వేరు ప్రశ్నలు

వేరుచేసిన మైటోకాండ్రియా, పారగమ్యత కల్పించిన కణాలు, చెక్కుచెదరని కణాలు ఒకే పరీక్షలో పరస్పరం మార్చుకోగల సున్నితత్వ సెట్టింగ్‌లు కావు. అవి వేర్వేరు కార్యనిర్వహణ సూత్రాలతో కూడిన వేర్వేరు భావనలు.

వేరుచేసిన మైటోకాండ్రియా ఎలక్ట్రాన్ రవాణా గొలుసు, అంతర్గత పొర, మ్యాట్రిక్స్ యంత్రాంగాన్ని నిలుపుకుంటూ, ప్లాస్మా పొర, సైటోసాల్, నెట్‌వర్క్ నిర్మాణాన్ని తొలగిస్తాయి. ఆ తొలగింపే దీని ఉద్దేశం: సబ్‌స్ట్రేట్‌లు, ADP, నిరోధకాలు, రంగు పదార్థ సాంద్రతలను ఖచ్చితంగా నిర్వచించవచ్చు కాబట్టి, ఒక మార్గాన్ని నిర్ధారించవచ్చు. అయితే సహజ సబ్‌స్ట్రేట్ సరఫరా, సంకేత ప్రక్రియలు, అవసరాలు కోల్పోతాయి.

పారగమ్యత కల్పించిన కణాలు తమ కణ నిర్మాణంలో ఎక్కువ భాగంలో మైటోకాండ్రియాను అలాగే ఉంచుతాయి. తెరచిన ప్లాస్మా పొర ద్వారా బయట నుంచి అందించిన సబ్‌స్ట్రేట్‌లు, ADP లోపలికి ప్రవేశించగలవు. కణ సందర్భంలో సబ్‌స్ట్రేట్-మార్గ లోపాన్ని నిర్ధారించడానికి ఇవి సరైన సాధనం. అధిక పారగమ్యత కల్పించడం బాహ్య పొరను దెబ్బతీస్తుంది; సైటోసాల్ ఆధారిత నియంత్రణ బయటకు కొట్టుకుపోతుంది.

చెక్కుచెదరని కణాలు అన్నింటినీ నిలుపుకుంటాయి: ప్లాస్మా పొర అవరోధం, సైటోసాల్‌లోని క్షయీకరణ పదార్థాలు, అంతర్జనిత సబ్‌స్ట్రేట్ రవాణా, మైటోకాండ్రియా నెట్‌వర్క్, ATP అవసరం. ఇవి శరీరధర్మ పరిస్థితులకు అత్యంత దగ్గరగా, కార్యవిధానాన్ని నిర్ధారించడానికి అత్యంత దూరంగా ఉంటాయి. ఎందుకంటే రంగు పదార్థ గ్రహణం, క్షయీకరణ, విడిగా నిల్వ కావడం అన్నీ మైటోకాండ్రియాకు నిజంగా చేరే రంగు పదార్థ పరిమాణాన్ని నిర్ణయిస్తాయి.

TEGDMA అధ్యయనం ఉద్దేశపూర్వకంగా ఈ మూడు స్థాయిలనూ ఉపయోగించింది: ఆక్సీకరణ, విద్యుత్ విభవాన్ని రంగు పదార్థం పునరుద్ధరించడాన్ని పరిశీలించడానికి వేరుచేసిన మెదడు మైటోకాండ్రియా; లోపం కాంప్లెక్స్ Iతో అనుబంధమైన సబ్‌స్ట్రేట్ ఆక్సీకరణలో ఉందని ప్రధానంగా నిర్ధారించడానికి పారగమ్యత కల్పించిన దంత పల్ప్ మూలకణాలు; అణచివేయబడిన ఆక్సిజన్ వినియోగంపై 2 uM రంగు పదార్థం చూపే మొత్తం శరీరధర్మ ప్రభావాన్ని తెలుసుకోవడానికి చెక్కుచెదరని మూలకణాలు. వేర్వేరు నమూనా సన్నాహాల్లో మైటోకాండ్రియా కొలతలను పోల్చే పాఠకులకు, శ్వాసక్రియ గొలుసు ద్వారా మిథిలీన్ బ్లూ ఎలక్ట్రాన్‌లను ఎలా తరలిస్తుందనే అనుబంధ వివరణ మార్గానికి సంబంధించిన నేపథ్యాన్ని అందిస్తుంది. మిథిలీన్ బ్లూ శ్వాసక్రియ అధ్యయనాలను అర్థం చేసుకునే మార్గదర్శిని, ఉపయోగించిన పరిమాణం మరియు నిరోధకాల ఎంపిక వెనుక తర్కాన్ని వివరిస్తుంది.

రెడాక్స్-క్రియాశీల రంగు పదార్థానికి అవసరమైన నియంత్రణలు

రెడాక్స్ చక్రీయ పదార్థానికి సాధారణ నిరోధకం కంటే ఎక్కువ నియంత్రణలు అవసరం. ఎందుకంటే రంగు పదార్థం మాత్రమే చేసే రసాయనిక చర్యలు జీవ ప్రక్రియలను అనుకరించగలవు.

రెస్పిరోమెట్రీలో కొలత డ్రిఫ్ట్‌ను తెలుసుకోవడానికి బఫర్ మాత్రమే ఉన్న చాంబర్, జీవ పదార్థం లేకుండా బఫర్‌తో పాటు రంగు పదార్థం ఉన్న చాంబర్, రంగు పదార్థంతో పాటు పరీక్షలో ఉన్న ఏదైనా బాహ్యకణ క్షయీకరణ పదార్థం కలిగిన పరీక్షను నడపాలి. చెక్కుచెదరని కణాల్లో మైటోకాండ్రియేతర ఆక్సిజన్ వినియోగాన్ని నిర్వచించడానికి చివరలో రోటెనోన్‌తో పాటు యాంటిమైసిన్‌ను ఉపయోగించాలి. క్షయీకరణ చెందిన రంగు పదార్థం ఆక్సిజన్‌కు ఎలక్ట్రాన్‌లను బదిలీ చేసి హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్‌ను ఏర్పరుస్తూ తిరిగి ఆక్సీకరణ చెందుతుందని గుర్తుంచుకోండి. కాబట్టి ఎలక్ట్రాన్ దాత లేని రంగు పదార్థం-మాత్రమే బ్లాంక్, NADH లేదా NADPH అందుబాటులో ఉన్నప్పుడు ఏర్పడే కణరహిత ఆక్సిజన్ వినియోగాన్ని తక్కువగా అంచనా వేస్తుంది.

హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ కోసం, ఎంపికాత్మకత లేని DCFDA రంగు పదార్థాల కంటే కాలిబ్రేట్ చేసిన Amplex UltraRedతో పాటు హార్స్‌రాడిష్ పెరాక్సిడేస్‌ను ఎంచుకోండి. కాటలేస్‌తో ధృవీకరించండి; రంగు పదార్థం కాంతి-సెన్సిటైజర్ కాబట్టి కాంతిపై ఆధారపడటాన్ని పరీక్షించండి. కేవలం 100 nM రంగు పదార్థం వద్దనే పెరాక్సైడ్ భారం నాలుగు రెట్లకు మించి పెరిగిందని, అదే సమయంలో దాని తొలగింపు నెమ్మదించిందని మెదడు మైటోకాండ్రియా అధ్యయనం కనుగొంది. సూపర్‌ఆక్సైడ్ మధ్యవర్తి లేకుండానే క్షయీకరణ చెందిన రంగు పదార్థం నేరుగా పెరాక్సైడ్‌ను ఏర్పరిచింది. ప్రోబ్ ఎంపిక, కాంతి నియంత్రణల వివరాలు రంగు పదార్థ ప్రయోగాల్లో ప్రతిక్రియాశీల ఆక్సిజన్ జాతులను కొలవడం అనే అనుబంధ వ్యాసంలో ఉన్నాయి. పెరాక్సైడ్ ఎప్పుడు సంకేతంగా, ఎప్పుడు భారంగా పనిచేస్తుందనే విస్తృత ప్రశ్నను కణ రెడాక్స్ సమతుల్యత మరియు యాంటీఆక్సిడెంట్ వాదనలుతో పాటు చర్చించారు.

మార్గానికి సంబంధించిన వాదనల కోసం, కాంప్లెక్స్ IIIలోని రెండు నిరోధక స్థానాలనూ పరీక్షించండి: Qi స్థానం వద్ద యాంటిమైసిన్ A, Qo స్థానం వద్ద మిక్సోథయజోల్. వాటితో పాటు సయనైడ్‌తో కాంప్లెక్స్ IV ముగింపు పరీక్షను చేయండి. మునుపటి ఎలుక మెదడు అధ్యయనం, రోటెనోన్‌తో నిరోధించిన శ్వాసక్రియను రంగు పదార్థం పునరుద్ధరించిందని, కానీ యాంటిమైసిన్‌తో నిరోధించిన శ్వాసక్రియను పునరుద్ధరించలేదని నివేదించింది. తరువాతి మూడు-జాతుల అధ్యయనం రెండు నిరోధకాలతోనూ పాక్షిక పునరుద్ధరణను, నేరుగా సైటోక్రోమ్ c క్షయీకరణకు ఆధారాలను కనుగొంది. బైపాస్‌ను నిర్ధారిత విషయంగా కాకుండా, కొత్త డేటాకు అనుగుణమైనదిగా పరిగణించండి. ఎందుకంటే రంగు పదార్థ సాంద్రత, నిరోధక స్థానం, సబ్‌స్ట్రేట్ స్థితి, రంగు పదార్థ పంపిణీ అన్నీ గమనించిన మార్గాన్ని మారుస్తాయి.

పరీక్షల ఎంపిక పట్టిక

ప్రశ్నను బట్టి కొలతను ఎంచుకోవడానికి ఈ పట్టికను ఉపయోగించండి; కొలతను బట్టి ప్రశ్నను ఎంచుకోవద్దు.

కనీసంగా నమ్మదగిన వాదన చేయాలంటే, ఒకే రంగు పదార్థ సాంద్రతలను—100 nM, 300 nM, 1 uM, 2 uM—ఉపయోగించి, లీక్, ADP, ఒలిగోమైసిన్, అన్‌కప్లర్ పరిస్థితుల్లో ఆక్సిజన్ ప్రవాహం; ATP సంశ్లేషణ రేటు; వీలైతే రెండు ప్రోబ్‌లతో పొర విద్యుత్ విభవం; కాటలేస్, కణరహిత నియంత్రణలతో కాలిబ్రేట్ చేసిన పెరాక్సైడ్ విడుదలను పరీక్షించాలి. పరస్పర సంబంధం ఉన్న కొలతల సమూహాన్ని నివేదించండి: ఆక్సిజన్ ప్రవాహం, ATP రేటు, ఆక్సిజన్‌కు ATP నిష్పత్తి, విద్యుత్ విభవం, పెరాక్సైడ్. వాటిలో ఏ ఒక్క సంఖ్యైనా ఒంటరిగా ఉంటే, అది అర్థం కోసం ఎదురుచూస్తున్న కొలత మాత్రమే.