లోఫ్లర్ క్షార మరియు పాలిక్రోమ్ మిథిలీన్ బ్లూ రంజకాల వివరణ

రంజనం చేసే బల్లపై మూడు సీసాలు పక్కపక్కనే ఉండవచ్చు. ప్రతి సీసాపైనా మిథిలీన్ బ్లూ యొక్క ఏదో ఒక రూపం పేరు ఉంటుంది. ఒకదానిపై జలీయ మిథిలీన్ బ్లూ 1% అని ఉంటుంది. మరొకదానిపై లోఫ్లర్ క్షార మిథిలీన్ బ్లూ అని ఉంటుంది. ఇంకొకదానిపై పాలిక్రోమ్ మిథిలీన్ బ్లూ అని ఉంటుంది. పనిలో మునిగిపోయిన సిబ్బంది దగ్గరలో ఉన్న సీసాను తీసుకుంటారు. ఆ తర్వాత స్మియర్‌కు చాలా లేతగా రంగు పడుతుంది, లేదా అంతటా ఒకే నీలం రంగు వస్తుంది, లేదా ఊహించని ఊదా ఛాయలు కనిపిస్తాయి. ఆ ఫలితానికి నమూనానే కారణమని భావిస్తారు.

ఇది ద్రావణ కూర్పుకు సంబంధించిన సమస్య, నమూనాకు సంబంధించిన సమస్య కాదు. ఈ మూడు ద్రావణాల్లో పరస్పర సంబంధమున్న రంగు పదార్థాలు ఉన్నప్పటికీ, వాటి రంజన విధానాలు వేర్వేరు. ఒకటి దాదాపు తటస్థ pH వద్ద ఉండే సాధారణ ధనావేశ రంజకం. మరొకటి అదే రంజకం, కానీ క్షారాన్ని కలపడం వల్ల మరింత బలంగా పనిచేస్తుంది. ఇంకొకటి అసలు ఒకే రంజకం కాదు; ఉద్దేశపూర్వకంగా ఆక్సీకరించిన మిశ్రమం. తప్పు ద్రావణాన్ని ఉపయోగిస్తే, మీరు అనుసరిస్తున్న రంజన సూత్రమే మారిపోతుంది.

సంక్షిప్త సమాధానం

సాధారణ జలీయ మిథిలీన్ బ్లూ ప్రాథమిక ప్రమాణం: నీటిలో సుమారు 1% రంజకం. ఇది బ్యాక్టీరియా ఆకృతిని పరిశీలించడానికి, సాధారణ సూక్ష్మదర్శిని పరిశీలనకు ఉపయోగించే సరళమైన ధనావేశ రంజకం. లోఫ్లర్ క్షార మిథిలీన్ బ్లూలో, నీటితో పలుచన చేసిన ఆల్కహాలిక్ స్టాక్ ద్రావణానికి కొలిచిన కొద్దిపాటి పలుచని క్షారాన్ని కలుపుతారు. దీనివల్ల pH పెరిగి, ధనావేశ రంజకం బ్యాక్టీరియాలోని ఆమ్ల స్వభావం గల నిర్మాణాలకు మరింత బలంగా బంధిస్తుంది. పాలిక్రోమ్ మిథిలీన్ బ్లూ అనేది క్షారంలో ఆక్సీకరణ ద్వారా ఉద్దేశపూర్వకంగా పరిపక్వం చేసిన మిథిలీన్ బ్లూ. అందువల్ల ఆ సీసాలో మిగిలిన మిథిలీన్ బ్లూతో పాటు మిథైల్ సమూహాలు తొలగిన సమజాత పదార్థాలు (అజ్యూర్ A, azure B, అజ్యూర్ C), థయోనిన్, మిథిలీన్ వయొలెట్ మిశ్రమంగా ఉంటాయి. ఈ మిశ్రమం వేర్వేరు నిర్మాణాలకు వేర్వేరు రంగు ఛాయలను ఇస్తుంది.

ఒక్క వాక్యమే గుర్తుంచుకోవాలంటే: క్షారీకరణ రంజన తీవ్రతను మారుస్తుంది; పాలిక్రోమింగ్ రంజన రంగులను మారుస్తుంది.

సాధారణ జలీయ మిథిలీన్ బ్లూ: పోలికకు ఆధారం

అత్యంత సరళమైన కూర్పు నీటిలో కరిగించిన మిథిలీన్ బ్లూ. సాధారణంగా ఇది 1% w/v సాంద్రతలో ఉంటుంది; క్షారం కలపరు, ఆక్సీకరణ చేయరు. రంగును ఇచ్చే రసాయన రూపం క్లోరైడ్ ప్రతిఅయాన్‌తో కూడిన మిథైల్‌థయోనినియం ధన అయాన్. ఇది చిన్నదైన, సమతల ఫీనోథయజీన్ రంజకం. PubChem మిథిలీన్ బ్లూ నమోదులో దీనిని మిథైల్‌థయోనినియం క్లోరైడ్‌గా పేర్కొన్నారు. ధన అయాన్‌గా ఇది న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల ఫాస్ఫేట్ వెన్నెముకలకు, బ్యాక్టీరియా కణ గోడలపై ఉన్న ఆమ్ల స్వభావం గల సమూహాలకు బంధిస్తుంది. తద్వారా లేత నేపథ్యంపై కణాలు నీలంగా కనిపిస్తాయి.

దీని ప్రయోజనం ఫలితాలను ముందుగా అంచనా వేయగలగడం. కేంద్రకాలు, బ్యాక్టీరియా నీలంగా కనిపిస్తాయి. నేపథ్యంతో రంగు వ్యత్యాసం మితంగా ఉంటుంది. స్పష్టంగా కనిపించని సూక్ష్మజీవులకు బలహీనంగా రంగు పడవచ్చు. లోఫ్లర్ పరిష్కరించాలనుకున్న పరిమితి ఇదే. ఈ ద్రావణం ఏ విస్తృత సరళ బ్యాక్టీరియా రంజకాల వర్గానికి చెందుతుందో తెలుసుకోవడానికి, బ్యాక్టీరియా సరళ రంజనంపై సమగ్ర వివరణను చూడండి. ఇక్కడ కూడా పదార్థాన్ని సరిగ్గా గుర్తించడం అవసరం: మిథైల్ బ్లూ పూర్తిగా భిన్నమైన అణువు అని మిథైల్ బ్లూ, మిథిలీన్ బ్లూ మధ్య తేడాలు వివరిస్తుంది. అందువల్ల కేవలం రంగు పేరుతో కేటలాగ్‌లో వెతికితే, తప్పు రంజక వర్గానికి చెందిన పదార్థం లభించవచ్చు.

లోఫ్లర్ క్షార మిథిలీన్ బ్లూ: అదే రంజకం, మరింత బలమైన రంజనం

సాంప్రదాయ లోఫ్లర్ తయారీ విధానంలో ఆల్కహాలిక్ మిథిలీన్ బ్లూ స్టాక్ ద్రావణాన్ని నీటిలోని పలుచని క్షారంతో కలుపుతారు. పాఠ్యపుస్తకాల్లోని విధానాల ప్రకారం, 30 mL 95% ఇథనాల్‌లో 0.3 g రంజకానికి 100 mL 0.01% జలీయ పొటాషియం హైడ్రాక్సైడ్‌ను కలుపుతారు. లేదా సమానంగా, 30 mL సంతృప్త ఆల్కహాలిక్ మిథిలీన్ బ్లూ, 100 mL స్వేదనజలం, 1 mL 1% KOH కలుపుతారు. దీనివల్ల స్పష్టంగా క్షార స్వభావం గల pH వద్ద సుమారు 0.3% రంజకం ఉండే వినియోగ ద్రావణం తయారవుతుంది. వాణిజ్య ఉత్పత్తులు కూడా ఇదే సూత్రాన్ని అనుసరిస్తాయి. Thermo Fisher సూక్ష్మజీవశాస్త్ర రంజకాల కేటలాగ్ లోఫ్లర్ క్షార మిథిలీన్ బ్లూ, పాలిక్రోమ్, జలీయ రూపాలను వేర్వేరు ఉద్దేశిత ఉపయోగాలున్న ప్రత్యేక కేటలాగ్ ఉత్పత్తులుగా జాబితా చేస్తుంది.

ఇందులో కీలకమైనది క్షారం. pH పెరగడం వల్ల నమూనాలోని కార్బాక్సిల్, ఫాస్ఫేట్ సమూహాల నుంచి ప్రోటాన్లు తొలగిపోయి, ఋణావేశ స్థానాల సాంద్రత పెరుగుతుంది. అదే సమయంలో ఇథనాల్ స్టాక్ ద్రావణం రంజకాన్ని పూర్తిగా కరిగిన స్థితిలో ఉంచుతుంది. అందువల్ల అది మోనోమర్ రూపంలో ఆ స్థానాలకు చేరుతుంది. ఫలితంగా, తటస్థ జలీయ రంజకంతో పోలిస్తే బ్యాక్టీరియాకు వేగంగా, మరింత గాఢంగా రంగు పడుతుంది. సాధారణ బ్యాక్టీరియాలజీ స్మియర్‌లో పరిచితమైన ముదురు నీలం దండాకార, గోళాకార బ్యాక్టీరియా కనిపిస్తాయి. రంజన సమయం సాధారణంగా ఒకటి నుంచి మూడు నిమిషాలు; ఆ తర్వాత నీటితో కడుగుతారు.

సాంప్రదాయ ఉపయోగం లోఫ్లర్ సీరమ్ మాధ్యమంపై పెంచిన Corynebacterium diphtheriae పరిశీలన. ఇవి సన్నని, తరచూ గద ఆకారంలో ఉండే దండాలు. వీటిలో నిల్వ ఉన్న పాలిఫాస్ఫేట్‌తో కూడిన మెటాక్రోమాటిక్ బాబెస్-ఎర్న్‌స్ట్ కణికలకు గాఢంగా రంగు పడుతుంది. ఈ మాధ్యమం, రంజకం కలిపి ఉపయోగించడం చారిత్రకంగా ఏర్పడింది; రెండింటి అభివృద్ధి ఘనత ఒకే బ్యాక్టీరియాలజిస్టుకు చెందుతుంది. కణికలు స్పష్టంగా వేరుగా కనిపించడం వల్ల రోగనిర్ధారణ ప్రయోజనం కలుగుతుంది. డిఫ్తీరియా సంబంధిత పనులకు మించి, కల్చర్ల నుంచి తయారుచేసిన స్మియర్లలో సాధారణ బ్యాక్టీరియాలజీ రంజకంగా, క్లినికల్ స్మియర్లలో Neisseria ఆకృతిని పరిశీలించడానికి, గ్రామ్ రంజనం అవసరం లేకపోయినా సాధారణ జలీయ నీలం రంజకం చాలా లేతగా రంగు ఇచ్చే సందర్భాల్లో దీన్ని ఉపయోగిస్తారు. ఇది ఏకవర్ణ రంజకం. ఆమ్ల స్వభావం గల ప్రతిదీ ఏదో ఒక నీలం ఛాయను పొందుతుంది. ఒక విధానంలో వేర్వేరు రంగులతో భేదాన్ని చూపాలని సూచిస్తే, క్షారం ఒక్కటే దాన్ని అందించలేదు.

ఒక ఆచరణాత్మక జాగ్రత్త: క్షార రంజక ద్రావణాలు నిల్వ సమయంలో, కార్బన్ డయాక్సైడ్‌ను గ్రహించడం వల్ల క్షీణించి అవక్షేపం ఏర్పరుస్తాయి. ప్రతి స్లైడ్‌పైనా మడ్డి పడే పాత సీసాను కొనసాగిస్తూ ఉపయోగించడం బదులు, ప్రయోగశాలలు పరిమిత పరిమాణాల్లో ద్రావణాన్ని తయారుచేసుకుంటాయి లేదా కేటలాగ్ ద్రావణాన్ని కొనుగోలు చేసి దాని నిల్వ గడువును పాటిస్తాయి.

పాలిక్రోమ్ మిథిలీన్ బ్లూ: ఒక పేరు, అనేక రంజకాలు

పాలిక్రోమ్ మిథిలీన్ బ్లూ తయారీ అదే రంజకంతో మొదలవుతుంది, కానీ దానిని క్షారంలో నియంత్రిత ఆక్సీకరణకు లోనుచేస్తారు. చారిత్రకంగా దీన్ని పరిపక్వీకరణ లేదా పాలిక్రోమింగ్ అని పిలిచేవారు. క్షారంలో కాలక్రమేణా జరిగే మార్పులు, కార్బోనేట్‌తో వేడి చేయడం, లేదా డైక్రోమేట్ వంటి పదార్థాలతో ఆక్సీకరించడం వల్ల డైమిథైలమినో ప్రతిస్థాపక సమూహాల నుంచి మిథైల్ సమూహాలు దశలవారీగా తొలగిపోతాయి. ఫలితంగా ఒక మిశ్రమం ఏర్పడుతుంది: మిగిలిన మిథిలీన్ బ్లూతో పాటు azure B (ఒక మిథైల్ తొలగింది), అజ్యూర్ A, అజ్యూర్ C (మరింత డీమిథైలేషన్), థయోనిన్ (మిథైల్ సమూహాలు పూర్తిగా తొలగాయి), మిథిలీన్ వయొలెట్ వర్గానికి చెందిన ఆక్సీకరణ ఉపఉత్పత్తులు ఉంటాయి. ప్రతి భాగానికి తనదైన రంగు ఛాయ, కణజాల బంధన ప్రవణత ఉంటాయి. అందువల్ల మిశ్రమం మెటాక్రోమాటిక్ రంజనం చేస్తుంది: కేంద్రకాలు, కణికలు, మ్యూసిన్లు, మృదులాస్థి నీలం నుంచి ఎరుపు-ఊదా వరకు వేర్వేరు ఛాయలను పొందుతాయి.

ప్రసిద్ధ రక్త రంజకాల వెనుక ఉన్న రసాయన ప్రక్రియ కూడా ఇదే. క్షారీకరించిన మిథిలీన్ బ్లూ మలేరియా పరాన్నజీవి కేంద్రకాలకు ఊదా ఛాయలను ఇస్తుందని తొలి పరిశోధకులు గుర్తించారు. కానీ వారి జలీయ పరిపక్వ ద్రావణాలు అస్థిరంగా ఉండి, కొన్ని రోజుల్లోనే అవక్షేపాలు ఏర్పరచేవి. ఊదా రక్త రంజకం ఎలా ఆవిష్కృతమైంది అనే సమీక్షలో, మలఖోవ్‌స్కీ, రొమనోవ్‌స్కీ 1891లో ఈ ప్రభావాన్ని స్వతంత్రంగా ఎలా ఉపయోగించుకున్నారో, రంజక అవక్షేపాన్ని స్థిరపరచడానికి, వేడి చేయకుండా ఫిల్మ్‌లను స్థిరీకరించడానికి మెథనాల్‌ను ఎలా ప్రవేశపెట్టారో, తర్వాత గీమ్సా కొలిచిన azure B, ఇయోసిన్ ఆధారంగా గ్లిసరాల్ స్థిరీకరణతో మిశ్రమాన్ని ఎలా ప్రమాణీకరించారో వివరించారు. ఆధునిక గీమ్సా తరహా రంజకాలు నేరుగా పాలిక్రోమ్ మిథిలీన్ బ్లూ, ఇయోసిన్ కలయిక నుంచి అభివృద్ధి చెందాయి. ఈ కలయికే రొమనోవ్‌స్కీ ప్రభావాన్ని ఉత్పత్తి చేస్తుంది. ఇయోసిన్‌తో కలయిక, azure B భాగం గురించి వివరాల కోసం, రొమనోవ్‌స్కీ తరహా రంజకాలు, azure B ఇయోసిన్ పరస్పర చర్య చూడండి.

ఇది మిశ్రమం కావడం వల్ల, ఈ మూడింటిలో పాలిక్రోమ్ మిథిలీన్ బ్లూ స్వభావరీత్యా అత్యల్పంగా ప్రమాణీకరించబడింది. దాని కచ్చితమైన రంగు ఛాయల సమతుల్యత ఆక్సీకరణ విధానం, ఆక్సీకరణ జరిగిన పరిమాణంపై ఆధారపడుతుంది. అందుకే హిస్టాలజీ సరఫరాదారులు దీన్ని పాతబడిన లోఫ్లర్ ద్రావణంగా కాకుండా, ప్రత్యేక పనితీరు పరీక్షలున్న వేరే ఉత్పత్తిగా విక్రయిస్తారు. సాధారణ ఉపయోగాల్లో మాస్ట్ కణ కణికలు, మ్యూసిన్లు, మృదులాస్థిని మెటాక్రోమాటిక్‌గా చూపించడం, ప్లాస్మా కణాల వివరాలను చూపించడం, గుడ్‌పాస్చర్ తరహా పాలిక్రోమ్ విధానాలతో కణజాల విభాగాల్లో Helicobacter pylori ని చూపించడం ఉన్నాయి. రంగుల ఆధారంగా భేదాలను చూపించాలనుకున్నప్పుడు ఇది సరైన ఎంపిక. విధానంలో స్పష్టమైన ఏకవర్ణ బ్యాక్టీరియా ఆకృతిని ఆశించినప్పుడు ఇది తప్పు ఎంపిక.

కూర్పు, ప్రయోజనాల పోలిక

ఈ పట్టికను నిర్ణయం తీసుకునే విధానంగా చదవండి. నమూనాకు చాలా లేతగా రంగు పడితే, pH ఆధారిత విధానాన్ని మార్చి లోఫ్లర్ ద్రావణాన్ని తీసుకోండి. అన్నింటికీ రంగు పడినా, ఏదీ ప్రత్యేకంగా వేరుగా కనిపించకపోతే, రంజక విధానాన్ని మార్చి పాలిక్రోమ్‌ను తీసుకోండి. లోఫ్లర్ స్మియర్‌లో కణికలు చాలా స్పష్టంగా కనిపించినా, కేంద్రకాలు, కణద్రవ్యం రెండూ ఒకే నీలం రంగులో ఎందుకు ఉన్నాయని పర్యవేక్షకుడు అడిగితే, ఏ క్షార ఏకవర్ణ రంజకమూ ఆ భేదాన్ని చూపించలేదన్నదే సమాధానం. ఆ అవసరానికి పాలిక్రోమ్ వర్గం, దాని రక్త రంజక ఉత్పన్నాలు సంబంధించినవి.

సాధారణ గందరగోళాలను నివారించడం

ఈ గందరగోళంలో ఎక్కువ భాగానికి రెండు పొరపాట్లు కారణం. మొదటిది, సీసాలో రెండూ నీలంగా కనిపిస్తాయి కాబట్టి లోఫ్లర్ ద్రావణాన్ని సాధారణ మిథిలీన్ బ్లూతో పరస్పరం మార్చి ఉపయోగించవచ్చని భావించడం. వాటి pH, రంజన తీవ్రత భిన్నంగా ఉంటాయి. లోఫ్లర్ ద్రావణాన్ని సూచించిన చోట తటస్థ రంజకాన్ని ఉపయోగిస్తే, ఆ విధానం ప్రత్యేకంగా చూపించాలనుకున్న కణికల రంగు వ్యత్యాసమే పోతుంది. రెండవది, ఏ పాత లేదా అనుకోకుండా పాతబడిన క్షార నీలం ద్రావణాన్నైనా పాలిక్రోమ్‌గా భావించడం. నియంత్రణ లేని కాలానుగుణ మార్పులు తెలియని సాంద్రతలో తెలియని మిశ్రమాన్ని ఉత్పత్తి చేస్తాయి. నిజమైన పాలిక్రోమ్ ద్రావణాలను మాత్రం నిర్దిష్ట ఆక్సీకరణ విధానాలతో తయారుచేస్తారు. రక్త రంజకాల అభివృద్ధి పరంపరలో వాటిని కొలిచిన ఇయోసిన్‌తో కలుపుతారు. ఇక్కడ చరిత్ర ఒక పాఠాన్ని అందిస్తుంది: నియంత్రణ లేని మిశ్రమాలను పునరుత్పాదించలేకపోయినందుకే 1890ల నాటి అస్థిర జలీయ పరిపక్వ ద్రావణాల స్థానంలో మెథనాల్ ఆధారంగా స్థిరపరచిన కూర్పులు వచ్చాయి. ఎంత పాతదో తెలియని సీసాలోని ద్రావణంతో రోగనిర్ధారణ స్లైడ్‌కు రంగు వేయడానికి ముందు ఈ పాఠాన్ని గుర్తుచేసుకోవాలి.

పేరును కచ్చితంగా గుర్తించడం ఈ గందరగోళాన్ని పూర్తిగా నివారిస్తుంది. రంగును బట్టి ఊహించకుండా, లేబుల్‌పై ఉన్న కేటలాగ్ ఉత్పత్తి రకం (జలీయ, లోఫ్లర్, పాలిక్రోమ్), రంజక పరిమాణం, ఉద్దేశిత ఉపయోగాన్ని నిర్ధారించండి. ఈ మూడు కూర్పులకు ఒకే మూల వర్ణదాయక నిర్మాణం ఉంది. వాటి ప్రయోజనాలు మాత్రం వేర్వేరు.