நுண்ணோக்கிக்கான Methylene Blue மாற்றுகள்

ஒரு எளிய பாக்டீரியா smear-இல், செல்களின் வடிவத்தைப் பார்ப்பதே நோக்கமாக இருந்தால் methylene blue-க்கு பதிலாக crystal violet பயன்படுத்தலாம். உயிருள்ள செல்களுக்கு, எந்த stain-மும் இல்லாத phase contrast சிறந்த மாற்றாக இருக்கலாம். நீங்கள் செய்ய வேண்டிய பார்வையிடுதலைப் பொறுத்தே தேர்வு அமையும்.

இருவர் ஒரே பாக்டீரியா culture-ஐ ஆய்வு செய்கிறார்கள் என்று வைத்துக்கொள்ளுங்கள். ஒருவருக்கு குச்சி வடிவச் செல்களையும் வட்டச் செல்களையும் வேறுபடுத்த வேண்டும். மற்றொருவருக்கு ஒரு treatment பாக்டீரியாவைக் கொன்றதா என்பதைத் தெரிந்துகொள்ள வேண்டும். முதல் நபருக்கு தெளிவான படத்தை வழங்கும் stain, இரண்டாவது நபருக்கு பயன்படுத்தக்கூடிய பதிலை வழங்காமல் இருக்கலாம்.

ஒரு மாற்றைத் தேர்ந்தெடுப்பதற்கு முன், இந்த வாக்கியத்தை நிறைவு செய்யுங்கள்: “நான் ___-இல் ___-ஐக் கவனிக்க வேண்டும், மேலும் செல்கள் உயிருடன் இருக்க வேண்டும் / இருக்க வேண்டியதில்லை.” அந்த வாக்கியம் stain செய்ய வேண்டிய பணியை வரையறுக்கிறது.

மாதிரியையும் கேள்வியையும் முதலில் எடுத்துக்கொள்ளுங்கள்

முதலில் செல்கள் உயிருடன் இருக்க வேண்டுமா என்பதைத் தீர்மானியுங்கள்; பின்னர் நீங்கள் கவனிக்க வேண்டிய அம்சத்தை அடையாளம் காணுங்கள்:

செல்கள் உயிருடன் இருக்க வேண்டும்: இயக்கம் அல்லது வடிவத்திற்காக, stain செய்யாத phase contrast அல்லது DIC-ஐ பரிசீலிக்கவும்; nuclear DNA-க்காக, fluorescence உடன் Hoechst 33342-ஐ பரிசீலிக்கவும்; membrane integrity-க்காக, SYTO 9 மற்றும் propidium iodide போன்ற சரிபார்க்கப்பட்ட assay-ஐத் தேர்ந்தெடுக்கவும்.
செல்கள் உயிருடன் இருக்க வேண்டியதில்லை: பாக்டீரியா morphology-க்காக, crystal-violet simple stain அல்லது nigrosin negative stain-ஐ பரிசீலிக்கவும்; Gram reaction-க்காக, முழுமையான Gram-stain முறையைப் பயன்படுத்தவும்; fixed cells-இல் nuclear DNA-க்காக, DAPI fluorescence-ஐ பரிசீலிக்கவும்.

ஒவ்வொரு கிளையின் வரம்புகளையும் ஒப்பிட இந்த அட்டவணையைப் பயன்படுத்தவும். இவை முறைத்தேர்வுகள்; ஏற்கனவே உள்ள protocol-இல் பாட்டில்களை ஒன்றுக்கொன்று மாற்றுவதற்கான வழிமுறைகள் அல்ல.

நீங்கள் கவனிக்க வேண்டியது	மாதிரி மற்றும் உபகரணம்	சாத்தியமான மாற்று	முக்கிய வரம்பு
பாக்டீரியா வடிவமும் அமைப்பும்	தயாரிக்கப்பட்ட bacterial smear; brightfield	Crystal violet simple stain	Morphology-ஐக் காட்டுகிறது; Gram reaction அல்லது viability-ஐ உறுதிப்படுத்தாது.
இருண்ட பின்னணிக்கு எதிரான cell outlines	Bacteriological preparation; brightfield	Nigrosin negative stain	Preparation மற்றும் formulation முக்கியம்; stain செய்யப்படாத cell அவசியமாக உயிருடன் இருக்க வேண்டும் என்பதில்லை.
Gram reaction	தயாரிக்கப்பட்ட bacterial smear; brightfield	முழுமையான Gram-stain முறை	முழு reagent sequence மற்றும் controls தேவை.
உயிருள்ள செல்களில் இயக்கம் அல்லது மாற்றங்கள்	ஏற்ற wet preparation; phase contrast அல்லது DIC	Stain இல்லை	பொருத்தமான optics தேவை; contrast ஒரு molecule-ஐ அடையாளம் காணாது.
Nuclear DNA	Fixed cells; fluorescence	DAPI	பொருத்தமான excitation மற்றும் emission filters தேவை.
உயிருள்ள செல்களில் nuclear DNA	Live cells; fluorescence	Hoechst 33342	Cell entry நடந்தது என்பதால் imaging conditions பாதிப்பற்றவை என்று நிரூபிக்க முடியாது.
பாக்டீரியா membrane integrity	Unfixed bacteria; fluorescence	SYTO 9 with propidium iodide	Membrane staining என்பது viability-க்கான மறைமுக அளவீடு.

எளிய smear-க்கு, முறையை கவனமாக மாற்றவும்

பாக்டீரியா morphology-ஐ ஒரே நிறத்தில் பார்ப்பதே பணியாக இருந்தால் crystal violet ஒரு நடைமுறை சாத்தியமான தேர்வாகும். FDA-வின் Bacteriological Analytical Manual, simple staining-க்கு ஏற்ற இரண்டு crystal-violet formulations-ஐ பட்டியலிடுகிறது. ஆவணப்படுத்தப்பட்ட formulation-ஐயும் அதற்கான preparation method-ஐயும் பயன்படுத்தவும்; dye-ன் பெயர் மட்டும் ஒரு செயல்படும் reagent-ஐ வரையறுக்காது.

Crystal violet, Gram staining-இலும் பயன்படுத்தப்படுகிறது; ஆனால் அதனால் crystal-violet simple stain ஒரு Gram stain ஆகாது. ASM Gram-stain protocol-இல், differential result என்பது crystal violet, iodine, decolorization மற்றும் counterstaining ஆகியவை வரிசையாகச் செயல்படுவதையே சார்ந்துள்ளது. அந்த படிகளை நீக்கினால், படத்திலிருந்து உறுதிப்படுத்தக்கூடிய தகவல் மாறிவிடும். இந்த வேறுபாட்டிற்காக simple staining மற்றும் Gram staining இடையிலான வேறுபாடு-ஐப் பார்க்கவும்.

Nigrosin outlines-ஐ வெளிப்படுத்த வேறு முறையை வழங்குகிறது: பின்புலத்தை அது இருண்டதாக மாற்றுகிறது; பாக்டீரியா செல்கள் ஒப்பீட்டளவில் வெளிர்ந்தவையாகத் தோன்றுகின்றன. பொதுவான மாற்றுப் பட்டியல் தவறவிடக்கூடிய ஒரு பயனுள்ள விவரம் Merck-ன் nigrosin வழிமுறைகள்-இல் உள்ளது. அதில் குறிப்பிடப்பட்ட working formulation-இல் formaldehyde உள்ளது. எனவே செல்கள் stain செய்யப்படாதவையாகத் தோன்றினாலும், “negative stain” என்ற சொற்களை மட்டும் வைத்து live-cell compatibility உள்ளது என்று முடிவு செய்ய முடியாது. முழு formulation-ஐயும் specimen preparation-ஐயும் சரிபார்க்கவும்.

உயிருள்ள மாதிரிகளுக்கு, optics-ஐ மாற்றுவது குறித்து பரிசீலிக்கவும்

செல்கள் நகர்வதையோ பிரிவதையோ பார்க்க விரும்பினால், மற்றொரு dye-ஐச் சேர்ப்பது observation-ஐ சிக்கலாக்கலாம். தெளிவான specimens-இல் contrast குறித்த Nikon வழிகாட்டியில் விளக்கப்படுவது போல, phase contrast மற்றும் differential interference contrast, அல்லது DIC, specimens-ன் optical properties-இல் உள்ள வேறுபாடுகள் மூலம் அவற்றைக் காணக்கூடியதாக மாற்றுகின்றன. microscope-இல் தேவையான components இருந்தால், உயிருள்ள stain செய்யப்படாத செல்களை இவை வெளிப்படுத்தலாம்.

இந்தத் தேர்வு stain செய்யப்படாத preparation-ஐப் பேணுகிறது; ஆனால் கிடைக்கும் தகவலை மாற்றுகிறது. எந்த molecule contrast-ஐ உருவாக்கியது என்பதை அறியாமல் ஒரு boundary அல்லது movement-ஐப் பின்தொடரலாம். Molecular localization தான் கேள்வியாக இருந்தால், அதற்குப் பொருத்தமான labeling method-ஐத் தேர்ந்தெடுக்கவும்.

Nuclear DNA-க்காக, Invitrogen-ன் DAPI மற்றும் Hoechst stains ஒப்பீடு fixed cells-இல் DAPI பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படுவதையும், cell permeability அதிகமுள்ள Hoechst 33342 live-cell labeling-க்கு விரும்பப்படுவதையும் வேறுபடுத்திக் காட்டுகிறது. இரண்டிற்கும் fluorescence equipment தேவை. இவற்றில் எதுவும் நிறமுள்ள brightfield stain-க்கு நேரடி மாற்றல்ல.

Dye exposure மற்றும் illumination-ஐ experimental conditions ஆகக் கருதுங்கள். செல்களின் நடத்தைதான் உங்கள் measurement என்றால், stain செய்யப்பட்ட preparations-ஐ stain செய்யப்படாத preparations உடன் ஒப்பிடுங்கள்.

சிவப்பு cell என்றாலே அது இறந்த cell என்று அர்த்தமில்லை

பாக்டீரியா membrane integrity-ஐ மதிப்பிட SYTO 9 மற்றும் propidium iodide அடிக்கடி இணைந்து பயன்படுத்தப்படுகின்றன. BacLight manual intact membranes-ஐ green staining-உடனும் damaged membranes-ஐ red staining-உடனும் தொடர்புபடுத்துகிறது. அந்த விளக்கம் specimen-க்கேற்ப சரிபார்க்கப்பட வேண்டும்.

Rosenberg மற்றும் சகாக்கள் மேற்கொண்ட 2019 ஆய்வு இந்தப் பிரச்சினையை விளக்குகிறது. Phosphate-buffered saline-இல் glass மீது இருந்த 24-hour E. coli biofilms-இல், சுமார் 96% செல்கள் in situ-வில் propidium-iodide-positive ஆகத் தோன்றின. ஆனால் harvesting செய்த பிறகு 82% cultivable ஆக இருந்ததாக ஆசிரியர்கள் மதிப்பிட்டனர். Confocal images-இல் red-stained material-க்கு கீழே green interiors கொண்ட cells காணப்பட்டதால், தவறாக வழிநடத்தும் signal-இல் extracellular nucleic acids பங்கு வகிப்பதாகத் தெரிந்தது.

அந்த சதவீதங்கள் ஆய்வின் preparations-இல் செய்யப்பட்ட வெவ்வேறு measurements-ஐ விவரிக்கின்றன; அவை பொதுவான correction factor அல்ல. Signal-ஐ உருவாக்கியது என்ன என்பதைச் சரிபார்ப்பதே பயன்பாட்டுக்குரிய பாடம். Biofilm-இல், nucleic-acid dye என்பது damaged cells-க்குள் உள்ள material மட்டுமல்லாமல் cells-க்கு வெளியே உள்ள material-ஐயும் கண்டறியலாம். Viability குறித்த முடிவுக்கு, ஒவ்வொன்றுக்கும் வரம்புகள் உள்ளன என்பதை ஏற்றுக்கொண்டு cultivation அல்லது metabolic activity போன்ற complementary measurements-ஐ ஆராய்ச்சியாளர்கள் பரிந்துரைக்கிறார்கள்.

மாற்று உண்மையில் என்ன கொண்டுள்ளது என்பதைச் சரிபார்க்கவும்

ஒரு மாற்று staining method-லும் methylene blue இருக்கலாம். Giemsa ஒரு உதாரணம்: Merck அதன் product-ஐ azure-eosin-methylene-blue solution என்று விவரிக்கிறது; இது blood மற்றும் bone-marrow smears உள்ளிட்ட பயன்பாடுகளுக்காக வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது. வேறு specimen-க்கு இது வேறு method ஆக இருக்கலாம்; ஆனால் methylene blue-ஐத் தவிர்க்க வேண்டும் என்ற தேவையை இது பூர்த்தி செய்யாது.

ஒரு compound-ஐ விலக்குவது experiment-ன் பகுதியாக இருந்தால், images-ஐ ஒப்பிடுவதற்கு முன் reagent identity மற்றும் formulation-ஐச் சரிபார்க்கவும். methyl blue, methylene blue மற்றும் ஒத்த பெயர்களைக் கொண்ட dyes குறித்த வழிகாட்டி பெயரிடல் வேறுபாடுகளை விளக்குகிறது.

முடிவைப் பயன்படுத்துவதற்கு முன் மாற்றத்தைச் சரிபார்க்கவும்

ஒரு புதிய method-க்கு, representative specimens மற்றும் பொருத்தமான control பயன்படுத்தி ஒரு சிறிய comparison செய்யவும். முடிந்தவரை microscope settings-ஐ ஒப்பிடக்கூடியதாக வைத்திருக்கவும். Reagent formulation, specimen preparation, exposure மற்றும் imaging conditions-ஐப் பதிவு செய்யவும்; இதனால் சிறப்பாகத் தோன்றும் image-ஐ வெறுமனே விரும்புவதற்குப் பதிலாக அதற்கான காரணத்தை ஆய்வு செய்ய முடியும்.

வெற்றியை ஆரம்பக் கேள்வியின் அடிப்படையில் மதிப்பிடுங்கள். Morphology-க்காக, cell boundaries மற்றும் arrangement தொடர்ந்து விளக்கக்கூடியதாக உள்ளதா என்பதை மதிப்பிடுங்கள். Nuclear labeling-க்காக, signal location மற்றும் background-ஐ மதிப்பிடுங்கள். Viability-க்காக, கவர்ச்சிகரமான color separation-ஐத் தாண்டிய ஆதாரத்தைத் தேவைப்படுத்துங்கள். methylene blue staining மற்றும் laboratory applications குறித்த விரிவான வழிகாட்டி observation மற்றும் preparation எவ்வாறு ஒன்றுடன் ஒன்று பொருந்துகின்றன என்பதை விளக்குகிறது.

உங்களுக்கு தேவையான measurement-ஐப் பேணும் மாற்றைத் தேர்ந்தெடுக்கவும். உருவாகும் image-இன் பண்புகளில் color என்பது ஒன்றே.