மெத்திலீன் ப்ளூ மைட்டோகாண்ட்ரியாவின் காம்ப்ளெக்ஸ் III-ஐத் தவிர்த்துச் செல்லுமா? ஆய்வுகள் ஏன் முரண்படுகின்றன

தடுக்கப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியா காம்ப்ளெக்ஸ் III-ஐ மெத்திலீன் ப்ளூ தவிர்த்துச் செல்ல முடியுமா என்று இரண்டு ஆய்வகங்கள் கேட்டன. ஒன்று முடியாது என்றது. மற்றொன்று முடியும் என்றது. இரண்டிடமும் தரவுகள் இருந்தன.

சுண்டெலி மூளை மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் நடத்தப்பட்ட முதல் ஆய்வு, இந்தச் சாயத்தால் அது முடியாது என்று கண்டறிந்தது. மூன்று கொறித்துண்ணி இனங்களின் மூளை மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் நடத்தப்பட்ட இரண்டாவது ஆய்வு, ஓரளவு முடியும் என்று கண்டறிந்தது. சுண்டெலி கல்லீரலில் நடத்தப்பட்ட மூன்றாவது ஆய்வு, இவற்றுடன் அடிக்கடி மேற்கோள் காட்டப்படுகிறது; ஆனால் அது சோதித்தது வேறொன்றை. அதை உரிய இடத்தில் வைத்தால் குழப்பத்தில் பாதி தீர்ந்துவிடும்.

எல்லா நிலைகளுக்கும் பொருந்தும் ஒரு செயல்முறையை இங்கு அறிவிக்க முடியாது. வெவ்வேறு தடுப்பான்கள், சாய அளவுகள், அளவீடுகளுடன் நடத்தப்பட்ட மூன்று பரிசோதனைகள் உள்ளன. முதலில் நிபந்தனைகளைப் படியுங்கள். முடிவுகள் அவற்றைப் பின்தொடர்கின்றன.

இங்கே தவிர்த்துச் செல்லுதல் என்பதன் பொருள்

எலக்ட்ரான்கள் காம்ப்ளெக்ஸ் I வழியாகவும் (NADH-இலிருந்து) அல்லது காம்ப்ளெக்ஸ் II வழியாகவும் (சக்சினேட்டிலிருந்து) சங்கிலிக்குள் நுழைந்து, காம்ப்ளெக்ஸ் III வழியாக சைட்டோக்ரோம் c-க்குச் செல்கின்றன; பின்னர் காம்ப்ளெக்ஸ் IV வழியாக ஆக்சிஜனை அடைகின்றன. இந்தப் பாதையில் உருவாகும் படிநிலை வேறுபாட்டையே செல் ATP உருவாக்குவதற்குப் பயன்படுத்துகிறது.

மெத்திலீன் ப்ளூ ஒரு தடைக்கு முன்புள்ள இடத்தில் எலக்ட்ரான்களைப் பெற்றுக்கொண்டு, தடைக்குப் பின்புள்ள இடத்தில் அவற்றை வழங்குகிறது என்பதே தவிர்த்துச் செல்லுதல் குறித்த கூற்றின் பொருள். ஆக்சிஜனேற்றப்பட்ட சாயம் NADH அல்லது சங்கிலியின் ஆரம்பக் கூறுகளிலிருந்து எலக்ட்ரான்களைப் பெற்று லியூகோமெத்திலீன் ப்ளூவாக மாறுகிறது; ஒடுக்கப்பட்ட வடிவம் அவற்றை சைட்டோக்ரோம் c-க்கு வழங்குகிறது அல்லது மீண்டும் சங்கிலிக்குள் செலுத்துகிறது. இந்தப் பரிமாற்றம் தடைக்குப் பின்புறம் நிகழ்ந்தால், சுவாசமும் சவ்வு மின்னழுத்தமும் ஓரளவு மீள்கின்றன. அது தடையுள்ள இடத்திலோ அதற்கு முன்புறமோ நிகழ்ந்தால், எதுவும் மீள்வதில்லை.

காம்ப்ளெக்ஸ் III-இன் ஒரு விவரம் இந்தக் கருத்து வேறுபாட்டின் பெரும்பகுதியைத் தீர்மானிக்கிறது. இந்தக் காம்ப்ளெக்ஸ் இரண்டு தடுப்பான் பிணைப்பிடங்களைக் கொண்ட Q சுழற்சியை இயக்குகிறது. ஆன்டிமைசின் Qi இடத்தில் பிணைகிறது. மைக்சோதையசோல் Qo இடத்தில் பிணைகிறது. இவற்றில் ஒன்றை மட்டுமே பயன்படுத்தும் ஆய்வு, காம்ப்ளெக்ஸின் பாதியை மட்டுமே சோதித்துள்ளது.

முதல் ஆய்வு: சுண்டெலி மூளை மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் தவிர்த்துச் செல்லுதல் இல்லை

Gureev மற்றும் சக ஆய்வாளர்கள் C57BL/6 சுண்டெலிகளின் மூளைப் புறணியிலிருந்து டிஜிட்டோனின் மூலம் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாவைப் பயன்படுத்தி, 0.1 mg protein per ml செறிவில் சோதித்தனர். வினைமூலப்பொருட்கள் மூன்று அமைப்புகளில் பயன்படுத்தப்பட்டன: பைருவேட் மற்றும் மாலேட் தலா 5 mM, சக்சினேட் 10 mM உடன் குளூட்டமேட் 2 mM, மற்றும் L-புரோலின் 10 mM. தடுப்பான்கள் ரோட்டினோன் 1 micromolar (காம்ப்ளெக்ஸ் I) மற்றும் ஆன்டிமைசின் 1 microgram per ml (காம்ப்ளெக்ஸ் III). சாய அளவுகள் 0.5, 1, மற்றும் 2 micromolar; முதன்மைச் செறிவு 1 micromolar. முறைகளும் அளவீட்டுப் பதிவுகளும் FEBS Letters ஆய்வுக் கட்டுரையில் உள்ளன.

காம்ப்ளெக்ஸ் I-ஐத் தவிர்த்துச் செல்லுதல் செயல்பட்டது. ரோட்டினோன், ADP தூண்டிய சுவாசத்தைச் சுமார் 121-இலிருந்து சுமார் 2 nmol per minute per mg ஆகக் குறைத்தது; 1 micromolar சாயம் அதைச் சுமார் 21 ஆக மீட்டது. பைருவேட் மற்றும் மாலேட் பயன்படுத்தியபோதும், L-புரோலின் பயன்படுத்தியபோதும் சவ்வு மின்னழுத்தம் மீண்டது.

காம்ப்ளெக்ஸ் III-ஐத் தவிர்த்துச் செல்லுதல் செயல்படவில்லை. ஆன்டிமைசின் சுவாசத்தைச் சுமார் 16 ஆகக் குறைத்தது; சாயம் அதைச் சுமார் 20 வரை மட்டுமே உயர்த்தியது. 5 micromolar வரை சாய அளவுகளைப் பயன்படுத்தியபோதும், எந்த வினைமூலப்பொருளிலும் சவ்வு மின்னழுத்தம் மீளவில்லை. பெராக்சைடு தரவுகளும் இதே திசையைக் காட்டின: சாயம் மட்டும் பயன்படுத்தப்பட்டபோது, பெராக்சைடு வெளியீடு சுமார் 76 pmol per minute per mg என்ற அடிப்படை வீதத்திலிருந்து மூன்று அளவுகளில் முறையே சுமார் 1170, 1460, மற்றும் 1945 ஆக உயர்ந்தது; ஆனால் ஆன்டிமைசின், சாயத்தால் உண்டான அந்த அளவீட்டுச் சிக்னலை முறையே சுமார் 25, 88, மற்றும் 96 சதவீதம் குறைத்தது. ஒடுக்கப்பட்ட சாயம் ஆக்சிஜனுடன் நேரடியாக வினைபுரிந்தால், காம்ப்ளெக்ஸ் III-ஐத் தடுப்பது இந்தச் சிக்னலைக் குறைக்கக்கூடாது. ஒடுக்கப்பட்ட சாயம், ஆன்டிமைசின் தடைக்கு முன்புறமுள்ள காம்ப்ளெக்ஸ் III-இன் Qo இடத்தில் ஆக்சிஜனேற்றப்படுகிறது என ஆசிரியர்கள் முடிவுசெய்தனர். இந்தக் குறுகிய சுற்றை வார்த்தைகளில் சொன்னால்: வழங்கிகளிலிருந்து சாயத்துக்கு, சாயத்திலிருந்து Qo-க்கு, பின்னர் வழக்கமான பாதையில் தொடர்ந்து செல்லுதல். ரோட்டினோன் தடை தவிர்க்கப்படுகிறது. ஆன்டிமைசின் தடை தவிர்க்கப்படுவதில்லை.

இரண்டாவது ஆய்வு: மூன்று இனங்களில், இரண்டு தடுப்பான் இடங்களிலும் ஓரளவு தவிர்த்துச் செல்லுதல்

Svab மற்றும் சக ஆய்வாளர்கள் ஆய்வு வடிவமைப்பை விரிவுபடுத்தினர். சுண்டெலிகள், எலிகள், கினிப் பன்றிகளின் மூளை மைட்டோகாண்ட்ரியா Percoll மூலம் தனிமைப்படுத்தப்பட்டு, அதே 0.1 mg per ml செறிவில் சோதிக்கப்பட்டது; பைருவேட் மற்றும் மாலேட் அல்லது குளூட்டமேட் மற்றும் மாலேட் தலா 5 mM பயன்படுத்தப்பட்டன. அவர்கள் இரண்டு காம்ப்ளெக்ஸ் III தடுப்பான்களைப் பயன்படுத்தினர்: ஆன்டிமைசின் A 0.3 micromolar மற்றும் மைக்சோதையசோல் 1 micromolar. பெரும்பாலான சோதனைகளில் சாயம் 2 micromolar ஆகவும், சைட்டோக்ரோம் c சோதனைகளில் 0.5 ஆகவும் இருந்தது. ஒரே மாதிரியான நெறிமுறைகளுடன் சோதிக்கப்பட்ட மூன்று இனங்களின் விவரங்களும் திறந்த அணுகல் ஆய்வுக் கட்டுரையில் உள்ளன.

மூன்று இனங்களிலும் இரண்டு தடைகளும் ஓரளவு தவிர்க்கப்பட்டன. சுண்டெலி மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் ஆன்டிமைசின் சுவாசத்தை ஒடுக்கியது; சாயம் அதைச் சுமார் 60 சதவீதம், அதாவது ஏறத்தாழ 37-இலிருந்து 59 nmol per minute per mg ஆக உயர்த்தியது. மைக்சோதையசோல் அதை 88 சதவீதம் ஒடுக்கி சுமார் 4.5 ஆகக் குறைத்தது; சாயம் அதை ஐந்து மடங்காக, சுமார் 23 வரை உயர்த்தியது. எந்தத் தடுப்பானைப் பயன்படுத்தியபோதும் சவ்வு மின்னழுத்தம் ஓரளவு மீண்டது; ஒளியியல் அளவீட்டுப் பிழைகளை விலக்க, இரண்டு சாயங்களைக் கொண்டு (சாஃப்ரனின் O மற்றும் விகித அடிப்படையிலான TMRM) இது அளவிடப்பட்டது.

முதல் ஆய்வு செய்யாத ஒன்றையும் இந்தக் கட்டுரை செய்தது: எலக்ட்ரான் பரிமாற்றத்தை நேரடியாகச் சோதித்தது. வெளியிலிருந்து சேர்க்கப்பட்ட அசிட்டிலேற்றப்பட்ட சைட்டோக்ரோம் c, 25 micromolar செறிவில், தடுப்பான்கள் இருந்தாலும் இல்லாவிட்டாலும் ஆற்றலூட்டப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாவால் ஒடுக்கப்படவில்லை; ஆனால் சாயத்தைச் சேர்த்ததும் இரண்டு நிலைகளிலும் ஒடுக்கம் நிகழ்ந்தது. செல் இல்லாத தாங்கல் கரைசலில், NADH மற்றும் சாயம் சேர்ந்து சைட்டோக்ரோம் c-ஐ NADH-க்கு விகிதாசாரமான வீதத்தில் ஒடுக்கின. இந்த நீண்ட தாவலை வார்த்தைகளில் சொன்னால்: ஒடுக்கும் திறன் கொண்ட எலக்ட்ரான் சமமதிப்புகள் சாயத்துக்கு, சாயத்திலிருந்து நேரடியாக சைட்டோக்ரோம் c-க்கு, பின்னர் காம்ப்ளெக்ஸ் IV வழியாக ஆக்சிஜனுக்கு. அந்தப் பாதை காம்ப்ளெக்ஸ் III-ஐ முழுவதுமாகத் தவிர்க்கிறது; எனவே இரண்டு தடுப்பான்களின் தடைகளையும் தவிர்க்க முடியும்.

கூடுதலான இரண்டு அளவீடுகள் இந்த விளக்கத்தை ஆதரிக்கின்றன. மைக்சோதையசோல் சேர்க்கப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் சாயம் சேர்க்கப்பட்டபோது NAD(P)H ஒளிர்வு குறைந்தது; இது ஒடுக்கும் திறன் கொண்ட எலக்ட்ரான் சமமதிப்புகள் புதிய பாதையின் வழியாக வெளியேறியதைக் குறிக்கிறது. மேலும், 660 nm-இல் சாயத்தின் ஒளி உறிஞ்சல் ஒவ்வொரு சேர்ப்பின் விளைவையும் வரிசையாகக் காட்டியது; மையவிலக்குச் சுழற்சிக்குப் பின் கிடைத்த மேல்நிலைக் கரைசல்கள், ஆக்சிஜனேற்றப்பட்ட சாயம் ஆற்றலூட்டப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாவுக்குள் நூறு மடங்குக்கும் அதிகமாகச் செறிவடைந்ததையும், மின்னழுத்தம் சரிந்தபோது வெளியேறியதையும் காட்டின. புரோட்டான் கணக்கும் இதற்குப் பொருந்துகிறது: புரோட்டான்களை உந்தும் படிகளைத் தவிர்ப்பதால், ஒவ்வொரு எலக்ட்ரான் ஜோடிக்கும் 10 புரோட்டான்களுக்குப் பதிலாக ஏறத்தாழ 2 புரோட்டான்களே கிடைக்கின்றன. எனவே ஆக்சிஜன் பயன்பாடு வேகமடைந்தாலும் மின்னழுத்தம் ஓரளவு மட்டுமே மீள்வது, உண்மையான தவிர்த்துச் செல்லுதலின் எதிர்பார்க்கப்படும் தோற்றமே; அதற்கு எதிரான ஆதாரம் அல்ல.

இதே தயாரிப்பில் கிடைத்த விளைவுகள் மேலோட்டமான வாசிப்பைத் தவறாக வழிநடத்தும். தடுப்பானும் சாயமும் இருந்தபோது, ADP சுவாசத்தை உயர்த்துவதற்குப் பதிலாகக் குறைத்தது; கடத்தலைத் தடுப்பது அதை மெதுவாக்குவதற்குப் பதிலாகத் தூண்டியது. அதே நேரத்தில் சவ்வு மின்னழுத்தம் வழக்கமான திசைகளிலேயே மாறியது. இந்த அமைப்பில் ஆக்சிஜன் நுகர்வை மட்டும் பார்ப்பது தவறாக வழிநடத்துகிறது.

மூன்றாவது ஆய்வு: காம்ப்ளெக்ஸ் III அல்ல, காம்ப்ளெக்ஸ் I மற்றும் II-ஐச் சோதித்த கல்லீரல் ஆய்வு

Lee மற்றும் Boelsterli, எஃபாவிரென்ஸ் (காம்ப்ளெக்ஸ் I, IC50 சுமார் 30 micromolar) மற்றும் ஐசோனியாசிடின் வளர்சிதை மாற்றப் பொருளான ஹைட்ரசின் (காம்ப்ளெக்ஸ் II, IC50 சுமார் 30 micromolar) ஆகியவற்றால் பாதிக்கப்பட்ட சுண்டெலி கல்லீரல் மைட்டோகாண்ட்ரியாவையும், வளர்ப்பில் உள்ள கல்லீரல் செல்களையும் பயன்படுத்தினர். சுமார் 30 micromolar சாயம், NADH ஆக்சிஜனேற்றம், சவ்வு மின்னழுத்தம், ATP ஆகியவற்றை மீட்டதுடன் ஆக்சிஜனேற்றிகளையும் நெக்ரோசிஸ் வகை செல் இறப்பையும் குறைத்தது. பாதிக்கப்பட்ட காம்ப்ளெக்ஸ் I மற்றும் II-ஐச் சுற்றி சாயம் எலக்ட்ரான்களைக் கொண்டு செல்வதாக Redox Biology ஆய்வுக் கட்டுரை இதை மாதிரியாக விளக்குகிறது.

இந்த முடிவு, சங்கிலியின் முந்தைய பகுதிகள் குறித்த உறுதிப்படுத்தப்பட்ட பின்னணியாகும். இதில் காம்ப்ளெக்ஸ் III-இல் எதுவும் தடுக்கப்படாததால், அதைப் பற்றி இந்த முடிவு எதுவும் கூறவில்லை. மூளை சார்ந்த இரண்டு ஆய்வுகளில் எதையும் இது உறுதிப்படுத்தவோ மறுக்கவோ முடியாது.

நிபந்தனைகளின் ஒப்பீட்டு அட்டவணை

இரண்டு காம்ப்ளெக்ஸ் III ஆய்வுகளும் தத்தமது அமைப்பைப் பொறுத்தவரை சரியாக இருக்கக்கூடிய நான்கு காரணங்கள்

1. தடுப்பான் தலையீடு ஒரே மாதிரியாக இல்லை. ஒரு பக்கத்தில் ஆன்டிமைசின் மட்டும் 1 microgram per ml; மற்றொரு பக்கத்தில் ஆன்டிமைசின் 0.3 micromolar உடன் தனியான Qo இடத் தடுப்பான். Qo இடத்துக்கு எலக்ட்ரான்களைச் செலுத்தும் சாயப் பாதை தோல்வியடையும் அதே இடத்தில், சைட்டோக்ரோம் c-க்கு நேரடியாகச் செல்லும் பாதை வெற்றிபெறுகிறது. ஓர் இடத்தைச் சோதிப்பது இரண்டையும் சோதிப்பதற்கு மாற்றாகாது.

2. சாய அளவும் கால அளவும் வேறுபட்டன. முதன்மைச் செறிவுகள் 1 மற்றும் 2 micromolar. இது ஆக்சிஜனேற்ற-ஒடுக்கச் சுழற்சியில் ஈடுபடும் ஒரு பொருள்; அதன் உட்புகுதலும் சைட்டோக்ரோம் c-ஐ நேரடியாக ஒடுக்குவதும் செறிவையும் நேரத்தையும் சார்ந்தவை. அளவில் சிறிய இடைவெளிகளுடன் அளவீட்டு நேரமும் மாறும்போது, ஒரே வலையமைப்பின் வெவ்வேறு பாதைப் பகுதிகள் வெளிப்படலாம்.

3. தயாரிப்புகள் வேறுபட்டன. டிஜிட்டோனின் தனிமைப்படுத்தலும் Percoll படிநிலைத் தனிமைப்படுத்தலும் ஓரளவு ஒன்றுடன் ஒன்று ஒத்திருந்தாலும் முற்றிலும் ஒரே மாதிரியானவை அல்லாத மைட்டோகாண்ட்ரியா தொகுதிகளைத் தேர்ந்தெடுக்கின்றன. புரதச் செறிவு 0.1 mg per ml எனப் பொருந்தியதால் அந்த மாறி வேறுபாட்டிற்கான காரணமாகாது; ஆனால் துணைத்தொகுதியும் கட்டமைப்பு முழுமையும் அப்படியல்ல. இன வேறுபாடு என்ற சந்தேகமும் நீங்கியது: இரண்டாவது குழு சுண்டெலியிலும் அதே வெளிப்படையான விளைவை மீண்டும் பெற்றது.

4. வினைமூலப்பொருள் நிலை, சாயத்தால் என்ன செய்ய முடியும் என்பதை நிர்ணயிக்கிறது. ஒரு பக்கத்தில் மூன்று வினைமூலப்பொருள் அமைப்புகள்; மறுபக்கத்தில் NADH சார்ந்த ஜோடிகள். NADH கிடைப்பும் சவ்வு மின்னழுத்தமும் சேர்ந்து, சாயம் எவ்வளவு வேகமாக ஒடுக்கப்படுகிறது, எங்கே பகிர்ந்தளிக்கப்படுகிறது என்பதை நிர்ணயிக்கின்றன. ஆக்சிஜனேற்றப்பட்ட சைட்டோக்ரோம் c-க்கு அருகில் ஒடுக்கப்பட்ட சாயம் தேவைப்படும் பாதை, அந்தத் தேர்வைச் சார்ந்திருக்கிறது.

அடுத்த தவிர்த்துச் செல்லுதல் கூற்றை எப்படிப் படிப்பது

எந்தக் காம்ப்ளெக்ஸ், எந்தத் தடுப்பானால், எந்த இடத்தில், எந்த அளவில் தடுக்கப்பட்டது என்று கேளுங்கள். சாயச் செறிவும் அளவீடு எடுக்கப்பட்ட நேரமும் என்ன என்று கேளுங்கள். திசு, இனம், தனிமைப்படுத்தல் முறை, புரதச் செறிவு, வினைமூலப்பொருள் ஆகியவற்றைக் கேளுங்கள். மேலும் மின்னழுத்தம், சுவாசம், ஆக்சிஜனேற்ற-ஒடுக்க நிலை, நேரடி எலக்ட்ரான் பரிமாற்றச் சோதனை ஆகியவை ஒன்றுக்கொன்று பொருந்துகின்றனவா என்று கேளுங்கள்; ஏனெனில் இங்கு ஆக்சிஜன் நுகர்வு மட்டும் ஒன்றுக்கும் மேற்பட்ட முறை தவறான திசையைக் காட்டியது.

வரையறுக்கப்பட்ட சுருக்கம் இதுதான். காம்ப்ளெக்ஸ் I-ஐச் சாயம் தவிர்த்துச் செல்வதில் உடன்பாடு உள்ளது. காம்ப்ளெக்ஸ் III-ஐப் பொறுத்தவரை, ஆன்டிமைசின் 1 microgram per ml மற்றும் சாயம் 1 micromolar கொண்ட சுண்டெலி மைட்டோகாண்ட்ரியா செயல்பாட்டு ரீதியான தவிர்த்துச் செல்லுதலைக் காட்டவில்லை. ஆனால் ஆன்டிமைசின் 0.3 micromolar அல்லது மைக்சோதையசோல் 1 micromolar மற்றும் சாயம் 2 micromolar கொண்ட மூன்று இனங்கள், சாயத்திலிருந்து சைட்டோக்ரோம் c-க்கு நேரடி எலக்ட்ரான் பரிமாற்றத்துடன் ஓரளவு தவிர்த்துச் செல்லுதலைக் காட்டுகின்றன. இந்த வாக்கியங்கள் ஒன்றுக்கொன்று முரண்படாமல் இணைந்து இருக்க முடியும். இதைவிட விரிவான எந்தக் கூற்றும் சோதிக்கப்பட்ட வரம்பைத் தாண்டிய ஊகமே.

தொடர்புடைய வாசிப்புகள், விவாதத்துக்குரிய கூற்றை விவாதமற்ற வேதியியலின் எல்லைக்குள் வைத்திருக்க உதவுகின்றன: எலக்ட்ரான் தொடர் பரிமாற்றத்துக்கு மெத்திலீன் ப்ளூ எலக்ட்ரான்களை எவ்வாறு நகர்த்துகிறது, சங்கிலியின் முந்தைய பகுதியில் உறுதிப்படுத்தப்பட்ட நிகழ்வுக்கு காம்ப்ளெக்ஸ் I-ஐத் தவிர்த்துச் செல்லும் பரிசோதனைகள், இரண்டு சாயங்கள் ஏன் தேவைப்பட்டன என்பதற்கு சவ்வு மின்னழுத்த அளவீடுகளும் அவற்றின் செயற்கைப் பிழைகளும், மேலும் சாய அளவு மற்றும் நேரம் சார்ந்த சிக்கல்களுக்கு ஆக்சிஜனேற்ற-ஒடுக்கச் சுழற்சிப் பொருட்களின் ஆய்வகக் கையாளுதல்.