Kupima spishi tendaji za oksijeni katika majaribio ya bluu ya methilini

Maabara mbili zinafanya kile ambacho kila moja hukiita jaribio la bluu ya methilini la kuzuia uoksidishaji. Moja inaripoti kwamba rangi hiyo hupunguza spishi tendaji za oksijeni. Nyingine inaripoti kwamba huzizalisha. Zote zinaonyesha mikunjo iliyo wazi ya mwitikio kulingana na dozi. Zote ni za dhati. Tofauti hiyo haitokani na udanganyifu au kutokuwa na uwezo. Inatokana na makundi hayo mawili kupima vitu tofauti chini ya mwangaza tofauti, kwa viashiria vinavyojibu maswali tofauti, kisha kueleza majibu yote mawili kwa neno lilelile: ROS.

Bluu ya methilini ni molekuli ambayo ni vigumu kuipima kwa usahihi kwa sababu hushiriki katika kemia ambayo inapaswa kuchunguzwa. Gizani, husafirisha elektroni kati ya vitoa na vipokea elektroni na kurudi katika umbo lake la awali, ikiwa tayari kurudia mzunguko. Chini ya mwangaza, huwa kihamasishaji cha athari za mwanga, ikifikia hali ya msisimko ya tripleti ambayo huiwezesha kuhamishia oksijeni nishati ili kutengeneza oksijeni singleti au kuhamisha elektroni ili kutengeneza radikali na peroksidi ya hidrojeni. Kiashiria chochote kinachowekwa katika mfumo huo kinaweza kuoksidishwa, kuredukishwa, kupauka, au ishara yake ya macho kufichwa na rangi yenyewe. Kwa hiyo swali la kwanza kuhusu matokeo yoyote ya ROS si kamwe thamani ya namba. Ni kile ambacho kipimo hutambua hasa, na jinsi rangi inavyoathiri kipimo hicho.

Amplex Red: kipimo kilichokalibishwa cha peroksidi ya hidrojeni

Mchanganyiko wa bluu ya methilini na Amplex Red ndio unaoweza kutetewa zaidi katika maandiko haya ya kisayansi, unapowekwa kwa usahihi. Kemia yake ni mahususi: peroksidesi ya horseradish hutumia peroksidi ya hidrojeni kuoksidisha substrati ya Amplex na kuunda bidhaa inayotoa floresensi, resorufin, kwa uwiano wa stoikiometria wa takriban moja kwa moja. Peroksidi kutoka kwenye sampuli huwa floresensi kwenye kitambuzi. Hakuna kitu kingine katika kundi la kawaida la ROS kinachoendesha mmenyuko huo moja kwa moja.

Faida muhimu zaidi ni kalibresheni. Mtafiti makini hupima viwango rejea vya peroksidi vinavyojulikana katika myeyusho uleule wa kudhibiti pH, kwa mikusanyiko ileile ya peroksidesi na substrati, muda uleule wa kuachwa ili kumenyuka, na mipangilio ileile ya mfumo wa macho, kisha hulinganisha matokeo ya sampuli na mkunjo huo. Katika utafiti wa mitokondria zilizotengwa kutoka kwenye ubongo ambao ndio msingi wa mbinu hii, waandishi walifanya hivyo hasa, wakiongeza kiasi kinachojulikana cha peroksidi mwishoni mwa kila jaribio, na namba zinaripotiwa kama viwango katika pikomoli kwa dakika kwa miligramu ya protini badala ya vipimo holela vya floresensi. Hilo ndilo linalogeuza mwanga kuwa kipimo.

Mambo matatu kutoka kwenye utafiti huo yanastahili kuigwa. Kwanza, waandishi walihakiki ishara kwa katalasi, ambayo huvunja peroksidi. Ongezeko la floresensi lililosababishwa na bluu ya methilini lilikoma katalasi ilipoongezwa, likithibitisha kwamba ishara ilitokana na peroksidi badala ya athari potofu ya mfumo wa macho. Pili, walijaribu athari ya mwangaza moja kwa moja kwa kufunga boriti ya mwanga wa kusisimua ili sampuli zipokee sehemu moja ya nane ya kiasi cha kawaida cha mwanga, na ishara ilipungua kwa asilimia tisa tu. Zaidi ya asilimia tisini ya peroksidi waliyoiaripoti haikutegemea mwanga wa upimaji. Tatu, walipima uondoaji wa peroksidi kando kwa kutumia elektrodi na kugundua kwamba rangi iliongeza uzalishaji na pia kupunguza kasi ya uondoaji. Kiashiria kinachoripoti tu floresensi halisi baada ya athari zote kingechanganya athari hizo mbili.

Kipimo hicho bado kina njia zinazoweza kukifanya kishindwe, na bluu ya methilini huleta kadhaa kati yake. Rangi hiyo hufyonza mwanga katika sehemu pana ya eneo lilelile jekundu ambamo resorufin hutoa mwanga, kwa hiyo katika mikusanyiko mikubwa ya rangi sampuli inaweza kuficha ishara yake yenyewe kupitia athari za kichujio cha ndani. Kwa hiyo viwango rejea vinapaswa kuwa na mkusanyiko uleule wa rangi kama sampuli. Amplex Red pia inaweza kuoksidishwa na mwanga yenyewe, na bidhaa yake resorufin inaweza kuingia katika mizunguko ya redoksi inayochochewa na mwanga na kuzalisha superoksidi na peroksidi, jambo lenye umuhimu mkubwa wakati jaribio pia linaangazia kihamasishaji cha athari za mwanga. Suluhisho la vitendo ni kuangazia sampuli za bluu ya methilini kwanza na kupima sehemu zake kwa vitendanishi vya Amplex gizani, badala ya kuangazia rangi na kiashiria pamoja. Mwisho, dismutasi ya superoksidi haipunguzi tu ishara ya Amplex: kugeuza superoksidi kuwa peroksidi kunaweza kuiongeza. Kidhibiti cha SOD kinachoongeza floresensi hakijashindwa. Kimetambua superoksidi kama spishi inayotangulia katika mnyororo wa mmenyuko.

DCFDA: kiashiria kisicho mahususi cha uoksidishaji

Mchanganyiko wa bluu ya methilini na DCFDA ndio chanzo cha mkanganyiko mwingi. DCFH-DA ni kiambata tangulizi kinachoingizwa kwenye seli. Esterasi ndani ya seli huondoa vikundi vyake vya asetati na kuacha DCFH isiyotoa floresensi, na uoksidishaji wa DCFH hutoa DCF yenye floresensi. Orodha ya vitu vinavyoioksidisha ni ndefu: radikali za hidroksili, viambata vya kati vya peroksidesi na hemu, dioksidi ya nitrojeni, asidi hipoklorasi, na radikali zinazotokana na peroksinitriti. Peroksidi ya hidrojeni pekee haiioksidishi moja kwa moja kwa kasi yoyote yenye manufaa; floresensi inayotegemea peroksidi kwa kawaida huhitaji chuma, protini za hemu, au kemia ya peroksidesi katika mchakato.

Uhakiki ambao kila sehemu ya mbinu inapaswa kuunukuu unatokana na uchanganuzi wa DCFH kama kiashiria uliofanywa na Kalyanaraman na wenzake, kama ulivyofupishwa katika utafiti wa mitokondria za ubongo uliokataa DCFDA kwa sababu hii. Walionyesha kwamba rangi hiyo humenyuka polepole, kwa stoikiometria isiyobainishwa, bila kalibresheni halali, na pia na misombo isiyo ROS. Kiashiria pia hukuza kile kinachopima: uoksidishaji wa DCFH kwa kuondoa elektroni moja huzalisha radikali ya DCF ambayo humenyuka na oksijeni kutengeneza superoksidi, ambayo hupitia dismutesheni na kutoa peroksidi ya ziada. Kipimo chenyewe huzalisha sehemu ya kemia kinayoiripoti.

Hakuna kati ya hayo kinachofanya DCFDA isiwe na manufaa. Kinaifanya kuwa kipimo cha uchunguzi wa awali, si cha utambuzi. Ongezeko la floresensi ya DCF humaanisha kwamba uoksidishaji wa kiashiria unaotegemea vioksidishaji umeongezeka. Halimaanishi kwamba peroksidi imeongezeka, na kwa hakika halimaanishi kwamba jumla ya ROS imeongezeka, kiasi ambacho hakuna kiashiria kimoja kinachoweza kukipima. Tafiti za awali za bluu ya methilini zilizotegemea uoksidishaji wa DCF kwenye mikusanyiko inayozidi mikromola moja ziliripoti athari zinazochochea uoksidishaji, ilhali mifumo mingine katika kipindi hicho hicho iliripoti kinga dhidi ya kifo cha seli kilichosababishwa na peroksidi. Uchunguzi wote wawili unaweza kuwa sahihi kuhusu rangi ileile katika mazingira tofauti ya redoksi, na matokeo ya DCF pekee hayawezi kusema ni kioksidishaji gani kilichobeba ishara. Umuhimu wa utafiti wa awali wa mitokondria za ubongo ni kwamba ulibadilisha uchunguzi huu wa awali na kipimo kilichokalibishwa cha peroksidi na kubaini mzigo huo moja kwa moja: hata rangi yenye mkusanyiko wa nanomola mia moja iliongeza utoaji wa peroksidi mara kadhaa kwa kila substrati na hali ya upumuaji iliyojaribiwa.

DCFDA ina mtego mwingine mahususi kwa bluu ya methilini. Rangi hiyo ina rangi kali na hushiriki katika redoksi, kwa hiyo inaweza kufifisha floresensi, kuzima utoaji wa mwanga, au kuoksidisha viambata vya kiashiria bila kutegemea ROS za seli. Kidhibiti kisicho na seli, chenye rangi pamoja na kiashiria lakini bila seli, si nyongeza ya hiari. Ni jaribio linalokuambia kama rangi inaingiliana na kiashiria.

Kunasa radikali na matumizi ya oksijeni: utambulisho na kasi ya mchakato

Viashiria vya floresensi huripoti kwamba kitu kinachoweza kuoksidishwa kimejitokeza, lakini rezonansi ya spini ya elektroni pamoja na vinasa radikali huripoti jambo lililo karibu zaidi na utambulisho wake. Utafiti wa msingi wa fotokemia ya bluu ya methilini ulitumia ESR kutambua radikali ya askorbati kutoka kwenye rangi, askorbati na mwanga, kisha ukaonyesha uundaji wa peroksidi katika majaribio ya matumizi ya oksijeni na uundaji wa radikali ya hidroksili uliokatalizwa na chuma katika majaribio ya kunasa radikali. Kila mbinu ilijibu swali ambalo nyingine hazikuweza kujibu: ESR ilitoa utambulisho wa radikali, matumizi ya oksijeni yalitoa kasi ya mmenyuko bila kutegemea kiashiria chochote cha floresensi, na mchanganyiko huo ulionyesha njia za oksijeni singleti na radikali zikifanya kazi katika mfumo uleule ulioangaziwa.

Matokeo hayo ya 1984 bado yanasomeka kama lebo ya tahadhari. Kukiwapo mwangaza na kiredukishaji, rangi ilizalisha peroksidi, na chuma kilipokuwapo mfumo ulizalisha radikali ya hidroksili, spishi tendaji zaidi katika kundi hilo. Waandishi walihusisha hili na askorbati iliyoko kwenye jicho na kutilia shaka matumizi ya macho bila tahadhari. Wasomaji wa sasa wanapaswa kuzingatia hali zilizokuwapo: mwanga pamoja na kiredukishaji pamoja na chuma. Ondoa chochote kati ya hivyo na njia hiyo hudhoofika au kutoweka.

Elektrodi za oksijeni zina umuhimu kwa sababu tofauti. Elektrodi ya aina ya Clark hupima matumizi halisi ya oksijeni, jambo linalothibitisha kwamba kemia ya redoksi inayoendeshwa na rangi inatumia oksijeni ya molekuli na kutoa taarifa za kasi ya mmenyuko ambazo athari potofu ya floresensi haiwezi kuiga. Haitambui bidhaa. Uundaji wa peroksidi, superoksidi na maji, pamoja na kupotea kwa hali ya oksijeni singleti, vyote hutumia oksijeni. Kasi ya mchakato bila utambulisho haijakamilika, kama ilivyo kwa utambulisho bila kasi ya mchakato, ndiyo maana tafiti thabiti huunganisha elektrodi na kipimo kilichokalibishwa cha peroksidi au kinasa radikali.

Kwa nini matokeo kuhusu kuzuia uoksidishaji hukinzana

Weka vipimo hivyo vitatu kando kwa kando na mikinzano inayoonekana katika maandiko kuhusu bluu ya methilini inaelezeka kwa tofauti za mbinu pamoja na ukweli wa kibayolojia wa aina tatu.

Kwanza, rangi ni kisafirishaji cha elektroni na pia chanzo cha peroksidi. Kwa kuelekeza elektroni mbali na maeneo ya upumuaji ambako oksijeni ingegeuka kuwa superoksidi, inaweza kupunguza ROS moja huku umbo lake lililoredukishwa likiredukisha oksijeni moja kwa moja kuwa peroksidi, na kuongeza nyingine. Kwa hiyo maabara inayoshughulikia kemia ya redoksi ya mitokondria na jukumu lake la kutoa njia mbadala inapaswa kutarajia majibu yanayotegemea kiashiria: matokeo ya kipimo kinachotambua superoksidi hupungua huku matokeo ya kipimo cha peroksidi yakiongezeka katika kiveti kilekile.

Pili, peroksidi katika dozi ndogo ni ishara, si uharibifu tu. Utafiti wa mitokondria za ubongo wa panya uliofuata kazi ya awali uligundua uzalishaji wa peroksidi kutoka kwenye rangi yenye mkusanyiko mdogo wa nanomola hamsini bila uharibifu wa DNA ya mitokondria katika viwango vya tiba, pamoja na kinga dhidi ya uharibifu uliosababishwa na rotenone baada ya matibabu ya awali. Ni katika mikromola mia moja tu, kiwango kilicho juu sana ya wigo wa tiba, ambapo rangi iliharibu vipande teule vya DNA, na mwanga mwekundu pamoja na rangi yenye mkusanyiko wa mikromola ishirini vilizalisha oksijeni singleti iliyoharibu vipande vyote vilivyojaribiwa. Utaratibu unaopendekezwa ni wa hormesisi: uzalishaji mdogo wa peroksidi huchochea mifumo ya kinga dhidi ya uoksidishaji inayohusishwa na Nrf2 na uundaji wa mitokondria, kwa hiyo matokeo ya muda mfupi yanayoonyesha kuchochewa kwa uoksidishaji hutangulia matokeo ya muda mrefu ya kuzuia uoksidishaji. Kipimo kinachosomwa baada ya saa moja na kipimo kinachosomwa baada ya siku moja vinaweza kutofautiana kwa sababu hali ya kibayolojia ilibadilika kati ya vipindi hivyo.

Tatu, mwanga huamua hata ni molekuli gani iliyopo. Mwangaza huondoa vikundi vya methili kwenye rangi na kuibadilisha kuelekea Azure B na bidhaa zinazohusiana nayo, na taa ya hadubini juu ya sahani ya maabara inatosha kuiwezesha kuhamasisha athari za mwanga. Majaribio ya gizani na yaliyoangaziwa ni majaribio tofauti, na sehemu ya vidhibiti vya mwangaza na ushughulikiaji wa rangi katika itifaki yoyote inapaswa kuyachukulia hivyo.

Seti ya chini kabisa ya vidhibiti, na jinsi ya kutathmini dai lolote

Ulinganisho ulio hapa chini ndio nyenzo asilia ya marejeo ya makala hii. Kabla ya kukubali matokeo yoyote ya ROS kuhusu bluu ya methilini, angalia ni safu ipi waandishi waliitimiza na ni ipi waliiruka.

Kanuni ya vitendo ya kusoma matokeo inafuata. Amplex pamoja na peroksidesi, ikiwa imekalibishwa na kuhakikiwa kwa katalasi, ni ushahidi kuhusu peroksidi. DCFDA ni ushahidi kuhusu uoksidishaji usio mahususi wa kiashiria na si zaidi ya hapo. Kunasa radikali pamoja na vidhibiti vya viondoa radikali ni ushahidi kuhusu utambulisho wa radikali. Matumizi ya oksijeni ni ushahidi kuhusu kasi ya mchakato. Sentensi inayodai zaidi ya kile ambacho kipimo chake kinaweza kuthibitisha, hata ikiandikwa kwa uhakika mkubwa kiasi gani, ni sentensi kuhusu kiashiria, si kuhusu rangi. Mijadala inayohusiana kuhusu utegemezi wa dozi na wigo wa hormesisi, mtiririko wa elektroni katika mitokondria, kuingiliwa kwa vipimo katika sampuli zilizotiwa rangi, na athari potofu za mwangaza wa hadubini hupanua kila hoja hizi, na kila moja hubaki halali baada ya rejeo lake la muda kubadilishwa.