Kupima athari za bluu ya methilini kwenye mitokondria: oksijeni, ATP, na potenshali ya utando

Tuseme maabara inaongeza bluu ya methilini kwenye mitokondria yenye upumuaji ulioathirika na kuona matumizi ya oksijeni yakiongezeka. Sentensi inayokuja akilini ni kwamba rangi imerejesha utendaji wa mitokondria. Sentensi hiyo inaweza kuwa si sahihi. Kiwango cha mtiririko wa oksijeni, usanisi wa ATP, na potenshali ya utando ni dhana tatu tofauti. Zinahusiana na organeli ileile kama vile kuhifadhi nakala rudufu, kusawazisha, na kushiriki faili kunavyohusiana na folda ileile ya wingu: zina uhusiano, lakini zinaongozwa na kanuni tofauti. Ukichanganya moja na nyingine, tafsiri ya matokeo inashindwa, hata kama kila kipimo ni sahihi kitaalamu.

Bluu ya methilini huongeza uwezekano wa mkanganyiko huu kwa sababu inashiriki katika mfumo unaopimwa. Ni kiwanja kinachozunguka kati ya hali za redoksi, kikikubali elektroni katika hatua za awali na kuzitoa katika hatua za baadaye; ni kat ayoni inayopendelea mazingira ya mafuta na kujikusanya katika mitokondria yenye nishati; na ni kiwanja chenye rangi ya bluu iliyokolea kinachofyonza na kutoa mwanga katika mikanda ileile ya vihisi vinavyotumika kwa kawaida. Usomaji mmoja wa kipimo hauwezi kutoa taarifa zote hizo. Utaratibu unaotegemeka, ulioonyeshwa katika tafiti za mitokondria za Budapest, ni kupima kiwango cha mtiririko wa oksijeni pamoja na kasi ya usanisi wa ATP, potenshali ya utando, na utolewaji wa peroksidi ya hidrojeni, kwa kutumia vidhibiti maalumu kwa rangi katika kila hatua.

Respirometria hupima mtiririko wa oksijeni, si uzalishaji wa nishati

Respirometria yenye uwezo wa kutofautisha mabadiliko madogo, iwe kwa Oroboros Oxygraph au kichanganuzi cha mtiririko wa nje ya seli cha Seahorse, huripoti jambo moja: kasi ambayo oksijeni inapokea elektroni. Hairipoti idadi ya protoni zilizopampwa kwa kila elektroni, kiasi cha tofauti ya kielektrokemikali kilichohifadhiwa, au kama kimeng'enya cha ATP synthase kiliitumia.

Istilahi ni muhimu. Katika mitokondria iliyotengwa, substrati bila ADP huonyesha upumuaji unaohusiana na uvujaji, substrati yenye ADP ya kutosha kufikia usaturishaji huonyesha uwezo wa fosforilesheni ya kioksidishaji, na kuongeza hatua kwa hatua kiwanja kinachotenganisha upumuaji na usanisi wa ATP huonyesha uwezo wa juu kabisa wa uhamishaji wa elektroni. Katika seli kamili, vipimo sawia vya Seahorse ni upumuaji wa msingi, upumuaji unaohusishwa na ATP na unaoathiriwa na oligomycin, uvujaji wa protoni, upumuaji wa juu kabisa unaobainishwa kwa FCCP, na matumizi ya oksijeni yasiyotokana na mitokondria ambayo yanaendelea licha ya rotenone pamoja na antimycin. Kuita matokeo ya Seahorse State 3 na State 4 kunayapa kiwango cha usahihi ambacho maandalizi hayo hayawezi kuunga mkono, kama mfumo wa Agilent Mito Stress Test unavyoeleza wazi.

Bluu ya methilini huvunja uhusiano unaoonekana kuwa wa kawaida kati ya oksijeni nyingi zaidi na nishati nyingi zaidi. Katika mitokondria iliyotengwa kutoka kwenye ubongo wa nguruwe wa Guinea, rangi ya 100 nM hadi 1 uM iliongeza matumizi ya oksijeni wakati wa mapumziko kwa substrati za glutamate pamoja na malate, succinate, na alpha-glycerophosphate, huku ongezeko likiwa takriban asilimia 64 kwa alpha-glycerophosphate. Hata hivyo, upumuaji uliochochewa na ADP katika mitokondria yenye afya haukubadilika kwa kiasi cha maana, kulingana na utafiti wa mitokondria ya ubongo iliyotengwa. Kwa sababu upumuaji unaohusiana na uvujaji uliongezeka huku mtiririko uliochochewa na ADP ukibaki bila kubadilika, uwiano wa udhibiti wa upumuaji unaokokotolewa hushuka. Kushuka huko hakumaanishi kwamba rangi iliharibu mitokondria. Kunamaanisha kwamba rangi iliongeza mzunguko wa redoksi unaotumia oksijeni juu ya upumuaji wa kawaida. Kipimo cha matumizi ya oksijeni kwa bluu ya methilini kinachoripoti ongezeko hilo pekee kimepima kemia halisi lakini hakijasema chochote kuhusu uhifadhi wa nishati.

Majaribio ya kurejesha utendaji yanaonyesha pengo hilohilo kwa kiwango kikubwa zaidi. Kompleksi I ilipozuiwa, mtiririko wa oksijeni uliongezeka tena kwa takriban mara tatu, huku usanisi wa ATP ukiongezeka tena kwa takriban mara 1.5 pekee. Oksijeni nyingi zaidi ilifikia elektrodi. Sehemu ndogo zaidi yake ilitumika kuzalisha ATP. Dai lolote la kuboreka kwa fosforilesheni ya kioksidishaji linahitaji pia taarifa za ATP, ikiwezekana zikielezwa kama uwiano wa ATP kwa oksijeni, huku utaratibu wa kufafanua kiasi cha oksijeni katika kigawanyo ukiwekwa wazi.

Vipimo vya ATP hupima kasi ya usanisi, ambayo kiasi kilichopo hakiwezi kuchukua nafasi yake

Kipimo cha ATP hujibu swali tofauti: kiasi gani cha ATP huzalishwa kwa kila kipindi cha muda. Usomaji wa kasi ya mmenyuko, iwe mwangaza wa lusiferasi ya kimulimuli unaofuatiliwa kwa dakika kadhaa au kipimo kinachounganisha hexokinase na glucose-6-phosphate dehydrogenase kinachosomwa katika 340 nm, hutoa kasi. Kipimo kimoja cha jumla ya ATP katika hatua ya mwisho hutoa kiasi kilichopo, ambacho huakisi usanisi ukitoa matumizi na, peke yake, hutoa taarifa chache kuhusu fosforilesheni ya kioksidishaji.

Kikundi cha Budapest kilitumia mbinu ya vimeng'enya vilivyounganishwa huku adenylate kinase ikizuiwa, na kikagundua kwamba bluu ya methilini ya 1 hadi 2 uM iliongeza uzalishaji wa ATP kwa kiasi kidogo lakini chenye umuhimu wa kitakwimu katika mitokondria iliyotibiwa kwa rotenone na antimycin. Huo ni urejeshaji halisi wa utendaji, lakini ni wa sehemu tu. Utafiti wa sumu ya TEGDMA ulifikia jibu lenye muundo huohuo katika modeli tofauti: monoma ya meno TEGDMA ya 5 mM ilishusha upumuaji unaohusishwa na Kompleksi I kutoka takriban vipimo 286 hadi 28 vya mtiririko, na rangi ya 2 uM iliurejesha hadi takriban 86.

Vidhibiti viwili ni vya lazima kwa kiwanja cha redoksi chenye rangi. Kwanza, tumia oligomycin ili kubaini kiasi cha usanisi wa ATP kinachopimwa kinachotegemea ATP synthase. Pili, fanya jaribio lisilo na seli la urejeshaji wa ATP iliyoongezwa, ukitumia kiasi kinachojulikana cha ATP pamoja na kitendanishi kamili na viwango vilevile vya rangi vilivyotumika, angalau 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, na 2 uM. Rangi inaweza kufyonza mwanga unaotolewa, kuzuia kimeng'enya kinachozalisha ishara ya kipimo, au kubadilisha kemia ya redoksi ya kitendanishi. Mwongozo wa jumla wa vipimo vya lusiferasi unapendekeza vipimo vya ziada vya kibayokemia vya kuchunguza aina hii hasa ya mwingiliano. Usidhani kwamba 1 uM haina athari potofu za kipimo kwa sababu tu uzimaji wa fluoresensi kwa kawaida huwa mkubwa zaidi katika viwango vya juu.

Vihisi vya potenshali ya utando hupima mgawanyiko wa rangi, si mtiririko

Safranine O, TMRM na TMRE, rhodamine 123, na JC-1 zote ni kat ayoni zinazoweza kupenya utando. Hujikusanya katika matriksi yenye chaji hasi kulingana na usawaziko wa kielektrokemikali, hivyo fluoresensi ya sampuli nzima huripoti potenshali kwa njia isiyo ya moja kwa moja kupitia mahali kihisi kilipo. Hakuna hata kimoja kinachopima ATP au mtiririko wa elektroni.

Kila kihisi kina aina ya maandalizi inayokifaa zaidi. Safranine O hufaa kwa mitokondria iliyotengwa na seli zilizofanywa zipenyeke, kwa kawaida karibu na 2 uM, huku msisimko wa mwanga ukiwa karibu na 495 nm na utoaji wa mwanga karibu na 585 nm. Hutumika katika hali ya uzimaji wa fluoresensi ambapo kuingia kwake kwenye mitokondria hubadilisha fluoresensi ya sampuli nzima. TMRM na TMRE hufaa kwa seli kamili zikiwa katika viwango vya chini vya nanomola katika hali isiyo na uzimaji wa fluoresensi, ambapo kupungua kwa potenshali huachilia rangi na fluoresensi ya mitokondria hushuka; katika viwango vya juu, mwelekeo wa ishara unaweza kugeuka kutokana na rangi kuzima fluoresensi yake yenyewe. JC-1 hutoa uwiano rahisi wa kijani kwa nyekundu, lakini hutegemea kiasi cha rangi kilichoingizwa na wingi wa mitokondria, jambo linaloifanya isiwe imara kwa kazi ya kupima kiasi kama TMRM iliyodhibitiwa kwa uangalifu. Faida na mapungufu haya yamefupishwa katika mapitio yanayotumiwa sana kuhusu vihisi vya potenshali ya utando wa mitokondria.

Bluu ya methilini huingilia vipimo vya mwanga katika viwango vilevile vinavyotumika katika majaribio. Mikanda yake ya ufyonzaji karibu na 600 hadi 665 nm inaingiliana na utoaji wa mwanga mwekundu wa vihisi, hivyo athari za kichujio cha ndani, uzimaji wa fluoresensi, na ufyonzaji wa mwanga wa msisimko zote zinawezekana. Rangi hiyo pia ni kat ayoni ya pili inayopendelea mazingira ya mafuta, ambayo mgawanyiko wake hubadilika kulingana na potenshali inayopimwa. Kinga ni kutumia vipimo zaidi ya kimoja pamoja na sampuli tupu za udhibiti: kihisi pekee, rangi pekee, kihisi pamoja na kila kiwango cha rangi, kuondoa kabisa potenshali kwa FCCP kama rejeleo la sifuri, na ikiwezekana kihisi cha pili chenye sifa tofauti za mwanga. Utafiti wa kupita njia mbadala ya Kompleksi III uliweka mfano huo kwa kurudia urejeshaji wa potenshali ya utando kwa kutumia safranine O na TMRM baada ya uzuiaji kwa antimycin na myxothiazol, na kupata urejeshaji wenye sifa zilezile. Kihisi kimoja cha mwanga ni kidokezo. Vihisi viwili vinavyojitegemea ni ushahidi.

Maandalizi matatu, maswali matatu tofauti

Mitokondria iliyotengwa, seli zilizofanywa zipenyeke, na seli kamili si mipangilio ya unyeti inayoweza kubadilishana katika kipimo kimoja. Ni dhana tofauti zenye kanuni tofauti za utendaji.

Mitokondria iliyotengwa huhifadhi mnyororo wa usafirishaji wa elektroni, utando wa ndani, na mifumo ya matriksi, huku utando wa plazma, sitosoli, na muundo wa mtandao vikiondolewa. Kuondoa hivyo ndilo lengo: substrati, ADP, vizuizi, na viwango vya rangi hufafanuliwa kwa usahihi, hivyo njia inayohusika inaweza kubainishwa. Gharama yake ni kupoteza ugavi wa asili wa substrati, utoaji wa ishara, na mahitaji ya nishati.

Seli zilizofanywa zipenyeke huhifadhi mitokondria ndani ya sehemu kubwa ya muundo wake wa seli huku zikiruhusu substrati kutoka nje na ADP kupita kupitia utando wa plazma uliofunguliwa. Ni zana inayofaa kwa kubainisha hitilafu katika njia ya substrati ndani ya mazingira ya seli. Kufanya seli zipenyeke kupita kiasi huharibu utando wa nje, na udhibiti wa sitosoli huondolewa wakati wa kuosha.

Seli kamili huhifadhi kila kitu: kizuizi cha utando wa plazma, vitoa elektroni vya sitosoli, usafirishaji wa substrati za ndani, mtandao wa mitokondria, na mahitaji ya ATP. Ziko karibu zaidi na hali ya kifiziolojia na mbali zaidi na kutenganisha utaratibu wenyewe, kwa sababu kuingia kwa rangi, kupokea kwake elektroni, na kutengwa kwake katika sehemu mbalimbali vyote huamua kiwango halisi cha rangi kinachofikia mitokondria.

Utafiti wa TEGDMA ulitumia viwango vyote vitatu kwa makusudi: mitokondria ya ubongo iliyotengwa kuchunguza urejeshaji wa uoksidishaji na potenshali kwa rangi; seli shina za massa ya jino zilizofanywa zipenyeke, hasa kubainisha kwamba hitilafu ilikuwa katika uoksidishaji wa substrati unaohusishwa na Kompleksi I; na seli shina kamili kuchunguza athari halisi ya kifiziolojia ya rangi ya 2 uM kwenye matumizi ya oksijeni yaliyokuwa yamepunguzwa. Kwa wasomaji wanaolinganisha matokeo ya vipimo vya mitokondria katika maandalizi tofauti, maelezo yanayoambatana kuhusu jinsi bluu ya methilini inavyohamisha elektroni kupitia mnyororo wa upumuaji hutoa usuli wa njia hizo, na mwongozo wa kusoma tafiti za upumuaji zinazotumia bluu ya methilini unafafanua mantiki ya kiasi kinachotumika na vizuizi.

Vidhibiti vinavyohitajika kwa rangi inayoshiriki katika redoksi

Kiwanja kinachozunguka kati ya hali za redoksi kinahitaji orodha ndefu zaidi ya vidhibiti kuliko kizuizi cha kawaida, kwa sababu kemia ya rangi pekee inaweza kuiga michakato ya kibiolojia.

Kwa respirometria, tumia chemba yenye bafa pekee kupima mkengeuko wa usomaji, chemba yenye bafa pamoja na rangi bila nyenzo ya kibiolojia, rangi pamoja na kitoa elektroni chochote cha nje ya seli kilichopo katika kipimo, na rotenone pamoja na antimycin katika hatua ya mwisho ili kubainisha matumizi ya oksijeni yasiyotokana na mitokondria katika seli kamili. Kumbuka kwamba rangi iliyopokea elektroni huoksidishwa tena kwa kuhamisha elektroni kwenda kwa oksijeni na kutengeneza peroksidi ya hidrojeni. Kwa hiyo, sampuli tupu yenye rangi pekee bila mtoaji wa elektroni hukadiria chini matumizi ya oksijeni yasiyohusisha seli yanayojitokeza mara NADH au NADPH inapopatikana.

Kwa peroksidi ya hidrojeni, pendelea Amplex UltraRed iliyorekebishwa kwa viwango vya marejeleo pamoja na peroksidasi ya horseradish badala ya rangi za DCFDA zisizo teule, thibitisha kwa katalasi, na pima utegemezi wa mwangaza, kwa kuwa rangi ni kiwanja kinachochochea miitikio kwa mwanga. Utafiti wa mitokondria ya ubongo uligundua kwamba mzigo wa peroksidi uliongezeka zaidi ya mara nne kwa rangi ya 100 nM tu huku uondoaji wake ukipungua kasi, na peroksidi ilitengenezwa moja kwa moja na rangi iliyopokea elektroni bila superoksidi kama kiambata cha kati. Maelezo ya uchaguzi wa kihisi na vidhibiti vya mwanga yako katika makala inayoambatana kuhusu kupima spishi tendaji za oksijeni katika majaribio ya rangi, na swali pana zaidi la wakati ambapo peroksidi hutenda kama ishara badala ya mzigo linajadiliwa pamoja na usawaziko wa redoksi wa seli na madai kuhusu vioksidishaji-kinzani.

Kwa madai kuhusu njia inayotumika, pima maeneo yote mawili ya vizuizi vya Kompleksi III: antimycin A katika eneo la Qi na myxothiazol katika eneo la Qo, pamoja na hatua ya mwisho ya Kompleksi IV kwa kutumia sianidi. Utafiti wa awali wa ubongo wa panya uliripoti urejeshaji kwa rangi wa upumuaji uliozuiwa na rotenone lakini si ule uliozuiwa na antimycin, huku utafiti wa baadaye wa spishi tatu ukipata urejeshaji wa sehemu kwa vizuizi vyote viwili na ushahidi wa saitokromu c kupokea elektroni moja kwa moja. Chukulia matumizi ya njia mbadala kuwa yanaendana na data mpya zaidi, si kuwa jambo lililothibitishwa kikamilifu, kwa kuwa kiwango cha rangi, eneo la kizuizi, hali ya substrati, na mgawanyiko wa rangi vyote hubadilisha njia inayoonekana.

Jedwali la kuchagua vipimo

Tumia jedwali hili kuchagua kipimo kulingana na swali, si kuchagua swali kulingana na kipimo.

Ili dai lishawishi kwa kiwango cha chini kinachokubalika, viwango vilevile vya rangi, 100 nM, 300 nM, 1 uM, na 2 uM, vinapaswa kutumiwa katika vipimo vya mtiririko wa oksijeni chini ya hali za uvujaji, ADP, oligomycin, na kiwanja kinachotenganisha upumuaji na usanisi wa ATP; kasi ya usanisi wa ATP; potenshali ya utando kwa kutumia, ikiwezekana, vihisi viwili; na utolewaji wa peroksidi uliopimwa kwa viwango vya marejeleo pamoja na katalasi na vidhibiti visivyo na seli. Ripoti seti hiyo iliyounganishwa: mtiririko wa oksijeni pamoja na kasi ya ATP, ATP kwa oksijeni, potenshali, na peroksidi. Namba yoyote kati ya hizo ikiwa peke yake ni kipimo kinachotafuta maana.