Bluu ya methilini kwa kutia rangi DNA na RNA: matumizi katika jeli na utando

Mwanafunzi anaendesha jeli ya agarosi, anaitia rangi kwa bluu ya methilini, na haoni kitu mahali alipotazamia kuona bendi angavu. Katika sehemu ya jirani ya maabara, mtafiti wa baada ya udaktari anatia rangi utando wa Northern kwa rangi kutoka kwenye chupa ileile ya bluu na kupata bendi za ribosomu zilizo wazi ndani ya dakika tatu. Mwanafunzi anahitimisha kwamba jeli imeshindwa. Jeli haikushindwa. Kazi hizo mbili zilikuwa tofauti, na rangi ileile inazijibu kwa unyeti tofauti, mandharinyuma tofauti, na kanuni tofauti za hatua zinazofuata.

Kutia rangi DNA na kutia rangi RNA kwa bluu ya methilini kunatumia kemia ileile lakini si kwa kusudi lilelile. Katika jeli, rangi inaonyesha kiasi cha asidi nukleiki kilichomo ndani ya matriksi yenye matundu. Kwenye utando, inaonyesha kama uhamishaji ulifaulu na kama njia zilipakiwa kwa usawa. Tofauti hiyo ikieleweka, itifaki, mipaka ya ugunduzi, na mipaka ya uoanifu huwa wazi.

Jibu fupi

Bluu ya methilini ni rangi ya kationi yenye muundo bapa inayofungamana na asidi nukleiki bila vifungo vya kovalenti na kwa namna inayoweza kurejeshwa, kupitia mchanganyiko wa mvutano wa kielektrostatiki kuelekea fosfati, kujipachika kati ya jozi za besi, na kushikamana kwenye kijito kidogo. Uwezo huo wa kurejesha hali ndio muhimu. Bendi zinaweza kutiwa rangi, kuonekana kwa mwanga unaoonekana, na kurekodiwa, kisha kuondolewa rangi au kusafishwa kwa ajili ya kloningi, uhybridishaji, au kupimwa tena kwa probe.

Kwa kutia rangi DNA yenye nyuzi mbili katika jeli ya agarosi kwa bluu ya methilini, fomula ya kawaida ya haraka ni asilimia 0.02 w/v (micrograms 200 kwa mL) katika maji, takribani dakika 15 za kutia rangi na takribani dakika 15 za kuondoa rangi kwa maji, kisha kuitazama kwenye kisanduku cha mwanga mweupe. Kwa utando, fomula ya jadi ya Northern blot ni asilimia 0.02 hadi 0.04 ya rangi katika asetati ya sodiamu karibu na pH 5.2, dakika kadhaa za kutia rangi baada ya uhamishaji na kufungia sampuli mahali pake, kisha kusuuza kwa maji na kuondoa rangi kabisa kabla ya uhybridishaji. Unyeti ni wa wastani: makumi hadi mamia ya nanograms kwa kila bendi ya jeli katika hali nzuri, na miongozo ya tahadhari hutaja microgram 0.5 hadi 1. Kiasi hicho ni cha viwango vya ukubwa kadhaa juu ya kile kinachohitajika kwa bromidi ya ethidium na rangi za SYBR. Kwenye utando hakuna kikomo kimoja chenye manufaa cha kugundua transkripti moja, kwa sababu rangi huonyesha hasa RNA nyingi ya ribosomu na jumla ya nyenzo zilizopakiwa. Usitumie myeyusho wa kirutubisho unaouzwa rejareja badala ya rangi katika fomula yoyote kati ya hizi. Mbinu zilizothibitishwa hutegemea rangi ya daraja la uchanganuzi, miyeyusho kinga yenye muundo uliobainishwa, na ushughulikiaji usio na RNase pale RNA inapohusika.

Jinsi kufungamana kunavyofanya kazi, na kunavyoweza kupotosha

Mfano unaofaa kuelezea kufungamana una sehemu tatu. Kwanza, mfumo wa pete wenye chaji chanya huvutwa na uti wa mgongo wa fosfati wenye chaji hasi. Tafiti za spektroskopia zinaonyesha kwamba mchango huu wa kielektrostatiki hutawala katika kiwango kidogo cha chumvi, huku uundaji wa mifano na mienendo ya molekuli zikionyesha kujipachika kati ya jozi za besi na kufungamana kwenye kijito kidogo kama namna thabiti za kufungamana na DNA yenye nyuzi mbili, kama ilivyofupishwa katika utafiti wa spektroskopia kuhusu kufungamana kwa bluu ya methilini na DNA. Pili, kuna upendeleo fulani kwa GC: mifano hupendelea hatua za CpG na GpC, na majaribio huripoti kufungamana kwa upendeleo na miundo ya nyuzi mbili yenye GC nyingi katika utafiti kuhusu mapendeleo ya kujipachika kwa bluu ya methilini kati ya jozi za besi, lakini miundo ya nyuzi mbili ya AT pia hufungamana nayo. Kutia rangi kwa kawaida si mahususi kwa mfuatano fulani. Tatu, DNA yenye uzi mmoja na RNA hufungamana hasa kupitia mvutano wa kielektrostatiki na kupangana kwa rangi pamoja na besi zinazofikika na maeneo yenye nyuzi mbili; ndiyo sababu nguvu ya rangi hutofautiana kulingana na urefu, mfuatano, na muundo wa pili.

Matokeo mawili yanafuata. Kwa sababu kufungamana hakutegemei vifungo vya kovalenti, rangi huondolewa kwa kuosha. Bendi za poliakrilamidi hufifia haraka isipokuwa zifungiwe kwa makusudi, na mbinu maalumu ya kufungia rangi kwa kudumu ipo hasa kwa sababu kutia rangi kwa kawaida ni kwa muda, kama ilivyoelezwa na Soto na Draper kwa jeli za PAGE. Kwa sababu rangi ni kihamasishaji cha mwanga, kuangazia DNA iliyotiwa rangi kwa mwanga mkali kwa muda mrefu huku oksijeni ikiwa ipo kunaweza kuoksidisha guanini na hatimaye kukata uzi mmoja, utaratibu ulioelezwa kwa kina katika utafiti kuhusu uoksidishaji wa guanini unaochochewa na bluu ya methilini kwa mwanga. Kutazama kwa muda mfupi kwa mwanga mweupe huepusha uharibifu unaojulikana vizuri wa UV katika taratibu za jadi za bromidi ya ethidium, na faida hiyo ni halisi wakati wa kurejesha DNA kwa matumizi yanayofuata. Mwanga unaoonekana ni mpole zaidi, lakini si kwamba hauna madhara. Fupisha muda wa kuangazia ikiwa DNA itatumika kwa kloningi. Kwa kemia pana ya mwanga inayofafanua tahadhari hiyo, tazama njia mbili katika kemia ya mwanga ya bluu ya methilini. Kwa jozi ya redoksi na hali za chaji zinazoeleza kwa nini umbo lililooksidishwa hufungamana na umbo lililopunguzwa haliwezi, tazama kemia ya muundo na sifa za bluu ya methilini.

Kazi ya kwanza: kutia rangi ndani ya jeli

Kutia rangi jeli hujibu swali moja: je, kuna asidi nukleiki ya kutosha katika bendi hii kuonekana kwa macho? DNA yenye nyuzi mbili katika agarosi ndiyo hali iliyochunguzwa kwa kina zaidi. Mbinu ya awali ya kutia rangi jeli kwa bluu ya methilini ya Flores na wenzake ilithibitisha itifaki ya haraka ya asilimia 0.02 katika agarosi ya asilimia 1 na kuonyesha kufaulu kwa kurejesha DNA na kufanya kloningi baadaye. Itifaki hiyo hiyo ya msambazaji inaonekana kwenye ukurasa wa bidhaa ya bluu ya methilini wa IBI Scientific, unaoorodhesha fomula ya asilimia 0.04 kwa utando pamoja na mbinu ya haraka ya jeli.

Utaratibu wa vitendo:

1. Endesha jeli kama kawaida. Tia rangi baada ya elektroforesisi, si wakati wake, isipokuwa uhamishaji au uwezo wa kutenganisha vimethibitishwa kwa mbinu iliyorekebishwa.
2. Zamisha katika bluu ya methilini ya asilimia 0.02 w/v katika maji yaliyodistiliwa, ukitikisa taratibu, kwa takribani dakika 15.
3. Ondoa rangi kwa kubadilisha maji mara kadhaa, kwa takribani dakika 15 kwa jumla, hadi rangi ya mandharinyuma ya matriksi ipungue na bendi zionekane wazi.
4. Piga picha mara moja kwenye kifaa cha kuangazia kwa mwanga mweupe.

Agarosi na poliakrilamidi hutenda tofauti. Agarosi huhifadhi rangi katika matriksi, hivyo kuondoa rangi ndiyo hatua inayochukua muda zaidi. Jeli nyembamba za poliakrilamidi hupokea rangi haraka lakini pia huipoteza haraka, jambo linalosaidia kukata bendi kwa matumizi yanayofuata lakini huathiri rekodi za kuhifadhi. Oligonukleotidi za sintetiki katika poliakrilamidi zinaweza kutambuliwa kwa fomula ileile ya asilimia 0.02 ndani ya dakika 20 hadi 30, kwa kuosha kwa maji mara kwa mara, kwa kufuata mbinu za PAGE zilizoimarishwa za aina ya Current Protocols. Mbinu zenye rangi iliyopunguzwa sana hadi karibu asilimia 0.0002 katika TBE iliyopunguzwa ukolezi zimeripotiwa kwa oligonukleotidi zinazotayarishwa kwa matumizi yanayofuata kwa muda wa saa kadhaa, lakini msingi wa ushahidi ni dhaifu zaidi.

Tofauti kati ya DNA na RNA ni muhimu. DNA yenye nyuzi mbili hutoa kufungamana kwa nguvu zaidi kunakohusiana na muundo. RNA na DNA yenye uzi mmoja hupokea rangi, lakini kwa udhaifu zaidi na kwa namna isiyotabirika sana. Kwa jeli za RNA za agarosi zenye formaldehidi, maabara nyingi huepuka kutia rangi ya bluu ndani ya jeli na badala yake huhamishia RNA kwenye utando kwanza, kisha kuitia rangi huko. Hatua hiyo hubadilisha ishara dhaifu ya jeli kuwa ishara iliyo wazi zaidi kwenye utando pamoja na rekodi ya upakiaji.

Kazi ya pili: kutia rangi kwenye utando

Kutia rangi utando hujibu swali tofauti: je, uhamishaji ulifaulu, na je, njia zinaweza kulinganishwa? Matumizi ya jadi ni rangi ya Northern blot inayoweza kuondolewa ya Herrin na Schmidt, ambayo awali ilitumia asilimia 0.04 ya rangi katika mM 50 za asetati ya sodiamu yenye pH 5.0 kwa dakika 2 hadi 3, kisha kusuuza kwa maji; rangi inaweza kuondolewa kwa SDS iliyopunguzwa ukolezi katika SSPE kabla ya uhybridishaji.

Mbinu ya kisasa inayotumika sana hufuata hatua hizi:

1. Hamishia RNA au DNA iliyodenatishwa kwenye nailoni au nitroselulosi, kisha ifungie mahali pake kwa kuunganisha kwa UV au kwa joto ili sampuli isipotee wakati wa kutia rangi.
2. Hatua ya hiari lakini ya kawaida: lowesha utando katika asidi asetiki ya asilimia 5 kwa takribani dakika 15.
3. Tia rangi kwa dakika 5 hadi 10 katika bluu ya methilini ya asilimia 0.02 hadi 0.04 katika M 0.3 hadi 0.5 za asetati ya sodiamu karibu na pH 5.2.
4. Suuza na uondoe rangi kwa maji kwa dakika 5 hadi 15, rekodi matokeo, kisha ondoa rangi iliyobaki kabla ya uhybridishaji.

Nailoni yenye chaji chanya hutumika zaidi katika kazi za Northern. Nitroselulosi pia hufanya kazi kwa utaratibu huohuo wa asidi asetiki pamoja na asetati. Picha hutumika kuthibitisha uhamishaji, kulinganisha bendi za 28S na 18S (au 23S na 16S kwa RNA ya bakteria), kuweka alama za viwango vya ukubwa na sampuli rejea, na kuhifadhi rekodi ya makadirio ya kusawazisha kwa jumla ya RNA. Mbinu za Northern zilizochapishwa hupima kiasi cha bendi za ribosomu zilizotiwa rangi ili kukagua upakiaji, zikiwemo tafiti za sayansi ya maziwa zilizotumia bendi za ribosomu zilizotiwa bluu ya methilini kwa kusawazisha. Utando wa Southern unaweza kuonekana kwa namna hiyo hiyo, lakini rangi imeimarishwa zaidi kama ukaguzi wa upakiaji na uhamishaji wa Northern, na DNA ya Southern hudenatishwa kabla ya kuhamishwa, hivyo takwimu za unyeti wa jeli hazitumiki moja kwa moja.

Mipaka ya ugunduzi na mandharinyuma: pale bluu inapokuwa dhaifu zaidi

Ulinganisho ulio hapa chini umekusudiwa kuwa wa makadirio. Utendaji wa rangi hutegemea asilimia ya jeli, upana wa bendi, vifaa vya optiki, na umakini wa kuondoa rangi. Chukulia kila namba kama kiashirio cha kiwango cha ukubwa, si kama sifa maalumu iliyohakikishwa.

Udhibiti wa mandharinyuma huamua kama ishara ya wastani inaweza kutumika. Rangi isiyofungamana ina rangi kali, hivyo utofauti hutokana na kuondoa rangi isiyofungamana bila kuondoa iliyofungamana. Rangi yenye ukolezi mkubwa zaidi mara chache huongeza unyeti. Hasa huongeza muda wa kuondoa rangi. Jaribu mfululizo wa sampuli zenye kiasi kinachopunguzwa hatua kwa hatua kwenye jeli, utando, na kamera ileile, na utumie tu masafa ambayo jumla ya ukolezi wa picha inabaki sawia na kiasi kilichowekwa. Bluu ya methilini husaidia kusawazisha upakiaji kwa makadirio ya kiasi. Si kipimo cha kiasi chenye masafa mapana ya upimaji kwa sababu uwezo wa utando, ufanisi wa uhamishaji, kufikia kiwango cha kujaa, na uondoaji wa rangi hutofautiana kati ya njia.

Mipaka ya uoanifu: kinachobaki baada ya kutia rangi

Kloningi baada ya kutia rangi ya bluu imeonyeshwa kuwa inawezekana. Flores na wenzake walikata bendi za agarosi zilizotiwa rangi, wakarejesha DNA, wakaiunganisha kwa ligation na kufanya transformesheni, na kuripoti kloningi bora kuliko baada ya kutumia bromidi ya ethidium pamoja na UV. Sababu inayowezekana ni uharibifu mdogo unaosababishwa na mwanga, si faida inayotokana na rangi yenyewe. Fupisha muda wa kuangazia kwa mwanga mweupe na usafishe DNA iliyorejeshwa kwa utaratibu wa kawaida wa kutoa DNA kutoka kwenye jeli.

Ushahidi kuhusu PCR na usomaji wa mfuatano ni mdogo zaidi. Rangi iliyobaki hufungamana na asidi nukleiki, hivyo ondoa rangi na usafishe kabla ya hatua za kienzimu. DNA iliyosafishwa vizuri kutoka kwenye jeli ya bluu inatarajiwa kufanya kazi, lakini uvumilivu kwa rangi inayobebwa moja kwa moja kwenda katika hatua zinazofuata haujapimwa vizuri kwa polimerasi na kemia mbalimbali za usomaji wa mfuatano. Usidhani kuwa inavumilika.

Uhybridishaji wa blot unaoana na rangi ikiwa mpangilio unafuatwa kwa ukamilifu: hamisha, fungia mahali pake, tia rangi, rekodi, ondoa rangi, hybridisha. Mfuatano huo ndio muundo wa Herrin na Schmidt. Kutia rangi kabla ya kuhamisha, au kuruka hatua ya kuondoa rangi, ni mbinu tofauti na inahitaji uthibitishaji wake yenyewe. Baada ya kuondoa rangi, kuondoa probe na kupima tena kwa probe kwa taratibu za kawaida huendelea kama kawaida. Kwa kutia rangi katika kiwango cha seli kwa familia hii hii ya rangi, na kwa nini mantiki ya tabaka lililofungiwa haitumiki kwa mbinu za seli hai, tazama atlasi ya kutia rangi kwa hadubini.

Kukata bendi hufanya kazi kwa agarosi inayotumiwa kutayarisha sampuli na kwa oligonukleotidi za PAGE zilizotambuliwa kwa bluu, mradi mbinu ya kufungia rangi kwa kudumu iepukwe. Kutoa sampuli kwa mkondo wa umeme baada ya kuondoa rangi kunawezekana kikemia kwa rangi inayofungamana kwa namna inayoweza kurejeshwa, lakini data za kiasi kinachorejeshwa kutoka majaribio yaliyodhibitiwa mahususi kwa bluu ya methilini ni chache. Ondoa chumvi au fanya utenganishaji kwa kuunda mashapo baada ya kutoa sampuli.

Matatizo yanayojirudia

Bendi hafifu za jeli kwa kawaida humaanisha kiasi kidogo mno kwa rangi inayogunduliwa kwa kuangalia rangi, hasa kwa malengo mafupi yenye uzi mmoja au ya RNA. Pakia zaidi, tumia rangi mpya, ongeza muda wa kutia rangi kabla ya kuongeza ukolezi, na simamisha uondoaji wa rangi mapema zaidi. Jeli yenye bluu nzito kote bila utofauti kwa kawaida humaanisha kutia rangi kupita kiasi au kubadilisha maji mara chache mno. Kufifia kwa bendi za PAGE ni kemia inayotarajiwa, si kushindwa kwa rangi. Piga picha haraka. Mandharinyuma yasiyo sawa kwenye utando huashiria mikunjo, viputo, alama za vidole, kutikisa kusiko sawa, au uhamishaji usiosambaa sawasawa. Usitafsiri hilo kuwa upakiaji usio sawa bila kidhibiti cha uhybridishaji. Muundo dhaifu wa bendi za ribosomu uliotapakaa unaweza kumaanisha uharibifu wa RNA, lakini pia uhamishaji usiokamilika, jumla ndogo mno ya RNA (njia za kawaida hubeba micrograms kadhaa hadi makumi), au kuondoa rangi kupita kiasi. Rangi huonyesha RNA nyingi ya ribosomu. Haionyeshi transkripti mahususi. Kazi hiyo ni ya probe.

Usalama na ushughulikiaji bila madai yaliyopitiliza

Bluu ya methilini ni rahisi zaidi kushughulikia kuliko bromidi ya ethidium, lakini si isiyo na madhara. Karatasi ya sasa ya data za usalama ya MilliporeSigma inaainisha rangi hii kuwa ya sumu kali inapomezwa, Kategoria 4, yenye madhara ikimezwa, na inaelekeza utupaji kupitia njia iliyoidhinishwa ya taka kulingana na SDS ya bluu ya methilini ya Sigma-Aldrich. Bromidi ya ethidium ina maonyo makali zaidi ya madhara kwa nyenzo za kijeni, yakiwemo madhara yanayoshukiwa kwa seli za uzazi katika SDS yake ya Sigma-Aldrich ya bromidi ya ethidium, na jeli na miyeyusho yake kwa kawaida hutenganishwa kama taka hatari za kemikali, kama ilivyoelezwa katika mwongozo wa Thermo Fisher wa rangi za asidi nukleiki. Fuata SDS na kanuni za taasisi kwa zote mbili. Hifadhi rangi kavu ikiwa imefungwa vizuri na ikiwa kavu, tumia tena myeyusho wa rangi wa kazi tu kwa kadiri itifaki inavyoruhusu, hifadhi utando uliotiwa rangi ukiwa mkavu kati ya karatasi za kuchuja, na piga picha za jeli kabla bendi hazijatawanyika.

Kumbuka kauli hii ya mezani pa maabara. Jeli hupima kuonekana kwa kiasi kikubwa kilichopakiwa chini ya mwanga mweupe. Utando hupima uhamishaji na upakiaji kabla probe haijafanya kazi yenye unyeti mkubwa. Rangi moja hutumikia kazi zote mbili, kwa unyeti wa wastani, kufungamana kunakoweza kurejeshwa, na mpangilio madhubuti wa hatua.