Nytt metylenblått och retikulocytfärgning: ett separat färgämne och en metod för levande celler

En student förbereder en retikulocyträkning, beställer metylenblått, blandar det med blod och ser nästan ingenting. En kurskamrat använder en flaska märkt nytt metylenblått och får skarpa blå filament i en del av de röda blodkropparna. Den första studenten antar att den andra flaskan är färskare eller mer koncentrerad. Den är varken det ena eller det andra. Den innehåller en annan molekyl.

Detta är det begreppsfel som ligger bakom det mesta av förvirringen på området. Namnet antyder att nytt metylenblått är en förbättrad sats av metylenblått. Kemin säger något annat. Nytt metylenblått N är ett separat fenotiazinfärgämne med ett eget Colour Index-nummer, ett eget substitutionsmönster och en egen standardiserad roll inom hematologin. När den skillnaden är tydlig blir resten av metoden enkel att förstå: varför cellerna måste vara levande när de färgas, vad som räknas som en retikulocyt, hur Heinz-kroppar passar in och när briljantkresylblått kommer in i bilden.

Det korta svaret

Nytt metylenblått N, hematologireagenset, identifieras vanligen som Basic Blue 24 i PubChem-posten för nytt metylenblått, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, med formeln C18H22ClN3S. Vanligt metylenblått är metyltioniniumklorid, Basic Blue 9, i dess PubChem-post, C.I. 52015, CAS 61-73-4, med formeln C16H18ClN3S. Strukturellt har nytt metylenblått två metylgrupper på ringen och etylaminosidokedjor där metylenblått har dimetylaminogrupper. Den skillnaden förändrar färgningsegenskaperna. Hematologiska läroböcker beskriver vanligt metylenblått som ett relativt dåligt färgämne för retikulocyter och nytt metylenblått som ett färgämne som ger djupare och jämnare färgning. Jämförelsen sammanfattas i ScienceDirects ämnesöversikt om nytt metylenblått.

Ja, nytt metylenblått är ett supravitalt färgämne. Supravital färgning innebär att levande celler färgas efter att de tagits från kroppen och före fixering, enligt definitionen i NCBI:s översikt över principerna för supravital färgning. Både nytt metylenblått och briljantkresylblått tillhör denna kategori, och CLSI:s retikulocytstandard behandlar uttryckligen nytt metylenblått som ett supravitalt färgämne. Studenter placerar ibland detta i samma kategori som Romanowsky-färgning av fixerade utstryk. Den tankemodellen fungerar inte här. Om man fixerar först slutar metoden att fungera.

För läsare som vill hålla isär närliggande färgämnesnamn behandlar metylblått jämfört med metylenblått en annan och större sammanblandning mellan ett anjoniskt triarylmetanfärgämne och den katjoniska fenotiazinfamiljen. Översikten över laboratoriefärgning placerar supravitalt arbete i sammanhang med metoder för fixerade utstryk, och guiden till blodcellsmorfologi visar hur retikulocytbedömning passar in i den bredare differentialräkningen.

En sak att uppmärksamma i kataloger: det finns en separat dubbelsaltform med zinkklorid av nytt metylenblått under CAS 6586-05-6. Ett metodavsnitt bör därför ange saltform och leverantör, inte bara det vanliga namnet.

Vad supravital färgning faktiskt gör

En retikulocyt är en ung röd blodkropp som har förlorat sin kärna men fortfarande innehåller kvarvarande ribosomalt RNA. I ett ofärgat våtpreparat är detta RNA osynligt. Det supravitala färgämnet tränger in i den levande cellen och fäller ut eller aggregerar detta RNA till blå granula och filament, det retikulofilamentösa material som syns vid oljeimmersion. Nätverket är alltså en produkt av färgningen, inte ett redan bildat skelett som väntar på färg. Därför är protokollvariablerna — färgämneskoncentration, buffert, förhållandet mellan blod och färgämne, temperatur och tid — lika viktiga som färgämnets namn.

Den praktiska konsekvensen är en strikt arbetsordning: blanda först antikoagulerat blod med färgämnet, inkubera, gör sedan utstryk och undersök dem ofixerade och utan motfärgning. Fixering före färgning, eller en motfärgning som döljer svagt färgade filament, förstör den information som räkningen bygger på.

Ett praktiskt retikulocytprotokoll med nytt metylenblått

Det finns ingen enda universell formulering, så ange vilken som används. Tre dokumenterade varianter visar spännvidden.

Den klassiska metoden av Brecher-typ använder ungefär 0.5 procent nytt metylenblått med kaliumoxalat, blandat i lika volymer med välblandat EDTA-blod och inkuberat i cirka 10 till 15 minuter vid rumstemperatur. Efter försiktig omblandning görs tunna kilformade utstryk som lufttorkas och undersöks ofixerade med ett 100x oljeimmersionsobjektiv. NCBI:s metod för retikulocyträkning beskriver detta arbetsflöde och den räkneram som används tillsammans med det.

Dacie och Lewis-varianten använder 1.0 procent nytt metylenblått i citrathaltig saltlösning, blandat med 2 till 4 volymer blod och inkuberat vid 37 C i 15 till 20 minuter innan utstryken görs. En nyligen genomförd harmonisering av CLSI H44-metoden använde en mer utspädd lösning på 0.1 procent i fosfatbuffrad saltlösning vid pH 7.4, med inkubering vid 20 C i 10 minuter och utan fixering, enligt harmoniseringsstudien för NMB från 2026.

Räknereglerna är gemensamma för varianterna. Räkna en cell som en retikulocyt när den innehåller minst två separata blåfärgade granula eller filamentsegment, vilket utesluter enstaka färgämnesavlagringar. Räkna minst 1,000 röda blodkroppar vid rutinanalys och rapportera retikulocyterna som en procentandel. Vid låga procentandelar kräver statistiken fler celler. En översikt över CLSI H44-metodiken anger att det vid en retikulocytandel nära 1 procent behövs cirka 4,400 celler för att få ned variationen i räkningen till 5 procent, i CLSI H44-översikten hos De Gruyter. En Miller-skiva i okularet gör det praktiskt möjligt att räkna stora cellantal. Filtrera färglösningen eller bered den färsk, eftersom utfällningar kan efterlikna granulära inklusioner.

Heinz-kroppar i samma preparat

Samma supravitala utstryk kan också påvisa Heinz-kroppar, som är aggregat av oxiderat och denaturerat hemoglobin snarare än kvarvarande RNA. I preparat med nytt metylenblått framträder de som runda kroppar, ofta enstaka och nära membranet, med en ljusare blå färg än det retikulofilamentösa materialet. De bevaras dåligt vid fixering och motfärgning, så undersök det ofixerade utstryket. Ett nyligen beskrivet protokoll med 20 mikroliter EDTA-blod, 20 mikroliter 1 procent nytt metylenblått och 15 minuters inkubering kvantifierade celler med Heinz-kroppar bland 250 erytrocyter, i PMC-studien som redovisar metoden.

Två skillnader hjälper till att undvika feltolkningar. För det första färgar metylviolett och kristallviolett Heinz-kroppar starkare än nytt metylenblått, vilket anges i ScienceDirects ämnesöversikt om Heinz-kroppar. Nytt metylenblått är det praktiska valet när retikulocyter och Heinz-kroppar bedöms tillsammans, inte det starkaste färgämnet specifikt för Heinz-kroppar. För det andra ger HbH-inklusioner vid anlagsbärarskap för alfa-talassemi många fina prickar över hela cellen efter supravital färgning, medan klassiska Heinz-kroppar är färre, större och ofta membranassocierade. Färgämnesavlagringar är den tredje förväxlingskällan: de ligger utanför cellernas fokalplan och varierar mellan synfält.

Briljantkresylblått jämfört med nytt metylenblått

Båda färgämnena används för supravital färgning av retikulocyter, men standardiseringen föredrar det ena. Retikulocytmetoden CLSI H44-A2, som utvecklats tillsammans med International Council for Standardization in Haematology och finns på CLSI:s sida för H44-standarden, anger färgning av EDTA-blod med nytt metylenblått som den manuella jämförelsemetoden. Klassisk hematologiundervisning beskriver utseendet på samma sätt: nytt metylenblått ger djupare och jämnare filamentfärgning, medan briljantkresylblått varierar mer mellan tillverkningssatser och prover.

Denna ställning behöver dock nyanseras. ICSH:s riktlinje för utvärdering av analysinstrument godtar manuell mikroskopi med nytt metylenblått som jämförelsemetod mot en referens, men beskriver den som subjektiv och relativt oprecis. Flödescytometriska referensmetoder föredras där de finns tillgängliga. En jämförelse från 2022 av 100 prover fann lägre systematisk avvikelse gentemot det använda analysinstrumentet med briljantkresylblått än med nytt metylenblått, enligt PMC-jämförelsen av färgningsmetoder. En välgrundad sammanfattning för studenter är: använd nytt metylenblått som standardiserad manuell jämförelsemetod, verifiera varje lokal metod med briljantkresylblått mot denna eller mot automatiserad analys och räkna med större spridning vid manuell mikroskopi oavsett färgämne. Äldre standardiseringslitteratur förespråkade också renat Azure B som ett kemiskt renare alternativ eftersom kommersiella färgämnessatser varierade, i Marshalls studie om Azure B. Det förklarar varför reagenskvalitet fortfarande diskuteras i metodsammanhang.

Att undvika de vanliga felen

Fyra misstag står för de flesta misslyckade preparaten. Att beställa vanligt metylenblått i stället för nytt metylenblått N ger svag färgning på grund av kemin, inte tekniken. Fixering eller motfärgning före avläsning tar bort den supravitala signalen. Att räkna färgämnesutfällningar som granula ger ett för högt resultat, vilket regeln om två granula och filtrerat färgämne förhindrar. Att räkna för få celler vid låga retikulocytandelar ger ett tal som ser precist ut men har breda konfidensgränser. Varje fel har samma kännetecken: den som mikroskoperar skyller på mikroskopet för något som redan avgjordes i reagenssteget.