Mätning av metylenblåtts mitokondriella effekter: syre, ATP och membranpotential

Anta att ett laboratorium tillsätter metylenblått till mitokondrier med nedsatt respiration och ser syreförbrukningen öka. Den naturliga formuleringen är att färgämnet återställde mitokondriernas funktion. Den meningen kan vara fel. Syreflöde, ATP-syntes och membranpotential är tre skilda begrepp. De hör till samma organell på samma sätt som säkerhetskopiering, synkronisering och delning hör till samma molnmapp: de är besläktade, men styrs av olika regler. Om man förväxlar det ena med det andra faller tolkningen, även när varje mätning är tekniskt korrekt.

Metylenblått gör förväxlingen sannolik eftersom det deltar i det system som mäts. Det är ett ämne som genomgår redoxcykling genom att ta emot elektroner uppströms och avge dem nedströms, en lipofil katjon som ansamlas i energiserade mitokondrier och en starkt blå förening som absorberar och emitterar ljus i samma våglängdsband som vanliga prober. Ett enda mätvärde kan inte bära hela den tolkningsbördan. Det tillförlitliga tillvägagångssättet, som visas i mitokondriestudierna från Budapest, är att mäta syreflöde plus ATP-synteshastighet plus membranpotential plus frisättning av väteperoxid, med färgämnesspecifika kontroller i varje steg.

Respirometri mäter syreflöde, inte energiutbyte

Högupplöst respirometri, oavsett om den utförs med Oroboros Oxygraph eller Seahorse analysator för extracellulära flöden, visar en sak: hur snabbt syre reduceras. Den visar inte hur många protoner som pumpades per elektron, hur mycket av gradienten som bevarades eller om ATP-syntas utnyttjade den.

Terminologin spelar roll. I isolerade mitokondrier ger substrat utan ADP läckagerespiration, substrat med mättande ADP ger kapaciteten för oxidativ fosforylering och titrering med en frikopplare ger maximal elektronöverföringskapacitet. I intakta celler är motsvarigheterna i Seahorse basal respiration, oligomycinkänslig ATP-kopplad respiration, protonläckage, FCCP-definierad maximal respiration och icke-mitokondriell syreförbrukning som är resistent mot rotenon plus antimycin. Att kalla Seahorse-resultaten State 3 och State 4 ger sken av en precision som preparationen inte medger, vilket Agilents ramverk för Mito Stress Test tydliggör.

Metylenblått bryter det intuitiva sambandet mellan mer syre och mer energi. I isolerade mitokondrier från marsvinshjärna ökade 100 nM till 1 uM färgämne syreförbrukningen i vila med glutamat plus malat, succinat och alfa-glycerofosfat som substrat, med ungefär 64 procent ökning för alfa-glycerofosfat. Samtidigt var den ADP-stimulerade respirationen i friska mitokondrier i stort sett oförändrad, enligt studien av isolerade hjärnmitokondrier. Eftersom läckagerespirationen ökade medan det ADP-stimulerade flödet förblev oförändrat sjunker den beräknade respiratoriska kontrollkvoten. Den minskningen betyder inte att färgämnet skadade mitokondrierna. Den betyder att färgämnet lade till en syreförbrukande redoxcykel utöver den normala respirationen. En analys av syreförbrukning med metylenblått som bara redovisar ökningen har mätt verklig kemi men inte sagt något om hur energin bevaras.

Försöken där funktionen återställdes visar samma skillnad i större skala. När komplex I blockerades återhämtade sig syreflödet ungefär trefaldigt, medan ATP-syntesen återhämtade sig endast omkring 1.5-faldigt. Mer syre nådde elektroden. En mindre andel av det bidrog till ATP. Varje påstående om förbättrad oxidativ fosforylering kräver att även ATP-sidan redovisas, helst som en kvot mellan ATP och syre där det anges hur nämnaren definieras.

ATP-analyser mäter synteshastighet, som inte kan ersättas av ATP-innehåll

En ATP-analys besvarar en annan fråga: hur mycket ATP som bildas per tidsenhet. En kinetisk mätning, antingen luminiscens från eldflugeluciferas som följs under flera minuter eller en kopplad analys med hexokinas plus glukos-6-fosfatdehydrogenas som avläses vid 340 nm, ger en hastighet. En enda slutpunktsmätning av totalt ATP ger ett innehåll, som återspeglar syntes minus förbrukning och i sig säger lite om oxidativ fosforylering.

Budapestgruppen använde den kopplade enzymatiska metoden med hämmat adenylatkinas och fann att metylenblått vid 1 till 2 uM ökade ATP-produktionen måttligt men signifikant i rotenonbehandlade och antimycinbehandlade mitokondrier. Det är en verklig, men partiell, återställning. Studien av TEGDMA-toxicitet gav samma typ av resultat i en annan modell: 5 mM av den dentala monomeren TEGDMA sänkte den komplex I-kopplade respirationen från ungefär 286 till 28 flödesenheter, och 2 uM färgämne återställde den till ungefär 86.

Två kontroller är oumbärliga med en färgad redoxförening. Använd först oligomycin för att fastställa hur stor del av den uppmätta ATP-syntesen som beror på ATP-syntas. Utför sedan en cellfri återvinningskontroll med en känd mängd tillsatt ATP plus fullständigt reagens plus exakt de färgämneskoncentrationer som används, minst 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM och 2 uM. Färgämnet kan absorbera emitterat ljus, hämma rapportörenzymet eller förändra reagensets redoxkemi, och allmänna riktlinjer för luciferasanalyser rekommenderar biokemiska motkontroller för just denna typ av interferens. Anta inte att 1 uM är fritt från artefakter bara för att utsläckning vanligtvis är större vid högre koncentrationer.

Membranpotentialprober mäter färgämnesfördelning, inte flöde

Safranin O, TMRM och TMRE, rodamin 123 och JC-1 är alla membranpermeabla katjoner. De ansamlas i den negativt laddade matrixen enligt elektrokemisk jämvikt, så den totala fluorescensen visar potentialen indirekt genom probens fördelning. Ingen av dem mäter ATP eller elektronflöde.

Varje prob passar bäst för en viss preparation. Safranin O lämpar sig för isolerade mitokondrier och permeabiliserade celler, vanligen vid omkring 2 uM med excitation nära 495 nm och emission nära 585 nm, i ett utsläckningsläge där upptaget förändrar den totala fluorescensen. TMRM och TMRE lämpar sig för intakta celler vid inladdning i låga nanomolära koncentrationer utan utsläckning, där depolarisering frigör färgämnet och mitokondriernas fluorescens minskar. Vid hög inladdning kan signalens riktning vändas genom självutsläckning. JC-1 ger en praktisk kvot mellan grönt och rött, men är beroende av inladdning och mitokondriell massa, vilket gör den mindre lämpad för kvantitativt arbete än noggrant kontrollerad TMRM. Dessa avvägningar sammanfattas i en ofta använd översikt över prober för mitokondriell membranpotential.

Metylenblått stör optiskt vid just de koncentrationer som används. Dess absorptionsband nära 600 till 665 nm överlappar röda probers emission, så inre filtereffekter, utsläckning och absorption av excitationsljus är alla möjliga. Färgämnet är dessutom en andra lipofil katjon vars egen fördelning förändras med den potential som mäts. Skyddet är redundanta mätningar plus blankprover: enbart prob, enbart färgämne, prob plus varje färgämneskoncentration, fullständig depolarisering med FCCP som nollreferens och helst en andra, optiskt annorlunda prob. Studien av förbikoppling av komplex III visade detta tillvägagångssätt genom att upprepa mätningen av återställd membranpotential med både safranin O och TMRM efter hämning med antimycin och myxotiazol och få samma kvalitativa återhämtning. En optisk rapportör ger en antydan. Två oberoende rapportörer ger belägg.

Tre preparationer, tre olika frågor

Isolerade mitokondrier, permeabiliserade celler och intakta celler är inte utbytbara känslighetsinställningar i en och samma analys. De är olika angreppssätt med olika funktionsprinciper.

Isolerade mitokondrier bevarar elektrontransportkedjan, det inre membranet och matrixens maskineri, medan plasmamembranet, cytosolen och nätverksarkitekturen avlägsnas. Just detta avlägsnande är poängen: substrat, ADP, hämmare och färgämneskoncentrationer definieras exakt, så att en specifik reaktionsväg kan identifieras. Priset är att den naturliga substrattillförseln, signaleringen och efterfrågan går förlorade.

Permeabiliserade celler behåller mitokondrierna i stora delar av sin cellulära arkitektur, samtidigt som exogena substrat och ADP släpps igenom det öppnade plasmamembranet. De är rätt verktyg för att lokalisera en defekt i en substratberoende reaktionsväg i ett cellulärt sammanhang. Överdriven permeabilisering skadar det yttre membranet, och den cytosoliska regleringen tvättas bort.

Intakta celler bevarar allt: plasmamembranets barriär, cytosoliska reduktionsmedel, endogen substrattransport, det mitokondriella nätverket och ATP-behovet. De ligger närmast fysiologin och längst från mekanismen, eftersom färgämnets upptag, reduktion och inlagring alla påverkar den faktiska exponeringen i mitokondrierna.

TEGDMA-studien använde avsiktligt alla tre nivåer: isolerade hjärnmitokondrier för färgämnets återställning av oxidation och potential, permeabiliserade stamceller från tandpulpa främst för att lokalisera störningen till komplex I-kopplad substratoxidation och intakta stamceller för den fysiologiska nettoeffekten av 2 uM färgämne på hämmad syreförbrukning. För läsare som jämför mitokondriella mätresultat mellan preparationer ger den tillhörande förklarande artikeln om hur metylenblått förflyttar elektroner genom andningskedjan bakgrunden till reaktionsvägarna, medan guiden till att läsa respirationsstudier med metylenblått behandlar resonemangen bakom koncentrationsval och hämmare.

Kontroller som ett redoxaktivt färgämne kräver

Ett ämne som genomgår redoxcykling behöver en längre kontrollista än en vanlig hämmare, eftersom färgämnets egen kemi kan efterlikna biologi.

För respirometri behövs en kammare med enbart buffert för att mäta drift, en kammare med buffert plus färgämne utan biologiskt material, färgämne plus varje extracellulärt reduktionsmedel som ingår i analysen och slutligen rotenon plus antimycin för att definiera icke-mitokondriell syreförbrukning i intakta celler. Observera att reducerat färgämne återoxideras genom att överföra elektroner till syre och bilda väteperoxid. Ett blankprov med enbart färgämne utan elektrondonator underskattar därför den cellfria syreförbrukning som uppstår när NADH eller NADPH finns tillgängligt.

För väteperoxid bör kalibrerad Amplex UltraRed plus pepparrotsperoxidas föredras framför icke-selektiva DCFDA-färgämnen. Verifiera med katalas och testa beroendet av belysning, eftersom färgämnet är en fotosensibilisator. Studien av hjärnmitokondrier fann att peroxidbelastningen ökade mer än fyrfaldigt redan vid 100 nM färgämne samtidigt som elimineringen blev långsammare, och att peroxid bildades direkt av reducerat färgämne utan superoxid som mellanprodukt. Detaljer om probval och ljuskontroller behandlas i den tillhörande artikeln om mätning av reaktiva syreföreningar i färgämnesförsök. Den bredare frågan om när peroxid fungerar som signal respektive belastning behandlas tillsammans med cellulär redoxbalans och påståenden om antioxidanter.

För påståenden om reaktionsvägar bör båda bindningsställena för komplex III-hämmare testas: antimycin A vid Qi-stället och myxotiazol vid Qo-stället, plus en slutpunkt för komplex IV med cyanid. En tidigare studie av mushjärna rapporterade att färgämnet återställde rotenonblockerad men inte antimycinblockerad respiration, medan den senare studien av tre arter fann partiell återställning med båda hämmarna och belägg för direkt reduktion av cytokrom c. Betrakta förbikopplingen som förenlig med de nyare resultaten snarare än fastställd, eftersom färgämneskoncentration, hämmarens bindningsställe, substratförhållanden och färgämnesfördelning alla påverkar den observerade vägen.

Matris för val av analys

Använd den här tabellen för att välja mätning utifrån frågan, inte tvärtom.

Ett minimikrav för ett övertygande påstående är att samma färgämneskoncentrationer, 100 nM, 300 nM, 1 uM och 2 uM, används för mätning av syreflöde under läckage-, ADP-, oligomycin- och frikopplarförhållanden, ATP-synteshastighet, membranpotential med helst två prober samt kalibrerad peroxidfrisättning med katalas och cellfria kontroller. Redovisa hela den sammanhängande uppsättningen: syreflöde plus ATP-hastighet plus ATP per syre plus potential plus peroxid. Var och en av dessa siffror är ensam en mätning som söker sin betydelse.